Summary
Aquí una novela región de interés protocolo de análisis basado en la clasificación de las elipses de mejor ajuste asignados a las regiones de la señal positiva dentro de secuencias de imágenes lapso de tiempo de dos dimensiones se demuestra. Este algoritmo puede permitir a los investigadores a analizar exhaustivamente las señales + Ca 2 fisiológicas con intervención mínima del usuario y el sesgo.
Abstract
Intracelular de Ca 2 + señales se estudian comúnmente con colorantes fluorescentes Ca 2 + indicadores y técnicas de microscopía. Sin embargo, el análisis cuantitativo de Ca 2 + de datos de formación de imágenes es mucho tiempo y sujetos a sesgo. Algoritmos de análisis de señales automatizadas basadas en región de interés (ROI) de detección han sido implementados para las mediciones de barrido línea unidimensional, pero no hay ningún algoritmo actual que integra la identificación optimizado y el análisis de rendimiento de la inversión en secuencias de imágenes bidimensionales. Aquí se describe un algoritmo para la rápida adquisición y el análisis de rendimiento de la inversión en secuencias de imágenes. Utiliza elipses ajustan a las señales filtradas de ruido con el fin de determinar la colocación óptima retorno de la inversión, y calcula Ca 2 + parámetros de la señal de amplitud, duración y amplitud espacial. Este algoritmo fue implementado como un plugin disponible gratuitamente para ImageJ (NIH) de software. Junto con guiones escritos para el análisis de código abierto de software de procesamiento estadístico R,este enfoque proporciona una tubería de alta capacidad para llevar a cabo el análisis estadístico rápida de la producción experimental. Los autores sugieren que el uso de este protocolo de análisis dará lugar a una caracterización más completa y no sesgada de fisiológica Ca 2 + señalización.
Introduction
Ca 2 + es un segundo mensajero ubicua molécula de señalización y citosólica de Ca 2 + niveles están muy regulados. Intracelular de Ca 2 + señales son complejas e incluyen transitorios aislados, oscilaciones y ondas que se propagan 1-4. Control espacial y temporal de Ca 2 + se cree que subyacen especificidad señal fisiológica, y por lo tanto el análisis de Ca 2 + patrones de señales es de gran interés para los investigadores en múltiples campos 5.
Colorantes Ca 2 + indicador como Fluo-4 y Fura-2 se emplean comúnmente para medir Ca 2 + señales intracelulares con microscopía de fluorescencia 5-12. Por lo general, temporales Ca 2 + señales se evalúan los cambios dependientes del tiempo en medio de fluorescencia dentro de un área definida por el usuario, o región de interés (ROI) 5,6,13 - 16. Actualmente, el análisis ROI manual es a la vez tiempo y mano de obra enintensivo, ya que requiere que los usuarios identifiquen muchas regiones de interés y realizar cálculos repetitivos 17-19. Estas técnicas también pueden estar sujetos a considerables errores de los usuarios, incluida la introducción de modos de señal artificiales y la exclusión de las señales difusas 18,20 baja amplitud o.
Algoritmos automatizados de detección de ROI se han aplicado anteriormente usando una variedad de métodos estadísticos para determinar la colocación óptima retorno de la inversión, pero por lo general se han limitado al análisis de exploración de línea o pseudo-line imágenes de exploración, lo que restringe el análisis a una sola dimensión espacial en el tiempo 17, 19-22. Además, muchos algoritmos existentes no son suficientes para abarcar la diversidad de Ca 2 + de liberación eventos que van desde, transientes periódicos localizados a las ondas que se propagan a 23,24. Evaluación integral de Ca 2 + señales fisiológicas a menudo se complica aún más por la presencia de Artif imagen significativaacto que confunde señal a ruido de la discriminación en muchos sistemas experimentales.
Anteriormente, una solución algoritmo de detección de ROI automatizado para Ca 2 + señal de detección de transitorios, implementado como un plug-in para el software ImageJ NIH (Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD), fue desarrollado y validado 25,26. Este algoritmo, llamado LC_Pro, fue diseñado para identificar y analizar los ROIs que abarca Ca 2 + transitorios de señal en secuencias de imágenes de lapso de tiempo de dos dimensiones. Aquí se proporciona un protocolo experimental práctico y demostración representativa de una aplicación del algoritmo en el endotelio de la arteria coronaria porcina, con post-procesamiento adicional utilizando el código abierto estadística software de procesamiento de R para generar una salida gráfica utilizable.
