siRNA contrôle pour la ubiquitine et les régulateurs du système ubiquitine-comme des voies biologiques dans des cellules de mammifères en culture

Summary

Ici, nous décrivons une méthode pour effectuer un siRNA ciblés écran "ubiquitome" pour identifier de nouveaux régulateurs de l'ubiquitine et ubiquitine de la réponse cellulaire médiée HIF1A à l'hypoxie. Ceci peut être adapté à n'importe quelle voie biologique où une lecture robuste de l'activité du rapporteur est disponible.

Abstract

Modification post-traductionnelle des protéines avec l'ubiquitine et ubiquitine (UBL) molécules est en train de devenir un réseau de signalisation cellulaire dynamique qui régule diverses voies biologiques, y compris la réponse à l'hypoxie, proteostasis, la réponse aux dommages de l'ADN et la transcription. Pour mieux comprendre comment UBL réglementer les filières pertinentes à la maladie humaine, nous avons compilé un siRNA humain "ubiquitome" bibliothèque composée de 1186 siARN piscines duplex ciblant tous connus et prévus des composants de voies du système UBL. Cette bibliothèque peut être projeté contre un éventail de lignées cellulaires exprimant journalistes de diverses voies biologiques pour déterminer quels composants UBL agissent comme régulateurs positifs ou négatifs de la voie en question. Ici, nous décrivons un protocole utilisant cette bibliothèque pour identifier ubiquitome-régulateurs de la réponse cellulaire médiée par HIF1A à l'hypoxie en utilisant un rapporteur de luciférase à base de transcription. Un stade de développement de l'essai initialest effectuée pour établir les paramètres de dépistage appropriés de la lignée cellulaire avant d'effectuer l'écran en trois étapes: dépistage / déconvolution primaire, secondaire et tertiaire. L'utilisation de bibliothèques ciblée sur génome entier de siRNA est de plus en plus populaire car il offre l'avantage de rendre compte uniquement sur les membres de la voie avec laquelle les enquêteurs sont plus intéressés. Malgré les limites inhérentes de dépistage siRNA, en particulier les faux positifs causés par siARN effets hors-cible, l'identification des véritables nouveaux régulateurs des voies en question l'emportent sur ces lacunes, qui peuvent être surmontées par l'exécution d'une série d'expériences de contrôle attentivement entreprises.

Introduction

Modification des protéines avec l'ubiquitine et ubiquitine (UBL) molécules représente un système biochimique expansive qui régule diverses voies biologiques et des réactions de stress. La fixation covalente d'UBL à leurs protéines cibles peut avoir divers effets de régulation de la stabilité, la localisation, la fonction ou interactome du substrat ^1. Les étapes enzymatiques sous-jacents UBL modification ont d'abord été établies pour l'ubiquitine, et maintenant servir de paradigme pour la modification avec la plupart des UBL, y compris SUMO, NEDD8, ISG15 et FAT10. Pour la modification de se produire, le groupe carboxylate de la diglycine UBL motif est d'abord activée par une enzyme activant E1 pour former un thiol de haute énergie qui est transférée à la cystéine du site actif d'une enzyme de conjugaison E2. Le E2 interagit ensuite avec une ligase E3 lié au substrat de servir de médiateur de transfert de la LBM sur (habituellement) un résidu de lysine cible création d'une chaîne ramifiée (isopeptidique) ² tringlerie. Les cycles successifs de modification peuvent se produire pour construire des chaînes isopeptidiques sur le substrat, ce qui peut se produire pour l'ubiquitine à travers l'une de ses sept lysines, ou par l'intermédiaire de sa méthionine N-terminale pour créer des chaînes linéaires d'ubiquitine. Ces modifications font topologies discrètes avec des fins diverses telles que la création de nouveaux motifs d'interaction et le ciblage des protéines pour la dégradation avant l'enlèvement UBL par des protéases spécialisées. Dans le cas de l'ubiquitine E1, il existe deux enzymes, enzymes de conjugaison E2 30 à 40, au moins 600 ligases E3 et environ 100 enzymes deubiquitylating (DUB). Alors que les voies sont moins expansive pour les 10 ou si d'autres UBL, la complexité globale de ubiquitome offre énorme diversité biologique dans le résultat d'une modification UBL particulier. Cependant, alors que des avancées majeures dans UBL biologie ont été faits, les rôles cellulaires précises de la majorité de ces composants ubiquitome restent inconnus.

