Summary
Her er en roman region af interesse analyse protokol baseret på sortering bedst-fit ellipser tildelt regionerne positivt signal inden for to-dimensionelle tidsforskydningen billedsekvenser demonstreres. Denne algoritme kan gøre det muligt efterforskerne at omfattende analysere fysiologiske Ca 2 +-signaler med minimal bruger input og bias.
Abstract
Intracellulære Ca 2 +-signaler er almindeligt undersøgt med fluorescerende Ca2 + indikatorfarvestoffer og mikroskopi teknikker. Men kvantitativ analyse af Ca 2 + billeddannelse data er tidskrævende og underlagt bias. Automatiserede signal analyse algoritmer baseret på region af interesse (ROI) detektion er blevet implementeret for endimensional line scan-målinger, men der er ingen aktuelle algoritme, der integrerer optimeret identifikation og analyse af ROIs i to-dimensionelle billede sekvenser. Her beskrives en algoritme til hurtig indsamling og analyse af ROIs i billedsekvenser. Det udnytter ellipser passer til støj filtrerede signaler for at bestemme placeringen optimal ROI og beregner Ca 2 + signal parametre for amplitude, varighed og rumlig spredning. Denne algoritme blev gennemført som et frit tilgængeligt plugin til ImageJ (NIH) software. Sammen med analyse scripts skrevet til open source statistisk bearbejdning software R,Denne fremgangsmåde giver en høj kapacitet pipeline for at udføre hurtig statistisk analyse af eksperimentelle output. Forfatterne foreslår, at anvendelse af denne analyse protokol vil føre til en mere fuldstændig og objektiv karakterisering af fysiologisk Ca 2 +-signalering.
Introduction
Ca2 + er en allestedsnærværende anden messenger signalmolekyle og cytosoliske Ca2 +-niveauer er meget reguleret. Intracellulære Ca 2 +-signaler er komplekse og omfatter isolerede transienter svingninger, og plantemateriale bølger 1 - 4. Rumlig og tidsmæssig kontrol af Ca 2 + menes at ligge til grund fysiologisk signal specificitet og dermed analysen af Ca 2 + signalmønstre er af betydelig interesse for efterforskere i flere felter 5.
Ca2 + indikatorfarvestoffer såsom Fluo-4 og Fura-2, der almindeligvis anvendes til at måle intracellulære Ca 2 +-signaler med fluorescensmikroskopi 5-12. Typisk er timelige Ca 2 + signaler evalueret som tidsafhængige ændringer i den gennemsnitlige fluorescens inden for en brugerdefineret område eller region af interesse (ROI) 5,6,13 - 16. I øjeblikket analyse manuel ROI er både tidskrævende og arbejdskraft itensiv fordi det kræver, at brugerne til at identificere mange ROI'er og udføre gentagne beregninger 17-19. Disse teknikker kan også være forbundet med en betydelig bruger fejl, herunder indførelse af kunstige signal modes og udelukkelse af lav amplitude eller diffuse signaler 18,20.
Automatiserede ROI detekteringsalgoritmer er tidligere blevet gennemført ved anvendelse af forskellige statistiske metoder til at bestemme placeringen optimal ROI, men de har generelt været begrænset til analyse af liniescanning eller pseudo-line scan billeder, hvilket begrænser analysen til en enkelt rumlig dimension i tiden 17 19-22. Derudover har mange eksisterende algoritmer ikke er tilstrækkelige til at omfatte mangfoldigheden af Ca 2 release arrangementer +, der spænder fra periodiske, lokaliserede transienter til formerings bølger 23,24. Omfattende evaluering af fysiologiske Ca 2 +-signaler er ofte kompliceres yderligere af tilstedeværelsen af betydelige billede Artifhandle der forvirrer signal til diskrimination støj i mange eksperimentelle systemer.
