Abstract
세포 내 칼슘 2 + 신호는 일반적으로 형광 칼슘 2 + 지표 염료 및 현미경 기술을 연구한다. 그러나, 칼슘 2 + 영상 데이터의 정량 분석 시간과 바이어스에 따라 달라질 수 있습니다. 또한 (ROI)의 검출 영역에 기초하여 자동화 된 신호 분석 알고리즘은 일차원 라인 스캔 측정에 대해 구현되어 있지만 이차원 이미지 시퀀스에서 최적화 된 신분증과의 ROI 분석을 통합 전류 알고리즘은 없다. 여기서 이미지 시퀀스에서 수집 및 급속의 ROI 분석을위한 알고리즘을 설명한다. 이 타원이 최적의 투자 수익 (ROI)의 위치를 결정하기 위해 노이즈 필터링 된 신호에 맞게 활용하고, 진폭, 시간 및 공간 확산의 칼슘 2 + 신호 파라미터를 계산한다. 이 알고리즘은 ImageJ에 (NIH) 소프트웨어를 자유롭게 사용할 수 플러그인으로 구현되었습니다. 함께 오픈 소스 통계 처리 소프트웨어 R 용으로 작성된 분석 스크립트와,이러한 접근법은 실험 출력 퀵 통계 분석을 수행하기위한 고용량 파이프 라인을 제공한다. 저자는이 분석 프로토콜의 사용은 생리적 칼슘 2 + 신호의보다 완전하고 공정한 특성으로 이어질 것입니다 것이 좋습니다.
Introduction
칼슘 2 +는 분자 및 세포 내 칼슘 2 + 수준을 높게 조절되는 신호 유비쿼터스 두 번째 메신저입니다. 세포 내 칼슘 2 + 신호가 복잡하고 고립 과도, 진동, 파도 1 전파 포함 - 4. 칼슘 2 +의 공간과 시간 제어 생체 신호 특이성을 기초로 생각, 따라서 칼슘 2 + 신호 패턴의 분석은 여러 필드 5의 조사에 상당한 관심입니다.
예컨대 플루오 (Fluo) -4의 Fura-2와 같은 칼슘 2 + 인디케이터 염료는 일반적으로 형광 현미경 5-12로 내 Ca 2 + 신호를 측정하기 위해 사용된다. 16 - 일반적으로, 시간적 칼슘 2 + 신호는 시간에 따른 사용자 정의 지역 내의 평균 형광의 변화, 또는 관심 영역 (ROI) 5,6,13로 평가됩니다. 현재, 수동 ROI 분석은 시간과 노동력에19 -가 많은 로아를 확인하고 반복적 인 연산 17을 수행하는 사용자가 필요로하기 때문에 긴장의. 이 기술은 인공 신호 모드와 낮은 진폭 또는 확산 신호 (18, 20)의 배제의 도입을 포함, 많은 사용자의 오차가있을 수 있습니다.
, 자동 ROI 검출 알고리즘은 이전에 최적의 투자 수익 (ROI)의 위치를 결정하기 위해 통계적 다양한 접근 방법을 사용하여 구현되었지만, 일반적으로 라인 스캔 또는 의사 선 시간이 17에서 하나의 공간 차원으로 분석을 제한 스캔 이미지의 분석에 국한되어 19-22. 또한, 기존의 많은 알고리즘 캘리포니아주기, 지역화 과도에서 전파 파도 (23, 24)에 이르기까지 다양 2 + 릴리스 이벤트의 다양성을 포괄하기에 충분하지 않습니다. 생리 칼슘 2 + 신호의 종합 평가는 종종 더 큰 이미지의 인형도 만들고의 존재에 의해 복잡그 많은 실험 시스템의 잡음 차별 신호를 혼동 역할을합니다.
이전에, 캘리포니아에 자동 ROI 검출 알고리즘 솔루션 2 +는 (건강, 베데스다, MD의 국립 연구소)가 개발하고 (25), (26)을 검증 된 NIH ImageJ에 소프트웨어를위한 플러그인으로 구현, 과도 감지 신호. LC_Pro 불리는이 알고리즘은 두 가지 차원의 시간 경과 이미지 시퀀스에서 칼슘 2 + 과도 신호를 포괄의 ROI를 확인하고 분석 할 수 있도록 설계되었습니다. 여기서 실제 실험 프로토콜 및 돼지 관상 동맥 내피의 알고리즘의 적용이 가능한 대표적인 데모 그래픽 출력을 생성하기 위해 오픈 소스 통계 처리 소프트웨어 R을 후 처리하여 추가로 제공된다.
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Protocol
1. 선박의 해부 및 이미징
- 마틴 등 27에 설명 된대로 국내 청소년 돼지에서 수확 조직. 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) HEPES는 생리 식염수 (PSS)를 버퍼 포함 아래 해부 접시에 수확 돼지 우심실을 놓습니다.
- 실체 현미경의 도움으로, 해부 주위 심장 조직의 층에서 혈관 세그먼트를 제거하여 집게와 봄 가위를 사용하여 주변 조직에서 관상 동맥 (~ 8mm 길이 0.5 mm 직경) 좌전 하행의 세그먼트를 제거합니다. 참고 : 혈관 벽에 구멍을하지 않도록주의하십시오.
- 해부 접시에 PDMS 블록 (1 × 0.5 × 0.5 cm)를 배치하고 바닥에 핀 바늘을 사용합니다. 마이크로 핀들을 형성, 열두 ~ 0.3 cm 길이의 세그먼트로 약 40 μm의 직경의 텅스텐 와이어를 잘라 접시에 이것들을 배치합니다. 집게를 사용하여, micropi 가진 블록 용기 세그먼트의 한쪽 끝을 고정N.