L'utilisation de short interfering acide ribonucléique (siRNA) a émergé comme un outil puissant pour la génétique inverse en raison de la capacité de siRNA pour cibler spécifiquement ARNm cellulaires pour destruction, permettant le rôle des gènes individuels à examiner dans différents contextes biologiques ^3. Criblage du génome entier ont été utilisés pour identifier et valider de nouveaux régulateurs de nombreux processus cellulaires, et ont créé une foule de données utiles accessibles à la communauté scientifique au sens large. Cependant, alors que les écrans du génome entier ont révélé extrêmement utile, écrans ciblés sont de plus en plus populaires car ils sont moins chers, plus rapides, moins impliquer la gestion de données et de rapport uniquement sur les membres du génome où le chercheur est le plus intéressé. Par conséquent, afin de mieux comprendre les processus cellulaires UBL composants de la famille sont impliqués, nous avons constitué une bibliothèque siRNA humain ciblant tous connus et prévus des composants de la ubiquitome. Cela inclut les UBL, E1, E2 activation des enzymes conjugaisondes enzymes, des ligases E3, domaine de liaison à l'ubiquitine (DLC) contenant des protéines et des DUBs. Cette bibliothèque peut être utilisée pour l'écran contre un large éventail de lignées cellulaires rapporteurs de problèmes biologiques distinctes, permettant ainsi l'identification objective des nouveaux composants de l'UBL régissant ces voies.

Le protocole suivant décrit comment effectuer une rigoureuse siRNA ciblés ubiquitome écran pour identifier de nouveaux régulateurs de la réponse de HIF1A dépendant à l'hypoxie. Sous tension normale d'oxygène, HIF1A est soumise à prolyl hydroxylation qui l'amène à être reconnue et ciblée pour la dégradation par la maladie de Von Hippel Lindau (VHL) E3 complexe ligase ^4. L'hypoxie inhibe l'hydroxylation prolyl conduisant à la stabilisation des HIF1A et sa liaison ultérieure à des éléments de réponse à l'hypoxie (HRE) de conduire l'expression du gène. Ici, nous décrivons un écran à l'aide des cellules d'ostéosarcome U20S exprimant de façon stable la luciférase de luciole sous le contrôle de trois copies en tandem de l'HyResponse Element poxia (cellules U20S-EDH) ^5. Ce protocole peut être adapté pour n'importe quelle voie biologique si un solide lecture de l'activité du rapporteur est réalisable et peut être couplé avec des témoins positifs et négatifs appropriés.

Protocol

1. Phase de démarrage de dosage

Remarque: avant de lancer l'écran de siRNA, un stade de développement de dosage est essentiel de définir des paramètres importants pour le dépistage de la lignée cellulaire rapporteur. Il est essentiel d'investir des efforts importants à ce stade que cette sous-tendra la réussite future de l'écran.