Tidligere en automatiseret påvisning ROI algoritme løsning på Ca 2 + signal forbigående afsløring, implementeret som et plugin til NIH ImageJ software (National Institutes of Health, Bethesda, MD), blev udviklet og valideret 25,26. Denne algoritme, kaldet LC_Pro, blev designet til at identificere og analysere ROIs omfatter Ca 2 + signal transienter i to-dimensionelle tidsudløbsdata billedsekvenser. Her er en praktisk forsøgsprotokol og repræsentativ demonstration af en ansøgning af algoritmen i svine kranspulsåren endotel er forudsat, med ekstra efterbehandlingen ved hjælp af open source statistisk bearbejdning software R til at generere brugbare grafiske output.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Vessel Dissektion og Imaging
- Høst væv fra indenlandske juvenile grise som beskrevet i Martens et al 27. Placer høstet svin højre ventrikler i en polydimethylsiloxan (PDMS) bund dissektion skål indeholdende HEPES bufferet fysiologisk saltopløsning (PSS).
- Ved hjælp af et stereomikroskop, dissekere og fjerne et segment af venstre forreste nedadgående kranspulsåre (~ 8 mm længde, 0,5 mm i diameter) fra det omgivende væv ved hjælp af pincet og foråret saks ved at fjerne karsegment fra de omgivende hjertevæv lag. BEMÆRK: Pas på ikke at punktere karvæggen.
- Anbring en PDMS blok (1 x 0,5 x 0,5 cm) i dissektion skålen, og anvende en kanyle til pin den til bunden. Skær en ca 40 um wolfram tråd diameter i tolv ~ 0,3 cm lange stykker, der danner micropins, og placere dem i skålen. Ved hjælp af pincet fastgøre den ene ende af karsegment til blok med en micropin.
- Sæt forsigtigt lille fjeder saks i karhulrummet, og skære på langs ned den ene side af skibet for at åbne det helt. Vend åbnede fartøj segmentet med endotel op.
- Brug de resterende micropins at sikre grænserne for den åbnede karsegment at blokere sådan at fartøjet danner en flad rektangel. BEMÆRK: Micropin toppe kan bøjes 90 ° og indsat indtil flugter med blokoverfladen. Der bør udvises omhu for at strække forberedelse fartøjet uden overstretching; endelige bredde skal ~ 1,5 x start ustrakt bredde.
- Forbered et lille volumen (~ 1 ml) af Fluo-4:00 loading opløsning ved at blande Fluo-4 AM (10 uM) opløst i DMSO med pluronic (0,03%) i en HEPES bufferopløsning PSS (indeholdende i mM: 134 NaCl, 6 KCI , 1 MgCI, 10 HEPES, 10 glukose), og indsæt hele blokken i lastning løsning for cirka 40 minutter ved stuetemperatur i mørke.
- Efter læsning, vask blokken i HEPES bufferPSS i 5-10 min.
- Monter blok på 50-100 um tyk afstandsstykker i et dækglas bund kammer indeholdende HEPES bufferet PSS. BEMÆRK: Metalben kan bruges som afstandsstykker og sikre karsegment vender nedad, og rører ikke afstandsstykker.
- Placer kammeret på scenen af et inverteret mikroskop udstyret til konfokal billedbehandling, og fokusere på endothelcellelaget.
- Capture time lapse billedsekvenser af basal relative fluorescens for ~ 3 min på 20X forstørrelse og en frame rate på ~ 8 frames per sekund ved hjælp af konfokal billede sekvens optagelseslaget software.
- Efter ~ 3 min optage basal fluorescens, erstatte HEPES bufferet PSS løsning med det samme volumen (~ 1 ml) af substans P (100 pM) opløst i HEPES bufferet PSS, og rekord for et indsættes en yderligere 3 min.
2.. Automatiseret analyse
- Render billede sekvens (r) af fluorescerende calcium aktivitet fra konfokal erhvervelse software som 8 bit, grayscale '. tif' format filer uden skala information.
- Åbent ImageJ, klik 'åben' i menuen Filer, og vælg den relevante billedsekvens i explorer vinduet for at se billedet sekvens (r) i ImageJ.
- Bestem en diameter passende investeringsafkast ved hjælp af rektangulære ROI værktøj til at estimere de øvre og nedre grænser for den rumlige spredning af aktivitet i billedet sekvens (r). BEMÆRK: Den gennemsnitlige rektangulære diameter er et passende valg for diameter ROI.
- Opret en ny mappe på computerens harddisk, og tilføje billedet sekvens (er) i mappen bibliotek.
- I ImageJ, klik på 'plugins' vindue, og klik derefter på 'LC_Pro' for at starte analysen.
- Indtast diameter værdi ROI og vælg filteret tærskelværdien (enten 0,05 eller 0,01).
