Summary
Voici une nouvelle région d'intérêt protocole d'analyse basée sur le tri des ellipses meilleur ajustement attribués aux régions de signal positif dans le temps à deux dimensions image laps séquences est démontrée. Cet algorithme peut permettre aux enquêteurs d'analyser de manière approfondie les signaux physiologiques + Ca 2 avec entrée minimale de l'utilisateur et de partialité.
Abstract
Ca 2 + intracellulaire signaux sont couramment étudiées avec des colorants fluorescents de Ca2 + de l'indicateur et les techniques de microscopie. Cependant, l'analyse quantitative de Ca 2 + de données d'imagerie prend du temps et soumis à polarisation. Automatisés algorithmes d'analyse de signal selon la région d'intérêt (ROI) de détection ont été mises en œuvre pour les mesures de balayage de ligne unidimensionnelle, mais il n'y a pas de courant algorithme qui intègre l'identification optimisé et l'analyse de ROI dans des séquences d'images en deux dimensions. Voici un algorithme pour l'acquisition rapide et l'analyse de ROI dans des séquences d'images est décrit. Il utilise des ellipses correspondent aux signaux filtrés de bruit afin de déterminer le placement de ROI optimal, et calcule Ca 2 + paramètres de signal d'amplitude, la durée et la diffusion spatiale. Cet algorithme a été mis en œuvre comme un plug-in disponible gratuitement pour ImageJ (NIH) des logiciels. Avec son analyse écrites pour le open source logiciel de traitement statistique R,cette approche fournit un gazoduc à haute capacité pour l'analyse statistique rapide de la production expérimentale. Les auteurs suggèrent que l'utilisation de ce protocole d'analyse conduira à une caractérisation plus complète et impartiale de signalisation physiologique + Ca 2.
Introduction
Ca 2 + est un second messager ubiquitaire molécule de signalisation et de Ca 2 + cytosolique niveaux sont très réglementés. Ca 2 + intracellulaire signaux sont complexes et comprennent transitoires isolés, oscillations, et la propagation d'ondes 1 - 4. Contrôle spatial et temporel de Ca 2 + est pensé à la base physiologique spécificité du signal, et donc l'analyse de Ca 2 + modèles de signaux est d'un intérêt considérable pour les chercheurs dans de multiples domaines 5.
Colorants Ca 2 + d'indicateurs tels que le Fluo-4 et Fura-2 sont couramment utilisés pour mesurer Ca 2 + signaux intracellulaires avec la microscopie à fluorescence 5-12. Typiquement, Ca 2 + signaux temporels sont évalués comme des changements en fonction du temps de fluorescence moyenne dans une zone définie par l'utilisateur, ou de la région d'intérêt (ROI) 5,6,13 - 16. Actuellement, l'analyse manuelle de ROI est à la fois beaucoup de temps et de travail danstensive, car il oblige les utilisateurs à identifier de nombreux ROI et effectuer des calculs répétitifs 17-19. Ces techniques peuvent également faire l'objet d'une erreur d'utilisation considérable, y compris l'introduction de modes de signaux artificiels et l'exclusion de faible amplitude ou signaux diffus 18,20.
Des algorithmes de détection de ROI automatisés ont déjà été mises en œuvre en utilisant une variété de méthodes statistiques pour déterminer le placement de ROI optimal, mais ils ont généralement été limitée à l'analyse de balayage de ligne ou pseudo-ligne des images numérisées, ce qui limite l'analyse à une seule dimension spatiale dans le temps 17, 19-22. En outre, de nombreux algorithmes existants ne sont pas suffisants pour couvrir la diversité de Ca 2 + des événements de relâchement qui vont de périodiques, transitoires localisées à des ondes se propageant 23,24. Évaluation complète de Ca 2 + signaux physiologiques est souvent compliquée par la présence d'image significative artifLoi qui confond signal discrimination de bruit dans de nombreux systèmes expérimentaux.