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Protocol
1. Disección de Buques e Imagen
- Tejido de cosecha de cerdos juveniles nacionales como se describe en Martens et al 27. Coloque ventrículos derecho porcina cosechadas en un polidimetilsiloxano (PDMS) plato de disección de fondo que contiene tamponada con HEPES solución salina fisiológica (PSS).
- Con la ayuda de un estereomicroscopio, diseccionar y retirar un segmento de la arteria descendente anterior izquierda coronaria (~ 8 mm de longitud, 0,5 mm de diámetro) del tejido circundante utilizando fórceps y tijeras de primavera mediante la eliminación de la segmento de vaso de las capas de tejido cardiaco de los alrededores. NOTA: Tenga cuidado de no perforar la pared del vaso.
- Coloque un bloque de PDMS (1 x 0,5 x 0,5 cm) en el plato de disección, y el uso de una aguja para fijarlo a la parte inferior. Cortar un alambre de tungsteno de aproximadamente 40 m de diámetro en doce ~ segmentos de longitud 0,3 cm, formando microalfileres, y colocarlos en el plato. Con unas pinzas, sujete un extremo del segmento del vaso al bloque con una MICROPIn.
- Inserte con cuidado las pequeñas tijeras de primavera en la luz del vaso, y cortar longitudinalmente en un lado de la embarcación para abrirlo por completo. Oriente el segmento de vaso abierto con el endotelio hacia arriba.
- Utilice los microalfileres restantes para asegurar las fronteras del segmento de vaso abierto para bloquear de manera que el recipiente forma un rectángulo plano. NOTA: Micropin tapas deben estar dobladas a 90 ° y se insertan hasta que quede nivelado con la superficie del bloque. Se debe tener cuidado para estirar la preparación buque sin estirar demasiado; anchura final debe ser ~ 1,5 x el ancho de partida sin estirar.
- Preparar un volumen pequeño (~ 1 ml) de Fluo-4 AM solución de carga mediante la mezcla de Fluo-4 a.m. (10 mM) disuelto en DMSO con plurónico (0,03%) en un tamponada con HEPES PSS (que contiene en mM: 134 NaCl, KCl 6 , 1 de MgCl, 10 HEPES, 10 glucosa), e insertar todo el bloque en la solución de carga durante aproximadamente 40 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
- Después de cargar, lavar el bloque en tampón HEPESPSS durante 5-10 min.
- Monte el bloque a 50-100 micras espaciadores de espesor en una cámara inferior cubre objetos que contiene tamponada con HEPES PSS. NOTA: Los clavos metálicos se pueden utilizar como separadores y asegurar el segmento de vaso esté hacia abajo y no tocar los espaciadores.
- Coloque la cámara en el escenario de un microscopio invertido equipado para imagen confocal, y se centran en la capa de células endoteliales.
- Secuencias de imágenes de lapso de tiempo de captura de fluorescencia relativa basal durante ~ 3 min a 20 aumentos y una velocidad de ~ 8 fotogramas por segundo utilizando la imagen confocal software de secuencia de adquisición.
- Después de ~ 3 min de grabación de fluorescencia basal, reemplazar tamponada con HEPES solución de PSS con el mismo volumen (~ 1 ml) de la sustancia P (100 pM) disuelto en tampón HEPES PSS, y récord para un addtional 3 min.
2. Análisis Automatizado
- Render secuencia (s) imagen de la actividad de calcio fluorescente del software de adquisición confocal como 8 bits, grayscale '. tif' archivos de formato sin información de escala.
- Abrir ImageJ, haga clic en "abierto" en el menú archivo y seleccionar la secuencia de imágenes apropiado en la ventana del explorador para ver la secuencia (s) imagen en ImageJ.
- Determinar un diámetro ROI apropiada mediante el uso de la herramienta de ROI rectangular para estimar los límites superior e inferior de la propagación espacial de la actividad dentro de la secuencia (s) de imagen. NOTA: El diámetro rectangular media es una buena opción para diámetro ROI.
- Cree una nueva carpeta en el disco duro del ordenador, y agregar la secuencia (s) imagen en el directorio de la carpeta.
- En ImageJ, haga clic en la ventana de 'plugins', a continuación, haga clic en 'LC_Pro' para iniciar el análisis.
- Introduzca el valor de retorno de la inversión de diámetro y seleccione el valor umbral del filtro (ya sea 0.05 o 0.01).
- Haga clic en la casilla de verificación 'tratamiento contra las drogas' y escriba los valores de los puntos de tiempo se añadió el fármaco inmediatamente antes y después (en segundos).