- Klik på afkrydsningsfeltet 'narkotikabehandling «og indtast tidspunktet point-værdier umiddelbart før og efter lægemidlet blev tilsat (i sekunder).
- Klik på 'ok', ogindtaste billedets sekvens biblioteket i Stifinder-vinduet.
3.. Grafisk Output
- Hent R-version 3.0.2 fra http://www.r-project.org/ .
- Åbn 32 bit version af R.
- Klik på "fil", derefter "åben script 'og vælg' traceplot.R" R script til at generere grafiske eksperimentelle rapporter.
- Installer kalibrere, og gplots pakker ved at vælge 'pakker', 'installere pakker', og vælge appropirate pakker.
- Klik på 'fil', derefter 'forandring mappe' kommando og bruge explorer vinduet for at vælge den mappe, der svarer til LC_Pro analyse output.
- Klik på manuskriptet vinduet og derefter kommandoen 'Kør alle' for at køre scriptet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En brugerdefineret algoritme, LC_Pro, blev udviklet og implementeret for at udføre automatiseret analyse af Ca 2 + dynamik på konfokal billedsekvenser. Som vist i figur 1, algoritmen anvender sekventielle behandling moduler, A) registrere og spore sites dynamisk Ca 2 + skifte over statistisk (p <0,01) støj, B) fastlægge områder af interesse (ROI) automatisk ved aktivt sted centre, og C) beregne gennemsnitlige fluorescensintensiteter på ROIs at fastlægge specifikke event parametre. En grafisk oversigt af algoritmen er vist ved hjælp af edb genererede Gaussian pulser af kendt intensitet og placering (figur 2). Signalpulser (figur 2A og B) blev konverteret til binær hjælp af z-score for en standard normalfordeling, og bedst-fit ellipser blev tildelt pixel loci over signal tærskel (figur 2C). En ellipse sorteringsalgoritme blev anvendt til at fastlægne optimal placering ROI (Figur 2D). ROI betyder intensitet versus tid blev derefter målt og signal parametre for amplitude, varighed og rumlig spredning blev beregnet (Figur 2E). Denne analyse tilgang blev anvendt til at vurdere cellulær Ca2 + dynamik i intakt vaskulær endotel. Specifikt blev konfokal billeddannelse udført i åbnet svin kranspulsårerne som beskrevet i figur 3, og algoritmen blev anvendt offline at kvantificere forskellige Ca 2 +-parametre. Til disse eksperimenter blev kontinuerlige optagelser foretaget før og efter tilsætning af endotel stimulus, substans P (SP, 100 pM) og LC_Pro analyse blev efterfølgende udført. For skalering signal inden for hver ROI blev basislinjer afledt som lineære regressionsanalyse af ROI intensitet end den eksperimentelle tidsforløb (Figur 4). Mean signalintensitet værdier blev beregnet for hver ROI (figur 4A), og værdier over middelværdien var trunc ated til middelværdien og en lineær regression blev udført for at tilnærme signal baseline (figur 4B). 5 viser et repræsentativt eksperiment, herunder billeder af Ca 2 + afhængig fluorescens i endotelet (figur 5A) Endelig blev det rå intensitetsværdier divideret med værdien af regressionslinjen at konvertere værdier fold ændring i forhold til baseline (figur 4C). Figur, akkumulere binære masker af total Ca 2 + signal detekteres inden for stikprøven felt (figur 5B), og optagelser af gennemsnitlig fluorescens ved hver ROI (figur 5C) før og efter SP behandling. Efterfølgende-analyse blev udført under anvendelse af R-software. Resulterende histogrammer viser forstærkende effekt af SP om begivenhed amplitude, varighed og rumlige udbredelse (figur 6).