Auparavant, une solution de l'algorithme de détection de ROI automatisé de Ca 2 + signal de détection de transitoires, mis en œuvre sous forme de plugin pour le logiciel NIH ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD), a été développé et validé 25,26. Cet algorithme, appelé LC_Pro, a été conçu pour identifier et analyser ROI englobant Ca 2 + transitoires du signal en deux dimensions laps de temps des séquences d'images. Voici un protocole expérimental pratique et de démonstration représentant d'une application de l'algorithme dans porcine endothélium des artères coronaires est fourni, avec post-traitement supplémentaire utilisant l'open source logiciel de traitement statistique R pour générer une sortie graphique utilisable.
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Protocol
1. Dissection du navire et de l'imagerie
- tissu de récolte de porcs domestiques mineurs comme décrit dans Martens et al 27. Placez ventricules droit porc récoltés dans un polydiméthylsiloxane (PDMS) plat de dissection fond contenant HEPES solution saline tamponnée physiologique (PSS).
- A l'aide d'un stéréomicroscope, disséquer et enlever une partie de la descendante antérieure gauche Artère coronaire (~ de longueur 8 mm, diamètre 0,5 mm) dans les tissus adjacents à l'aide des pinces et des ciseaux à ressort en enlevant le segment de vaisseau à partir des couches de tissu cardiaque environnantes. REMARQUE: Prenez soin de ne pas percer la paroi du vaisseau.
- Placez un bloc de PDMS (1 x 0,5 x 0,5 cm) dans le plat de dissection, et utiliser une aiguille à la broche au fond. Couper un fil de tungstène d'environ 40 um de diamètre en douze segments ~ 0,3 cm de longueur, formant micropointes, et placez-les dans le plat. En utilisant des pinces, fixer une extrémité du segment de vaisseau de la séquence ayant une Micropin.
- Insérez délicatement petits ciseaux à ressort dans la lumière du vaisseau, et couper longitudinalement sur un côté du navire pour l'ouvrir complètement. Orientez le segment de vaisseau ouvert avec l'endothélium haut.
- Utilisez les micropointes restant à sécuriser les frontières du segment de vaisseau ouvert pour bloquer telle que le navire constitue un rectangle plat. NOTE: les dessus de Micropin doivent être pliés à 90 ° et jusqu'à insérés en affleurement avec la surface du bloc. Il faut prendre soin d'étirer la préparation du navire sans surexploiter; largeur finale devrait être ~ 1,5 x la largeur non étirée de départ.
- Préparer un petit volume (environ 1 ml) de Fluo-4 solution AM de chargement par le mélange Fluo-4 AM (10 uM) dissoute dans du DMSO avec Pluronic (0,03%) dans un tampon HEPES tamponné PSS (contenant en mM: 134 NaCl, 6 KCl , une MgCl, 10 HEPES, 10 glucose), et insérer le bloc entier dans la solution de charge pendant environ 40 min à température ambiante dans l'obscurité.
- Après le chargement, laver le bloc dans tamponnée HEPESPSS pendant 5-10 min.
- Monter le bloc sur 50-100 um entretoises d'épaisseur dans une chambre inférieure lamelle contenant tamponnée HEPES PSS. NOTE: les repères de métal peuvent être utilisées comme entretoises et assurent le segment de vaisseau est orientée vers le bas et ne se touchant pas les éléments d'espacement.
- Placer la chambre sur la platine d'un microscope inversé équipé pour l'imagerie confocale, et se concentrer sur la couche de cellules endothéliales.
- image laps de temps de capture des séquences de fluorescence relative de base pour ~ 3 min à un grossissement de 20x et un taux de ~ 8 images par seconde en utilisant le logiciel séquence d'aquisition d'image confocale de cadre.
- Après ~ 3 min d'enregistrement fluorescence basale, remplacer une solution tamponnée HEPES PSS avec le même volume (~ 1 ml) de substance P (100 pM) dissous dans tamponnée HEPES PSS, et record pour une addtional 3 min.