1. Pour caractériser l'hypoxie-réactivité de U20S-EDH lignée cellulaire rapporteur, grandir 2 x 75 ^cm2 de cellules U20S-EDH à 80-90% de confluence dans Dulbecco Modified Eagle (DMEM) supplémenté avec 10% de FBS.
2. Aspirer le support d'un flacon de cellules, laver deux fois avec 10 ml de PBS et détacher les cellules par addition de 2 ml de solution à 0,05% de trypsine-EDTA et incubation à 37 ° C pendant 5 min. Resuspendre les cellules dans 8 ml de DMEM 10% de FBS et de la pipette vers le haut et vers le bas pour créer une suspension cellulaire homogène.
3. Pipette 20 ul de la suspension à une chambre de comptage de cellules, en double exemplaire, et insérez la chambre dans un cou de cellules automatisénter. Cliquez sur "Afficher l'image" sur le logiciel de compteur de cellules et de s'assurer que les cellules sont en discussion. Cliquez sur "comte" et faire une note de la densité cellulaire. Répétez cette opération pour l'autre exemplaire et calculer la densité moyenne des cellules. Diluer les cellules avec du DMEM 10% FBS à une concentration de 60 000 cellules / ml.
4. En utilisant une pipette multicanaux, ajouter 100 pi (6000 cellules) des cellules diluées aux trois mêmes colonnes (par exemple A5-H5, A6-H6 et A7-H7) de 5 plaques à 96 puits essai murs blancs stériles, et le transfert à une humidifié à 37 ° C incubateur à 5% _de CO2 pendant une nuit. Remarque: ces plaques seront utilisés pour déterminer la sortie de la luciférase hypoxie dépend pour une gamme d'expositions de l'hypoxie: 0 h, 2 h, 6 h, 10 h et 24 h.
5. A la fin de la journée suivante, noter l'heure et ajouter la plaque de l'hypoxie de 24 heures à l'ensemble des postes de travail à l'hypoxie 1% d'oxygène. Le lendemain matin, calculer le temps h 10, 6 h et 2 h avant que la plaque de 24 heures devrait être retiré from le poste de travail de l'hypoxie. Pendant ces périodes, ajouter le h 10, 6 h et 2 plaques h à la station de travail de l'hypoxie.
6. Préparer 30 ml de tampon 2x combiné luciférase lyse / dosage (50 mM Tris phosphate pH 7,8, 16 mM _MgCl2, 2 mM DTT, 2% de Triton-X-100, 30% glycérol, 1 mM ATP, 1% de BSA; 0,25 mM luciférine et 8 uM Na ₄ P ₂ O _7). Remarque: ajouter les composants dans l'ordre indiqué et permettre à la BSA au moins 30 min pour dissoudre avant l'addition de luciférine et Na ₄ P ₂ O _7.
7. Retirez toutes les plaques du poste de travail de l'hypoxie au moment opportun. Ajouter 100 ul de tampon de lyse luciférase / test 2x pour les puits appropriés de la plaque d'essai et couvrir avec un film transparent. Secouer les plaques sur un agitateur de plaque pendant 10 minutes à 500 tours par minute pour lyser les cellules à fond.
8. Transférer la pile de plaques à une 96 crémaillère plaque de luminomètre et automatisé. Dans le menu "Protocoles", sélectionnez "abs 595" et mettre en évidence tout wells à lire dans la carte à l'écran plaque sous le menu "bien la sélection". Cliquez sur "Exécuter" pour mesurer la luminescence de chaque puits, puis calculer la valeur moyenne de chaque plaque. Calculer la fois l'augmentation de l'hypoxie-dépendante de l'activité du rapporteur en divisant la valeur moyenne de chaque plaque d'hypoxie par la valeur moyenne de la normoxie (0 h hypoxie) de la plaque de commande. Remarque: il est essentiel d'observer une réponse de la luciférase de l'hypoxie-dépendante robuste pour convenir pour le dépistage. Une augmentation de multipliés par cinq fois dix activité de journaliste est considéré comme excellent.
9. Créer une plaque de commande maître qui contient quatre haut contrôle (HIF1A siARN) répétitions (puits A1-D1), quatre bas contrôle (FIH1 siRNA) réplique (puits A12-D12), quatre tampon ne contrôle répétitions (puits E1-H1) et quatre réplicats de commande de siRNA non-cible (E12-H12), où tous les pools siARN sont à une concentration de 200 nM. Remarque: les contrôles haut et bas sont établis sur la base de la réglementation de la voie connus qui augmentent et decrfaciliter respectivement la réponse à l'hypoxie. En variante, le développement du dosage en utilisant un sous-ensemble de la bibliothèque peut être utilisée pour identifier des contrôles appropriés.
10. En utilisant une pipette multicanaux, transférer 10 pi de chaque siRNA contrôle à blanc plaque d'essai clos stérile. Préparer mélange de transfection de 0,1 pi réactif de transfection dans 10 pi de milieu-sérum réduite (1:100) par puits, et le transfert de 10 pi de mélange de transfection à chaque contrôle bien. Introduire à la pipette de haut en bas rapidement pour mélanger, et laisser la plaque au repos pendant 20-60 minutes pour permettre la formation du complexe transfection.
11. Préparer une suspension cellulaire de 75 000 cellules / ml avec le second flacon de cellules U20S-HRE. En utilisant une pipette multicanaux, ajouter 80 ul (6000 cellules) de la suspension cellulaire à chaque mélange de transfection. Transférer la plaque à un incubateur humidifié à 37 ° C avec 5% _de CO2 pendant 24 heures, puis les transférer à un poste de travail de l'hypoxie pendant encore 24 h et d'effectuer des dosages de la luciférase de la manière décrite dans les étapes 1.6-1.8.
12. Calculer le facteur Z pour les contrôles haut et bas à l'aide de la formule Z = 1 - [3 x (écart-type de contrôle élevé + écart-type de contrôle faible) / (moyenne de haute lutte - moyen de faible contrôle)]. Remarque: une valeur comprise entre 0,5-1 indique un excellent test et devrait être essayé d'obtenir.