560/51560fig1highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 1.. Signal flow diagrammer af algoritme processer (dette tal blev opnået med tilladelse fra Francis et al.) 24. Algoritmen blev organiseret i tre sektioner: Billedbehandling, begivenhed behandling og region af interesse (ROI) forarbejdning. Billedsekvenser er input i strømmen kæde, og statistik event genereres som endelige output. Billedet forarbejdning (A) subrutine af algoritmen konverterer input billedet sekvens i en liste over de bedste-fit ellipser ved tærskling, ved hjælp af z-score for en standard normalfordeling og ImageJ partikel analyse. Begivenhed behandling (B) er en sortering underprogram bruges til at bestemme optimale position ROI ved at organisere ellipse steder i Event "sites" efter tid. Efter betyde intensitet målinger ved hver ROI er statistiske parametre for hvert arrangement og site beregnet af behandlingen ROI underrutinen (C </ Strong>) til at generere det endelige output. BKGD, baggrund; AVG, gennemsnit. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2.. Demonstration af erhvervelse automatiseret ROI og påvisning signal ved hjælp af en computer-genereret Gaussisk puls (dette tal blev tilpasset med tilladelse fra Francis et al.) 24. En enkelt computer-genereret signal impuls (A) blev indlejret i tilfældig baggrundsstøj. Gråskalabillede sekvensen blev filtreret for at fjerne statiske baggrund pixelværdier (B) og konverteret til binær hjælp tærskel pixel intensitetsværdier P <0,05 beregnes ved standard score (C). ImageJ partikel analyse algorithms blev derefter anvendt på billedsekvensen for at tildele bedste tilpasning ellipser pixel loci inden for hver ramme. En roman algoritme blev brugt til at gruppere ellipser i diskrete timelige "begivenheder" og bestemme den optimale position for hver ROI baseret på gennemsnitsværdien ellipse center (D). En ROI af brugerdefinerede radius er derefter placeret på hver position (stiplet cirkel). Mean intensitetsværdier i et ROI beregnes for hver ramme og skaleres anvendelse af en lineær basislinie tilnærmelse. Peak amplitude er identificeret som lokale maksima over P <0,05 som defineret af standarden score for en tilsvarende ROI sporing (E). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Porci ne koronararterie dissektion protokol. Ca. 0,5 mm i diameter x 8 mm længde grene af den venstre forreste nedadgående kranspulsåre (1. billede, prikket cirkel) blev dissekeret fra den omgivende myokardiet. Fartøjets segmenter blev trimmet omgivende adventitial væv og skåret på langs med en lille saks (2. billede). Derefter blev åbnet fartøjer pinned fladt til en PDMS blok med fint wolfram ledninger (3rd billede). Monterede skibstyper blev fyldt med Fluo-4 Ca2 + indikatorfarvestof, vasket og derefter anbragt i en dækglas bund billeddannelse kammeret. Billeder blev indsamlet ved 20X forstørrelse (488 ex., 510 em.) På 8,0 billeder pr sekund ved hjælp af en omvendt konfokal mikroskop. Klik her for at se en større version af dette tal.
0/51560fig4highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 4.. ROI betyder intensitet baseline tilnærmelse. Efter gennemsnitlig intensitet versus tidsmålinger (faste linjer) for hver ROI, er de rå intensitet værdier skaleret til F/F0 hjælp af følgende baseline tilnærmelse metode. Den gennemsnitlige signalintensitet (stiplet linie) i kontrolperioden beregnes fra brugerdefinerede kontrol og behandling interval værdier (A). Den tidsafhængige signalintensitet kurve derefter afkortes over middelværdien kontrol intensitet til den gennemsnitlige kontrol intensitet til at filtrere aktivitet fra baseline tilnærmelse og en lineær regression udføres på den resulterende kurve (stiplede linier) (B). Endelig er de rå intensitet værdier skaleret til den beregnede lineære baseline (C). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Repræsentative resultater fra LC_Pro analyse af basal og stimuleret Ca 2 + dynamik. Tidsforskydningen billeder af en inputbilledets sekvens af basal sampleinterval (A, venstre panel) efterfulgt af en substans P-stimuleret samplinginterval (A, højre panel ) er vist i gråtoner. Time lapse billedsekvenser på bedste fit ellipser for basal og stimuleret intervaller (B) blev gjort af LC_pro. Endelig tidsafhængige skaleret intensitetskurver fra hver placeres automatisk region af interesse (ROI) vist (C).