2. Analyse automatique
- Rendre séquence (s) de l'image de l'activité du calcium fluorescent à partir du logiciel d'acquisition en tant que confocal à 8 bits, grayscale fichiers «. tif" format avec aucune information à grande échelle.
- Ouvrir ImageJ, cliquez sur 'Ouvrir' dans le menu Fichier, puis sélectionnez la séquence d'image approprié dans la fenêtre de l'explorateur pour voir la séquence (s) de l'image dans ImageJ.
- Déterminer un diamètre approprié de la ROI à l'aide de l'outil de ROI rectangulaire pour estimer des limites supérieure et inférieure de la propagation spatiale de l'activité à l'intérieur de la séquence (s) d'image. REMARQUE: Le diamètre moyen rectangulaire est un choix approprié pour un diamètre de ROI.
- Créez un nouveau dossier sur le disque dur de l'ordinateur, et ajouter la séquence (s) de l'image dans le répertoire du dossier.
- Dans ImageJ, cliquez sur la fenêtre 'plugins, puis cliquez sur «LC_Pro' pour lancer l'analyse.
- Entrez la valeur de retour sur investissement de diamètre et sélectionner la valeur de seuil de filtration (soit 0,05 ou 0,01).
- Cliquez sur la case «traitement de la toxicomanie» et entrez les valeurs des points de temps immédiatement avant et après la drogue a été ajouté (en secondes).
- Cliquez sur «OK», etentrer dans le répertoire de séquences d'images dans la fenêtre explorateur de fichiers.
3. Sortie graphique
- Télécharger la version 3.0.2 de R http://www.r-project.org/ .
- Ouvrez la version 32 bits de R.
- Cliquez sur "Fichier", puis "scénario ouvert» et sélectionnez le script 'traceplot.R' R pour générer des rapports graphiques expérimentales.
- Installez le calibrage, et des paquets de gplots en sélectionnant «paquets», «installer des paquets», et en sélectionnant les paquets justificative utile.
- Cliquez sur «Fichier», puis «répertoire de changement» de commande, et utiliser la fenêtre de l'explorateur pour sélectionner le répertoire qui correspond à la sortie de l'analyse LC_Pro.
- Cliquez sur la fenêtre de script, puis le 'exécuter tous »commande pour exécuter le script.
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Representative Results
Un algorithme personnalisé, LC_Pro, a été développé et mis en œuvre afin d'effectuer une analyse automatisée de Ca 2 + dynamique sur des séquences d'images confocale. Comme le montre la figure 1, l'algorithme utilise des modules de traitement séquentiel que A) détecte et sites piste de dynamique Ca 2 + changer dessus statistique (p <0,01) bruit, B) définir des régions d'intérêt (ROI) automatiquement dans les centres de site actif, et C) calculer l'intensité de fluorescence moyenne au ROI pour déterminer les paramètres d'événements spécifiques. Un aperçu graphique de l'algorithme est montré en utilisant des impulsions générées par ordinateur de Gauss d'intensité et de position connue (figure 2). impulsions de signal (Figures 2A et B) ont été converties en binaire utilisant le z-score pour une distribution normale, et ellipses meilleur ajustement ont été affectés à des loci de pixel-dessus du seuil de signal (figure 2C). Un algorithme de tri de l'ellipse a été utilisé pour déterne optimale placement de ROI (figure 2D). ROI intensité moyenne en fonction du temps a ensuite été mesurée et les paramètres du signal d'amplitude, la durée et la propagation spatiale ont été calculées (figure 2E). Cette méthode d'analyse a été appliquée pour évaluer Ca 2 + cellulaire dynamique dans l'endothélium vasculaire intact. Plus précisément, l'imagerie confocale a été réalisée dans les artères coronaires de porcs ouverts tels que décrits sur la figure 3, et l'algorithme a été utilisé pour quantifier déconnecté Ca 2 + paramètres distincts. Pour ces expériences, des enregistrements continus ont été effectués avant et après l'addition de la stimulation de l'endothélium, la substance P (SP; 100 pM), et l'analyse LC_Pro a été ensuite effectuée. Pour le nettoyage signal dans chaque ROI, les lignes de base ont été calculés comme des régressions linéaires de l'intensité du ROI au cours du temps expérimental (figure 4). Les valeurs moyennes