- 조심스럽게 혈관 내강에 작은 봄 가위를 삽입하고 완전히 엽니 용기의 한 쪽 아래로 길이 방향으로 잘라. 내피 위로 열린 용기 세그먼트의 방향을.
- 선박이 평평한 사각형을 형성하도록 차단하는 열린 용기 세그먼트의 경계를 확보하기 위해 나머지 마이크로 핀들을 사용합니다. 참고 :, 마이크로 탑은 90 °로 구부려 블록 표면과 같은 높이까지 삽입해야합니다. 케어 overstretching로하지 않고 용기 준비 스트레칭주의해야한다; 최종 폭 ~ 시작 연신 폭을 1.5 배되어야한다.
- 134 염화나트륨, 6의 KCl : HEPES에 플루로 닉 (0.03 %)와 DMSO에 용해 플루오 (Fluo) - 오전 4시 (10 μM)를 혼합하여 플루오 (Fluo) - 오전 4로드 솔루션의 작은 볼륨 (~ 1 ㎖)를 준비 밀리미터에 포함 PSS는 (버퍼 1 MgCl2를, 10 HEPES, 10 포도당), 그리고 어둠 속에서 실온에서 약 40 분 동안 로딩 솔루션으로 전체 블록을 삽입합니다.
- 로드 한 후, 버퍼 HEPES의 블록을 씻어5 ~ 10 분 PSS.
- HEPES가 PSS 버퍼가 포함 된 커버 글라스 바닥 챔버에서 50 ~ 100 μm의 두께 스페이서에 블록을 설치합니다. 참고 : 금속 핀이 스페이서로 사용하고 혈관 세그먼트가 아래로 향하게하고 스페이서를 만지고되지 않도록 할 수 있습니다.
- 공 촛점 이미징 장비 거꾸로 현미경의 무대에 실을 배치하고 내피 세포의 층에 초점을 맞 춥니 다.
- 3 ~ 20 배 배율 분, 공 초점 이미지 시퀀스 aquisition 소프트웨어를 사용하여 초 당 ~ 8 프레임의 프레임 속도를위한 기초 상대 형광 캡처 시간 경과 이미지 시퀀스.
- 기저 형광을 기록 ~ 3 분 후에는 HEPES한다 추가 3 분간 동일 HEPES에서 PSS 버퍼링 용해 물질 P (100 PM)의 부피 (~ 1 ㎖), 및 레코드와 PSS 용액을 버퍼링 대체.
2. 자동 분석
- 8 비트, G 등의 공 촛점 수집 소프트웨어에서 형광 칼슘 활동의 이미지 시퀀스 (들)을 렌더링없는 규모의 정보 rayscale '. TIF'형식의 파일.
- 오픈 ImageJ에는 파일 메뉴에서 '열기'를 클릭하고, ImageJ에있는 이미지 시퀀스 (들)을 볼 수있는 탐색기 창에서 해당 이미지 시퀀스를 선택합니다.
- 이미지 시퀀스 (들) 내의 활동 공간 확산의 상부 및 하부 경계를 추정하는 직사각형 ROI 도구를 사용하여 적절한 ROI 직경을 결정한다. 주 : 평균 직사각형의 직경은 투자 수익 (ROI)의 직경을하는 경우 적합한 선택입니다.
- 컴퓨터 하드 드라이브에 새 폴더를 만들고 폴더 디렉토리에 이미지 시퀀스 (들)을 추가합니다.
- ImageJ에에서 '플러그인'창을 클릭 한 다음 분석을 시작하는 'LC_Pro'을 클릭합니다.
- 투자 수익 (ROI)의 지름 값을 입력하고 필터 임계 값 (0.05 또는 0.01 중 하나)를 선택합니다.
- '약물 치료'확인란을 클릭하고 바로 전후에 약이 추가 된 시간 (초) 포인트 값을 입력합니다.
- '확인'을 클릭하고파일 탐색기 창에 이미지 시퀀스 디렉토리를 입력합니다.
3. 그래픽 출력
- 에서 R 버전 3.0.2을 다운로드 http://www.r-project.org/ .
- R.의 32 비트 버전을 엽니 다
- "파일"다음 '스크립트 열기'를 클릭하고 그래픽 실험 보고서를 생성하는 'traceplot.R'R 스크립트를 선택합니다.
- '패키지'를 선택하여 보정하고, gplots 패키지를 설치, '패키지를 설치', 그리고 appropirate 패키지를 선택.
- '디렉토리 변경'명령 다음, '파일'을 클릭하고 LC_Pro 분석 출력에 해당하는 디렉토리를 선택 탐색기 창을 사용합니다.
- 스크립트 창을 클릭 한 후 '실행하는 모든'스크립트를 실행하는 명령.
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dissection dish | Fisher Sci | #08-772-70 | |
Polydimethylsiloxane (PDMS) | Fisher Sci | #NC9644388 | elastomer kit, must be molded into dishes |
HEPES-buffered PSS | Sigma | #H3375-250G | HEPES acid |
Stereomicroscope | Nikon Inst. | #MNA42000 | |
Forceps | Fine Science Tools | #11223-20 | |
Spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
Tungsten wire | Scientific Inst Svcs | #406 | |
Fluo-4 AM | Life Tech. | #F-14201 | |
Pluronic F-127 | Life Tech. | #P3000MP | |
Metal pins | Fine Science Tools | #26002-10 | |
Cover-glass bottom chamber | Custom designed | ||
Spinning disc confocal microscope | Perkin Elmer | RS-3 | |
ImageJ software | download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html | ||
LC_Pro plugin for imageJ | download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html | ||
R software | download at: http://www.r-project.org/ | ||
R traceplot script | download at: https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing |
References
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