Figur 6. Histogrammeraf parameter udlodninger fra et repræsentativt forsøg (Figur 4). Histogrammer fra parametre for peak amplitude (F/F0), varighed på ½ max (sek), og maksimal rumlig spredning (mM 2) for både kontrol (venstre kolonne) og substans P-stimuleret (højre kolonne) begivenheder fra et repræsentativt forsøg var gjort brug af R for grafisk behandle outputtet fra LC_pro. Især substans P stimulation udvidet antal hændelser, og forårsagede en signifikant højre skift i median amplitude og varighed af Mann-Whitney U-test (p <0,01).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Afkodning komplekse Ca 2 +-signaler på det cellulære og flercellede niveau vil kræve strenge eksperimentelle og analytiske tilgange. Her er en tilgang, der er beskrevet i hvilken tid løst konfokal billedsekvenser af Ca 2 + afhængig fluorescens underkastes en automatiseret analyse, der identificerer og kvantificerer statistisk relevante Ca 2 + signaler inden intakte cellulære felter I den konkrete sag fremlagte en arterie segment blev isoleret fra gris hjerte, pinned åbnet for at blotlægge endotel, lastet med Ca 2 + indikator Fluo-4 AM udsat for konfokal billedbehandling og evalueres med brugerdefinerede algoritme LC_Pro. Denne algoritme er designet til 1) opdage og spore steder af dynamisk Ca 2 + skifte over statistisk (p <0,01) støj, 2) at definere områder af interesse (ROI) automatisk ved aktivt sted centre, og 3) at analysere gennemsnitlige fluorescensintensiteter på ROIs at fastlægge specifikke event parametre. Den fremgangsmådeovervinder store begrænsninger af biologisk signalering forskning ved at reducere brugerens fejl og partiskhed, hvilket reducerer offline analyse tid, og giver en komplet indeks af signaler på tværs af et felt for at skelne repræsentative profiler eller mønstre. Output fra LC_Pro videreforarbejdes gennem R-scripts, der giver fuld parameter rapporter for de enkelte eksperimenter, herunder høj kvalitet grafiske output.
Flere trin er vigtige for korrekt udførelse af den beskrevne teknik. Vævet dissektionsproceduren (trin 1.1.1) skal udføres omhyggeligt for at undgå blotlægning eller skade på endothelcellelaget. Derudover skal billedsekvenser være i det rigtige format (trin 2.1) til automatiseret region af interesse algoritme til at fungere korrekt. For eksempel, hvis der er målestok information associeret med filen, regioner af interesse vil være forkert placeres efter pixelstederne, snarere end de skalerede steder enhedspriser. Også vælge en passende region diameter interesse er afgørende for korrekt udførelse af automatiseret analyse af den fluorescerende aktivitet i en billedsekvens. For lille en diameter værdi kan resultere i redundante målinger, mens en for stor diameter vil resultere i udelukkelse af subtile signaler.
Potentielle faldgruber ved denne teknik vedrører primært følsomhed over automatiseret analyse til xy forskydninger i det optagede billede sekvenser og at signalere mætning og / eller blegning, hvilket kan resultere i falsk positive eller falsk negative resultater. Dimensional driver eller forskydninger kan rettes direkte gennem anvendelse af stakken registrering software og præcis udpegning af intervaller, hvor der er indført forstyrrelser. Gråniveauer og parametre diameter ROI kan også være optimeret til et bestemt præparat forud for dataindsamlingen for at standardisere rå datasæt.
Fordi det fungerer som en standard tilgang til enhver dynamisk fluorescens signal, beskrevne analyse here er egnet til en forskelligartet organ applikationer. I karrene, er denne metode er ansat til at definere karakteristiske fysiologiske og patofysiologiske signal modaliteter i flere vaskulære senge under basal og stimuleret betingelser 25,26. Det bliver også anvendt i automatiseret sporing af Ca 2 + bølger. I sidste ende vil en sådan global automatiseret analyse være et afgørende omdrejningspunkt i dechifrere rumligt og tidsligt komplekse bio-signaler og etablere nye celle og multi-celle modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet delvist af National Institutes of Health Tilskud HL-085.887, HL-092.992, S10RR027535 og MOP-93676.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection dish | Fisher Sci | #08-772-70 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Fisher Sci | #NC9644388 | elastomer kit, must be molded into dishes |
| HEPES-buffered PSS | Sigma | #H3375-250G | HEPES acid |
| Stereomicroscope | Nikon Inst. | #MNA42000 | |
| Forceps | Fine Science Tools | #11223-20 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Tungsten wire | Scientific Inst Svcs | #406 | |
| Fluo-4 AM | Life Tech. | #F-14201 | |
| Pluronic F-127 | Life Tech. | #P3000MP | |
| Metal pins | Fine Science Tools | #26002-10 | |
| Cover-glass bottom chamber | Custom designed | ||
| Spinning disc confocal microscope | Perkin Elmer | RS-3 | |
| ImageJ software | download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html | ||
| LC_Pro plugin for imageJ | download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html | ||
| R software | download at: http://www.r-project.org/ | ||
| R traceplot script | download at: https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing |
References
- Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361 (6410), 315-325 (1993).