2. Écran primaire

Remarque: une fois que ces conditions de base de la phase de développement du test sont en place, l'écran principal peut être effectué en trois exemplaires au format 96 puits plaque en utilisant le protocole suivant.

1. Cultiver 7 x 75 ^cm2 de cellules U20S-HRE à 80-90% de confluence dans du DMEM supplémenté avec 10% v / v de sérum de veau foetal (SVF).
   Note: ce qui suit les étapes 2.2 à 2.13 doivent être effectués le jour 1.
2. Initier la réplication par une préparation d'une plaque de commande maître contenant 200 ul de chaque commande de la manière décrite dans l'étape 1.9 et de décongélation à une série de dilution de la ubiquitome l siRNAIBLIOTHÈQUE pour un minimum de 30 minutes. Remarque: chaque puits contient une piscine de 4 siRNA assemblés en 17 plaques 96 puits avec des colonnes 1 et 12 laissé vide pour les contrôles.
3. Dans une hotte à flux laminaire, l'étiquette (ou code à barres) 17 blancs plaques de dosage à paroi stériles avec des couvercles à partir de numéros de 1 à 17, correspondant à chaque plaque de la série de la bibliothèque siRNA.
4. Centrifuger la plaque de commande maître et le siRNA ubiquitome brièvement bibliothèque (1 min à 2000 xg) pour s'assurer que tous les siRNA s'accumulent au fond du puits.
5. Utilisez un distributeur de liquide automatisé pour "stamp" robot 10 pi de chaque contrôle de la plaque de commande de maître sur les plaques d'essai 17, en utilisant la même pointe pile de 96 puits pour chaque plaque.
6. L'utilisation d'un 96 puits d'empilement pointe douce pour chacune des plaques de la bibliothèque 17, le transfert de 10 ul de chaque siRNA ubiquitome à sa plaque d'essai correspondant en utilisant un distributeur de liquide automatisé.
7. Préparer 40 ml de réactif de transfection pour les plaques d'essai en utilisant le rapport 17 established en 1.10. Remarque: cela inclut un supplément de 20 ml pour tenir compte de la "volume mort" dans le distributeur de cellule. Le «volume mort» désigne le volume de liquide présent en permanence dans le réseau de tubes dans le distributeur de la cellule.
8. Utiliser un distributeur de cellules automatisé pour transférer 10 pi de réactif de transfection à chaque puits dans les plaques de dosage 17. Agiter brièvement les plaques de dosage sur un agitateur (1 min à 500 rpm) pour permettre un mélange intime de siRNA et un réactif de transfection, puis laisser encore à la température ambiante pendant 20 à 60 min pour permettre siRNA: réactif de transfection formation du complexe.
9. Laver deux flacons de 75 ^cm2 de cellules U20S-HRE deux fois avec 10 ml de PBS et détacher avec 2 ml de trypsine-EDTA à 37 ° C pendant 5 min. Ajouter 8 ml de DMEM 10% FBS à chaque flacon et la pipette de haut en bas plusieurs fois pour créer une suspension de cellules homogène. Combiner des cellules des deux flacons et les transférer dans un tube de plastique de 50 ml stérile.
10. Calculer la concentration des cellules par pipetage20 pi de cellules en double exemplaire, à une chambre de comptage de cellules et de calculer la concentration moyenne des cellules à partir de deux mesures d'un compteur de cellules automatisé tel que décrit à l'étape 1.3.
11. Préparer 155 ml de suspension cellulaire par dilution avec du DMEM 10% FBS à une concentration de 75 000 cellules par ml dans un récipient en plastique stérile. Remarque: ce volume est suffisant pour 17 plaques et comprend une 25 ml supplémentaires pour le volume mort dans le distributeur de la cellule.
12. Ajouter un agitateur magnétique stérile à la suspension cellulaire et le placer sur un agitateur mis en place à l'intérieur de la hotte à flux laminaire pour limiter l'agglutination des cellules. Equilibrer le distributeur de cellules automatisé avec la suspension cellulaire et le mettre à distribuer 80 ul de cellules par puits (6000 cellules).