- Haga clic en 'ok', yentrar en el directorio de secuencias de imágenes en la ventana del explorador de archivos.
3. Salida gráfica
- Descargar R versión 3.0.2 de http://www.r-project.org/ .
- Abra la versión de 32 bits de R.
- Haga clic en "Archivo", luego "guión abierto 'y seleccione el script de R' traceplot.R 'para la generación de informes de experimentación gráfica.
- Instale la calibración, y los paquetes gplots seleccionando "paquetes", "instalar paquetes", y la selección de los paquetes appropirate.
- Haga clic en 'Archivo' y luego 'cambio de directorio "de comandos, y el uso de la ventana del explorador para seleccionar el directorio que corresponde a la salida análisis LC_Pro.
- Haga clic en la ventana de guión y luego el 'run all' comando para ejecutar el script.
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Representative Results
Un algoritmo personalizado, LC_Pro, fue desarrollado e implementado con el fin de realizar el análisis automatizado de Ca 2 + en la dinámica de las secuencias de imagen confocal. Como se muestra en la Figura 1, el algoritmo utiliza los módulos de procesamiento secuencial que A) detectar y yacimientos de huellas de dinámica Ca 2 + cambiar encima estadística (p <0,01) el ruido, B) definir regiones de interés (ROI) de forma automática en los centros del sitio activo, y C) el cálculo de la intensidad media de fluorescencia a ROI para determinar parámetros de eventos específicos. Un resumen gráfico del algoritmo se muestra el uso de la computadora genera pulsos gaussianos de intensidad conocida y ubicación (Figura 2). Impulsos de señal (Figuras 2A y B) fueron convertidos a binario utilizando el z-score para una distribución normal estándar y de mejor ajuste elipses fueron asignados a loci de píxeles por encima del umbral de la señal (Figura 2 C). Un algoritmo de ordenación elipse se utilizó para determinaciónne colocación ROI óptimo (Figura 2D). ROI significa entonces se midió la intensidad en función del tiempo y de los parámetros de la señal de amplitud, duración y amplitud espacial se computaron (Figura 2E). Este enfoque de análisis se aplicó para evaluar Ca 2 + dinámica celular en el endotelio vascular intacto. Específicamente, la imagen confocal se realizó en las arterias coronarias de cerdos abiertos como se describe en la Figura 3, y el algoritmo se empleó fuera de línea para cuantificar distintos de Ca 2 + parámetros. Para estos experimentos, se hicieron las grabaciones continuas antes y después de la adición del estímulo endotelial, la sustancia P (SP; 100 pM), y el análisis LC_Pro se realizó posteriormente. Para la ampliación de la señal dentro de cada ROI, líneas de base se derivaron como regresiones lineales de intensidad ROI a lo largo del tiempo de experimentación (Figura 4). La media de los valores de intensidad de señal se calcularon para cada ROI (Figura 4), y los valores por encima de la media fueron trunc ated a la media y una regresión lineal se realizó para aproximar la señal de línea de base (Figura 4B). Por último, los valores de intensidad primas fueron divididos por el valor de la línea de regresión para convertir valores a veces el cambio sobre la línea base (Figura 4C). Figura 5 muestra un experimento representativo, incluyendo imágenes de Ca 2 + fluorescencia dependiente en el endotelio (Figura 5A), acumular máscaras binarias del total de la señal de Ca 2 + detectada dentro del campo de la muestra (Figura 5B), y grabaciones de fluorescencia media en cada ROI (Figura 5C) antes y después del tratamiento con SP. Se realizó el análisis de parámetros posteriores utilizando el software R. Histogramas resultantes muestran el efecto amplificador de SP en amplitud caso, la duración y distribución espacial (Figura 6).