- Berridge, M. J., et al. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
- Delisle, S. The four dimensions of calcium signalling in Xenopus oocytes. Cell Calcium. 12 (2-3), 217-227 (1991).
- Dupont, G., et al. Calcium dynamics: spatio-temporal organization from the subcellular to the organ level. Int Rev Cytol. 261, 193-245 (2007).
- Hayashi, H., Miyata, H. Fluorescence imaging of intracellular Ca2. J Pharmacol Toxicol Methods. 31 (1), 1-10 (1994).
- Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. J Vis Exp. 23, (2009).
- Hong, J. H., et al. Intracellular calcium spikes in rat suprachiasmatic nucleus neurons induced by BAPTA-based calcium dyes. PloS One. 5 (3), (2010).
- Kuga, N., et al. Large-scale calcium waves traveling through astrocytic networks in vivo. J Neurosci. 31 (7), 2607-2614 (2011).
- Mumtaz, S., et al. The mechanism of agonist induced Ca2+ signalling in intact endothelial cells studied confocally in in situ arteries. Cell Calcium. 49 (1), 66-77 (2011).
- Paredes, R. M., et al. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).
- Silei, V., et al. Measurement of intracellular calcium levels by the fluorescent Ca2+ indicator Calcium-Green. Brain Res Brain Res Protoc. 5 (2), 132-134 (2000).
- Simpson, A. M. Fluorescent measurement of [Ca2+]c: basic practical considerations. Methods Mol Biol. 937, 3-36 (2006).
- Gaspers, L. D., Thomas, A. P. Calcium signaling in liver. Cell Calcium. (3-4), 329-342 (2005).
- Hellman, B., et al. Cytoplasmic Ca2+ oscillations in pancreatic ß-cells. Biochem Biophys Acta. 1113 (3-4), 295-305 (1992).
- Kansui, Y., et al. Enhanced spontaneous Ca2+ events in endothelial cells reflect signalling through myoendothelial gap junctions in pressurized mesenteric arteries. Cell Calcium. 44 (2), 135-146 (2008).
- Tatsumi, H., et al. Measurement of the intracellular calcium concentration in guinea-pig myenteric neurons by using fura-2. Brain res. 451 (1-2), 371-375 (1988).
- Lorenz, J. J., et al. Pixel-based criteria-oriented analysis of time-lapse Ca2+-fluorescence images. J Neurosci Meth. 127 (2), 157-166 (2003).
- Mukamel, E. A., et al. Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data. Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).
- Reidl, J., et al. Independent component analysis of high-resolution imaging data identifies distinct functional domains. Neuroimage. 34 (1), 94-108 (2007).
- Wegner, F., et al. Automated detection of elementary calcium release events using the á trous wavelet transform. Biophys J. 90 (6), 2151-2163 (2006).
- Cheng, H., et al. Amplitude distribution of calcium sparks in confocal images: theory and studies with an automatic detection method. Biophys J. 76 (2), 606-617 (1999).
- Picht, E., et al. SparkMaster: automated calcium spark analysis with ImageJ. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (3), (2007).
- Abramoff, M. D., et al. Image processing with ImageJ. Biophoton Int. 11, 36-42 (2004).
- Francis, M., et al. Automated region of interest analysis of dynamic Ca2+ signals in image sequences. Am J Physiol Cell Physiol. 303 (3), (2012).
- Qian, X., et al. Recruitment of dynamic endothelial Ca2+ signals by the TRPA1 channel activator AITC in rat cerebral arteries. Microcirculation. 20 (2), 138-148 (2013).
- Taylor, M. S., et al. Dynamic Ca2+ signal modalities in the vascular endothelium. Microcirculation. 19 (5), 423-429 (2012).
- Martens, C. J., et al. Mucous solids and liquid secretion by airways: studies with normal pig, cystic fibrosis human, and non-cystic fibrosis human bronchi. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 301 (2), (2011).