d'intensité de signal ont été calculés pour chaque ROI (figure 4A), et les valeurs supérieures à la moyenne ont été trunc és à la moyenne et une régression linéaire a été effectuée pour approximer le signal de référence (Figure 4B). Enfin, les valeurs d'intensité brutes ont été divisées par la valeur de la ligne de régression pour convertir des valeurs de plier le changement par rapport au départ (Figure 4C). Figure 5 montre une expérience représentative, y compris des images de Ca 2 + fluorescence dépendante de l'endothélium (figure 5A), accumuler des masques binaires de Ca 2 + signal total détecté dans le domaine échantillonné (figure 5B), et des enregistrements de fluorescence moyenne à chaque ROI (figure 5C) avant et après le traitement de SP. Analyse du paramètre ultérieure a été effectuée en utilisant un logiciel de R. Histogrammes résultant montrent l'effet d'amplification de la SP sur l'événement amplitude, la durée et la propagation spatiale (Figure 6).
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Figure 1. Signal flux graphiques des processus de l'algorithme (ce chiffre a été obtenu avec la permission de Francis et al.) 24. L'algorithme a été organisé en trois sections: le traitement de l'image, le traitement de l'événement, et la région d'intérêt (ROI) de traitement. Les séquences d'images sont entrées dans la chaîne de flux, et les statistiques d'événements sont générés en sortie finale. Le sous-programme de traitement d'image (A) de l'algorithme convertit la séquence d'images d'entrée dans la liste des ellipses meilleur ajustement par un seuil, en utilisant le z-score pour une distribution normale et l'analyse de particules ImageJ. le traitement de l'événement (B) est un sous-programme de tri utilisé pour déterminer la position de ROI optimal en organisant des lieux de l'ellipse dans l'événement "sites" de temps. Après signifient mesures d'intensité sont prises à chaque ROI, paramètres statistiques pour chaque événement et le site sont calculés par le sous-programme de traitement de ROI (C </ Strong>) pour générer la sortie finale. BKGD, arrière-plan; AVG, moyenne. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Démonstration de l'acquisition de ROI automatisé et de détection de signal en utilisant une impulsion gaussienne générée par ordinateur (ce chiffre a été adapté avec la permission de Francis et al.) 24. Une impulsion de signal générée par ordinateur unique (A) a été noyé dans le bruit de fond aléatoire. La séquence d'images d'échelle de gris a été filtré pour éliminer les valeurs de pixel d'arrière-plan statique (B) et converti en binaire à l'aide des valeurs d'intensité de pixels de seuil P <0,05 calculé par le score normalisé (C). ImageJ analyse de particules algorithmiquems ont ensuite été appliquées à la séquence d'images pour attribuer des ellipses de meilleur ajustement à l'intérieur de chaque pixel loci trame. Un nouvel algorithme a été utilisé pour les ellipses de groupe dans des "événements" temporelles discrètes et de déterminer la position optimale pour chaque ROI sur la base du centre ellipse moyen (D). Un retour sur investissement de rayon défini par l'utilisateur est alors placé à chaque position (cercle en pointillés). Les valeurs moyennes d'intensité au sein d'un retour sur investissement sont calculés pour chaque trame et mises à l'échelle en utilisant une approximation de base linéaire. Amplitude pic est identifié comme maxima locaux ci-dessus P <0,05 tel que défini par le score standard pour un suivi du retour sur investissement correspondant (e). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Porci ne artère coronaire protocole de dissection. Branches d'environ 0,5 mm de diamètre x 8 mm de longueur de l'artère interventriculaire antérieure coronaire (1ere image, cercle en pointillés) ont été disséqués du myocarde environnant. segments de navires ont été débarrassés de tissu environnant adventice et coupés en longueur avec de petits ciseaux (2ème image). Ensuite, les vaisseaux ouverts ont été épinglés plat à un bloc de PDMS en utilisant des fils de tungstène fines (3ème image). Segments de vaisseaux montés ont été chargées avec Fluo-4 Ca 2 + colorant indicateur, lavées, puis placés dans une chambre d'imagerie à fond lamelle. Les images ont été recueillies à un grossissement de 20x (488 ex., 510 em.) À 8,0 images par seconde à l'aide d'un microscope confocal inversé. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 4. ROI intensité moyenne rapprochement de base. Suite à l'intensité moyenne par rapport à des mesures de temps (lignes continues) pour chaque ROI, les premières valeurs d'intensité sont mises à l'échelle à f/f0 en utilisant la méthode d'approximation de référence suivante. L'intensité moyenne du signal (ligne en pointillés) au cours de la période de commande est calculée à partir de contrôle défini par l'utilisateur et de valeurs d'intervalles de traitement (A). La courbe d'intensité de signal en fonction du temps est ensuite tronqué au-dessus de l'intensité de commande de moyen de l'intensité de commande de moyen pour filtrer l'activité de rapprochement de base, et une régression linéaire est effectuée sur la courbe résultante (lignes pointillées) (B). Enfin, les valeurs d'intensité premières sont réduites à la ligne de base linéaire calculée (C). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Résultats représentatifs de l'analyse LC_Pro de basale et stimulée Ca 2 + dynamique. Heure images de déchéance d'une séquence d'images d'entrée d'un intervalle d'échantillonnage de base (A, panneau de gauche), suivie par un intervalle d'échantillonnage de P stimulée par la substance (A, panneau de droite ) sont indiqués en échelle de gris. Laps de temps des séquences d'images de meilleures ellipses ajustement pour basale et stimulée intervalles (B) ont été rendus par LC_pro. Enfin, les courbes d'intensité en fonction du temps mis à l'échelle de chaque région positionné automatiquement d'intérêt (ROI) sont présentés (C).
Figure 6. Histogrammesde paramètres distributions provenant d'une expérience représentative (Figure 4). Histogrammes de paramètres d'amplitude crête (f/f0), la durée de ½ max (s), et la propagation spatiale maximale (pm 2) à la fois pour le contrôle (colonne de gauche) et la substance P stimulée (colonne de droite) les événements d'une expérience représentative sont rendu à l'aide R pour traiter graphiquement la sortie de LC_pro. Notamment, la stimulation de la substance P a augmenté le nombre d'événements, et a provoqué un décalage à droite significative de l'amplitude et la durée médiane de Mann-Whitney U test (p <0,01).
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Discussion
Décodage Ca 2 + signaux complexes au niveau cellulaire et multicellulaire nécessitera des approches expérimentales et analytiques rigoureux. Ici, une approche est décrite dans laquelle résolus séquences d'images confocale de Ca 2 + fluorescence dépendante sont soumis à une analyse automatisée qui identifie et quantifie Ca 2 + signaux statistiquement pertinentes dans les domaines cellulaires intactes Dans le cas spécifique présentés, un segment d'artère a été isolé de coeur de porc, épinglé ouvert pour exposer l'endothélium, chargé avec le Ca 2 + indicateur Fluo-4 AM, soumis à l'imagerie confocale, et évaluées avec l'algorithme personnalisé LC_Pro. Cet algorithme est conçu pour 1) de détecter et de sites de piste de dynamique Ca 2 + changement ci-dessus statistique (p <0,01) bruit, 2) définir des régions d'intérêt (ROI) automatiquement dans les centres de site actif, et 3) analyser l'intensité de fluorescence moyenne au ROI pour déterminer les paramètres d'événements spécifiques. L'approchesurmonte les principaux obstacles à la recherche de la signalisation biologique, en réduisant les erreurs de l'utilisateur et de partialité, ce qui réduit considérablement le temps hors ligne d'analyse, et de fournir un index complet des signaux à travers un champ de discerner des profils ou des motifs représentatifs. Sortie de LC_Pro est en outre traitée par son R, fournir des rapports de paramètres complets pour les expériences individuelles, y compris la sortie graphique de haute qualité.