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Figura 1. Diagramas de flujo de señal de procesos de algoritmo (esta cifra se obtuvo con el permiso de Francis et al.) 24. El algoritmo fue organizado en tres secciones: procesamiento de imágenes, procesamiento de eventos, y la región de interés de procesamiento (ROI). Las secuencias de imágenes se introducen en la cadena de flujo, y las estadísticas de eventos se generan como salida final. El procesamiento de imágenes (A) subrutina del algoritmo convierte la secuencia de imágenes de entrada en una lista de las elipses de mejor ajuste de umbral, utilizando el z-score para una distribución normal estándar y análisis de partículas ImageJ. El procesamiento de eventos (B) es una subrutina de clasificación utilizado para determinar la posición óptima retorno de la inversión mediante la organización de eventos en lugares elipse "sitios" de tiempo. Después significan mediciones de la intensidad se toman en cada retorno de la inversión, los parámetros estadísticos para cada evento y el sitio se calculan por la subrutina de procesamiento de ROI (C </ Strong>) para generar el resultado final. BKGD, los antecedentes; AVG, la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Demostración de la adquisición ROI automatizada y detección de la señal utilizando un pulso gaussiano generada por computadora (esta cifra fue adaptado con permiso de Francis et al.) 24. Un único pulso de la señal generada por ordenador (A) se incrusta en el ruido de fondo aleatorio. La secuencia de imágenes en escala de grises se filtró para separar los valores de píxeles de fondo estáticos (B) y se convierte a binario utilizando valores de intensidad de pixel umbral de P <0,05 calculado por la puntuación estándar (C). ImageJ análisis de partículas algorithMS se aplicaron luego a la secuencia de imágenes para asignar de mejor ajuste elipses para loci de píxeles dentro de cada trama. Un nuevo algoritmo se utilizó para elipses de grupo en "eventos" temporales discretas y determinar la posición óptima para cada ROI basado en el centro de la elipse media (D). Un retorno de la inversión de la radio definida por el usuario se coloca después en cada posición (círculo punteado). La media de los valores de intensidad dentro de un retorno de la inversión se calculan para cada cuadro y ampliarse usando una aproximación de línea de base lineal. Amplitud pico se identifica como máximos locales arriba P <0,05 según la definición de la puntuación estándar para un rastreo ROI correspondiente (E). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Porci ne protocolo de disección de la arteria coronaria. Ramas Aproximadamente 0,5 mm de diámetro x 8 mm de longitud de la arteria descendente anterior coronaria (primera imagen, círculo de puntos) fueron disecados de miocardio circundante. Segmentos de los buques fueron recortados del tejido circundante de la adventicia y se cortan a lo largo con unas tijeras pequeñas (segunda imagen). A continuación, los vasos abiertos fueron puestas plana a un bloque PDMS utilizando cables de tungsteno fino (tercera imagen). Segmentos de vasos montados se cargaron con Fluo-4 Ca 2 + colorante indicador, se lavaron, y luego se colocan en una cámara de imágenes cubreobjetos de fondo. Las imágenes se recogieron en 20 aumentos (488 ex., 510 em.) A 8,0 fotogramas por segundo utilizando un microscopio confocal invertido. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 4. Retorno de la inversión significa la intensidad aproximación de línea de base. Después de intensidad media con respecto al mediciones de tiempo (líneas continuas) para cada retorno de la inversión, los valores de intensidad primas se escalan para f/f0 utilizando el siguiente método de aproximación de línea de base. La intensidad media de la señal (línea de trazos) durante el período de control se calcula a partir de control definido por el usuario y los valores de intervalo de tratamiento (A). La curva de intensidad de la señal dependiente del tiempo se trunca a continuación, por encima de la intensidad media de control para el control de la intensidad media para filtrar la actividad de aproximación de línea de base, y una regresión lineal se lleva a cabo en la curva resultante (líneas de puntos) (B). Por último, los valores de intensidad primas se escalan a la línea de base lineal computarizada (C). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Los resultados representativos de análisis LC_Pro de basal y estimulado Ca 2 + dinámica. Time lapse imágenes de una secuencia de imágenes de entrada de un intervalo de muestreo basal (A, panel izquierdo), seguido de un intervalo de muestreo P estimulada por sustancias (A, panel derecho ) se muestran en escala de grises. Secuencias de imágenes de lapso de tiempo de mejores elipses aptos para basales y estimulados intervalos (B) fueron prestados por LC_pro. Por último, las curvas de intensidad a escala en función del tiempo de cada región posicionado automáticamente de interés (ROI) se muestran (C).
Figura 6. Histogramasde las distribuciones de los parámetros de un experimento representativo (Figura 4). Los histogramas de los parámetros de amplitud de pico (f/f0), la duración de ½ max (seg), y máxima amplitud espacial (m 2), tanto para el control (columna izquierda) y Sustancia P fueron estimuladas (columna derecha) eventos de un experimento representativo rendido usando R para procesar gráficamente la salida de LC_pro. Notablemente, P estimulación de sustancias amplió el número de eventos, y causó un desplazamiento a la derecha significativa en la amplitud y la duración mediana de Mann-Whitney U test (p <0,01).