13. Placer chacune des plaques 17, à son tour, sur le distributeur de cellules automatique et distribuer des cellules. Noter l'heure et plaques de cheminée en groupes de 5, puis placez les piles dans un humide 37 ° C incubateur à 5% de CO ₂ pendant 24 heures. Remarque: la concentration finale depiscine de siRNA sera de 20 nM dans 100 pi volume total.
    Note: ce qui suit les étapes 2.14 à 2.15 doivent être effectués le jour 2.
14. Initier la seconde répétition, le jour 2, suivant la procédure décrite dans Jour 1 pour la réplication 1 (02.02 à 02.13).
15. Après 24 heures de transfection, plaques de transfert de répétition 1 dans un environnement stérile à un poste de travail de l'hypoxie fixé à 1% d'oxygène et de laisser pendant 24 heures pour induire le journaliste EDH.
    Note: ce qui suit les étapes 2.16 à 2.20 doivent être effectués le jour 3.
16. Initier la troisième répétition, suivant la procédure décrite dans Jour 1 pour la réplication 1 (02.02 à 02.13).
17. Après 24 heures de transfection, plaques de transfert de répétition 2 dans un environnement stérile à un poste de travail de l'hypoxie fixé à 1% d'oxygène et de laisser pendant 24 heures pour induire le journaliste EDH.
18. Deux heures avant de reproduire une des plaques doivent être retirés de la station de travail de l'hypoxie, de préparer 200 ml de tampon de lyse luciférase 2x / dosage comme décrit au point 1.6. Remarque: ce volumeinclut une période supplémentaire de 20 ml d'assurer le réservoir tampon reste bien couverte.
19. Retirer reproduire une des plaques d'essai à partir du poste de l'hypoxie après une exposition de 24 heures à l'hypoxie et à l'aide d'un distributeur de liquide automatisé, ajouter 100 ul de tampon 2x luciférase lyse / test pour chaque plaque d'essai et couvrir avec un film transparent.
20. Secouer les plaques sur un agitateur de cellules pendant 10 minutes à 500 tours par minute pour lyser les cellules à fond. Transférer chaque plaque à son tour à un lecteur de plaque de luminomètre et enregistrer luminescence comme décrit dans l'étape 1.8.
    Note: ce qui suit les étapes 2.21 à 2.22 doivent être effectués le jour 4.
21. Après 24 heures de transfection, plaques de transfert de répétition 3 dans un environnement stérile à un poste de travail de l'hypoxie fixé à 1% d'oxygène et de laisser pendant 24 heures pour induire le journaliste EDH.
22. Lire la répétition 2 plaques en suivant les étapes 2.18 à 2.20 utilisées pour la réplication 1.
    Remarque: l'étape suivante 2.23 doit être effectuée le jour 5.
23. Lire les répliques 3 plaques en suivantl'étape 2.18 à 2.20 utilisé pour la réplication 1.
24. Compiler tous les 3 répétitions de l'écran principal, et de calculer le facteur Z pour chaque plaque à l'aide de la formule donnée au point 1.12. Remarque: si aucune plaque a un facteur de Z de moins de 0,5, envisager de répéter cette plaque pour améliorer la qualité des données.
25. Calculer le coefficient de variation (CV) pour le haut et les bas des contrôles à l'aide de la formule suivante: 100 x écart-type de contrôle / moyen de contrôle. Remarque: CV doit être aussi faible que possible, il est raisonnable de s'attendre à ce 10 à 15% de variation. Si la variation est nettement plus élevé, envisager de renouveler la plaque.
26. Calculer pour cent activation de chaque siRNA par plaque à l'aide de la formule suivante: [(moyenne de haute lutte - note siRNA) / (moyenne de haute lutte - moyen de faible contrôle)] x 100 En outre, le calcul de la non-cible (NT. ) fois de chaque siRNA en utilisant la formule [Exemple de données / moyen de NT]. Pour les deux activation de pour cent et NT fois, le calcul de la moyenne des trois replicAtes et compiler les valeurs.
27. En utilisant les données brutes, calculer corrélation de rang le coefficient de Spearman (SRCC) pour déterminer dans quelle mesure les trois plaques répétés corrélation en utilisant la formule:
    