Plusieurs étapes sont importantes à la bonne exécution de la technique décrite. La procédure de dissection de tissu (étape 1.1.1) doit être réalisée avec soin afin d'éviter des dommages ou une dénudation de la couche de cellules endothéliales. En outre, des séquences d'images doivent être dans le format approprié (étape 2.1) pour la région de l'algorithme automatisé d'intérêt pour fonctionner correctement. Par exemple, si il ya des informations échelle associé au fichier, les régions d'intérêt seront mal placés selon les emplacements de pixels, plutôt que les emplacements des unités à l'échelle. En outre, le choix d'un re convenablegion de diamètre d'intérêt est critique pour l'exécution correcte de l'analyse automatisée de l'activité fluorescente dans une séquence d'images. Une valeur trop faible diamètre peut entraîner des mesures redondantes, alors un diamètre trop important entraînera l'exclusion de signaux subtils.
Pièges potentiels de cette technique se rapportent principalement à la sensibilité de l'analyse automatisée de xy changements dans les séquences d'images enregistrées et pour signaler la saturation et / ou décoloration, ce qui peut entraîner des résultats faussement positifs ou faussement négatifs. Dérives ou les changements dimensionnels peuvent être adressées directement par l'utilisation de logiciels d'enregistrement de la pile et la désignation précise des intervalles où les perturbations sont introduites. Niveaux de gris et les paramètres de retour sur investissement de diamètre peuvent également être optimisés pour une préparation donnée à l'avance de la collecte de données afin de normaliser les ensembles de données brutes.
Car il sert une approche standard pour n'importe quel signal de fluorescence dynamique, l'analyse décrit here est adapté pour un corps éventail d'applications. Dans le système vasculaire, ce procédé est employé pour définir les caractéristiques physiologiques et physiopathologiques modalités de signaux dans de multiples lits vasculaires de moins basale et stimulée conditions 25,26. Il est également appliquée dans le suivi automatisé de Ca 2 + ondes. En fin de compte, comme l'analyse automatisée mondiale sera un pilier essentiel à déchiffrer spatialement et temporellement bio-signaux complexes et dans la création de nouvelles cellules et les modèles multi-cellulaires.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été financé en partie par les Instituts nationaux de subventions à la santé HL-085887, HL-092992, S10RR027535, et MOP-93676.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection dish | Fisher Sci | #08-772-70 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Fisher Sci | #NC9644388 | elastomer kit, must be molded into dishes |
| HEPES-buffered PSS | Sigma | #H3375-250G | HEPES acid |
| Stereomicroscope | Nikon Inst. | #MNA42000 | |
| Forceps | Fine Science Tools | #11223-20 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Tungsten wire | Scientific Inst Svcs | #406 | |
| Fluo-4 AM | Life Tech. | #F-14201 | |
| Pluronic F-127 | Life Tech. | #P3000MP | |
| Metal pins | Fine Science Tools | #26002-10 | |
| Cover-glass bottom chamber | Custom designed | ||
| Spinning disc confocal microscope | Perkin Elmer | RS-3 | |
| ImageJ software | download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html | ||
| LC_Pro plugin for imageJ | download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html | ||
| R software | download at: http://www.r-project.org/ | ||
| R traceplot script | download at: https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing |
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