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Discussion
Descifrando complejos Ca 2 + señales a nivel celular y pluricelular requerirá enfoques experimentales y analíticos rigurosos. Aquí, un enfoque se describe en el cual las secuencias de imagen confocal resueltos de Ca 2 + dependientes de fluorescencia se someten a un análisis automatizado que identifica y cuantifica Ca 2 + señales estadísticamente relevantes dentro de campos celulares intactas en el caso concreto que se presentan, un segmento de la arteria se aisló de corazón de cerdo, con pasador abierto para exponer el endotelio, cargado con el Ca 2 + indicador Fluo-4 de la mañana, se somete a la imagen confocal, y evaluados con el algoritmo personalizado LC_Pro. Este algoritmo está diseñado para 1) detectar y yacimientos de huellas de dinámica Ca 2 + cambio anterior estadística (p <0,01) el ruido, 2) definir regiones de interés (ROI) de forma automática en los centros del sitio activo, y 3) analizar la intensidad media de fluorescencia a ROI para determinar los parámetros de eventos específicos. El enfoquesupera las principales limitaciones de la investigación de señalización biológica mediante la reducción de errores de los usuarios y los prejuicios, lo que reduce el tiempo de análisis fuera de línea, y proporcionar un índice completo de señales a través de un campo de discernir los perfiles representativos o patrones. La salida de LC_Pro se procesa a través de scripts R, proporcionando informes completos de parámetros para los experimentos individuales, incluyendo la salida gráfica de alta calidad.
Varios pasos son importantes para la correcta ejecución de la técnica descrita. El procedimiento de disección de tejido (paso 1.1.1) debe realizarse cuidadosamente para evitar la denudación o daño de la capa de células endoteliales. Además, las secuencias de imágenes deben estar en el formato correcto (paso 2.1) para la región automatizado de algoritmo de interés para que funcione correctamente. Por ejemplo, si hay información de escala asociada con el archivo, regiones de interés serán colocados incorrectamente según las ubicaciones de píxeles, en lugar de la ubicación de la unidad a escala. También, la elección de una re adecuadoregión de diámetro de interés es crítica para realizar correctamente el análisis automatizado de la actividad fluorescente dentro de una secuencia de imágenes. Un valor demasiado pequeño diámetro puede producir mediciones redundantes, mientras que un diámetro demasiado grande dará lugar a la exclusión de las señales sutiles.
Peligros potenciales de esta técnica se refieren principalmente a la sensibilidad del análisis automatizado para xy cambios en secuencias de imágenes grabadas y para señal de saturación y / o de blanqueo, lo que puede dar lugar a resultados positivos falsos o negativos falsos. Derivas o cambios dimensionales pueden ser dirigidas directamente a través del uso de software de registro de pila y la designación exacta de los intervalos en los que se introducen perturbaciones. Niveles de grises y los parámetros de rendimiento de la inversión de diámetro también se pueden optimizar para una preparación determinada antes de la recolección de datos con el fin de estandarizar los conjuntos de datos en bruto.
Debido a que sirve como un enfoque estándar para cualquier señal de fluorescencia dinámica, el análisis descrito hERE es adecuado para un cuerpo diverso de aplicaciones. En la vasculatura, se está empleando este método para definir fisiológica característica y las modalidades de señal fisiopatológicos en múltiples lechos vasculares bajo basal y estimulada condiciones 25,26. También se está aplicando en el seguimiento automatizado de Ca 2 + olas. En última instancia, este tipo de análisis automatizado global será uno de los ejes clave en el desciframiento espacial y temporalmente los bio-señales complejas y en el establecimiento de nuevos modelos de celdas multi-celular y.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado en parte por los Institutos Nacionales de Salud Subvenciones HL-085 887, HL-092992, S10RR027535 y MOP-93676.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection dish | Fisher Sci | #08-772-70 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Fisher Sci | #NC9644388 | elastomer kit, must be molded into dishes |
| HEPES-buffered PSS | Sigma | #H3375-250G | HEPES acid |
| Stereomicroscope | Nikon Inst. | #MNA42000 | |
| Forceps | Fine Science Tools | #11223-20 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Tungsten wire | Scientific Inst Svcs | #406 | |
| Fluo-4 AM | Life Tech. | #F-14201 | |
| Pluronic F-127 | Life Tech. | #P3000MP | |
| Metal pins | Fine Science Tools | #26002-10 | |
| Cover-glass bottom chamber | Custom designed | ||
| Spinning disc confocal microscope | Perkin Elmer | RS-3 | |
| ImageJ software | download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html | ||
| LC_Pro plugin for imageJ | download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html | ||
| R software | download at: http://www.r-project.org/ | ||
| R traceplot script | download at: https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing |
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