    où r = SRCC; d = la différence entre les deux numéros de chaque paire de rangs et n = nombre de paires de données. Remarque: une bonne corrélation entre les répétitions de plaques donnera des valeurs proches de 1 Si une répétition présente une faible SRCC contre les deux autres plaques, d'approfondir et d'envisager de renouveler cette plaque..
28. Décider qui siRNA sont d'un intérêt suffisant pour le dépistage secondaire (jusqu'à 80). Employer offs de coupe définis par l'utilisateur (par exemple, la sélection de tous les siRNA montrant moins de 5% ou plus de 95% d'activation de pour cent, soit moins de 0,5 NT fois ou plus de 1,5 NT fois) ou appliquer la bioinformatique ou le raisonnement de la connaissance à la recherche de groupes de frappe relevant de la même voie UBL. Remarque:normalement, une combinaison de ces approches qui détermine siRNA sont pris en criblage secondaire.

3. L'écran secondaire

Remarque: un écran secondaire de confirmation est réalisée sur la base d'un maximum de 80 siRNA d'intérêt de l'écran principal. Ce numéro peut être facilement réalisée avec chaque réplique plaquée sur une seule plaque de 96 puits de contrôles complets que par l'écran principal (voir 2.2). Il est très utile pour confirmer que les régulateurs identifiés dans l'écran principal suscitent reproductible le même phénotype, et ce sera d'aider à préciser les décisions de triage sur lequel doit être effectuée par le biais de l'écran final tertiaire / de déconvolution Hits.

1. Cultiver 1 x 75 cm ² flacon de cellules U20S-HRE à 80-90% de confluence dans du DMEM avec 10% de FBS.
2. Notez le numéro de plaque et l'emplacement des résultats d'écran primaires, et planifier leur nouvel emplacement sur la cerise écran secondaire ramassé plaque de maître, laissant colonnes 1 and 12 ans gratuit pour les contrôles. Préparer la plaque de maître de contrôle comme dans 1.9 mais avec un volume total de chaque commande de 50 pi.
3. Décongeler une deuxième série de la bibliothèque ubiquitome de dilution (mis de côté pour les piscines de siARN individuels cherry-picking) pour un minimum de 30 minutes. Centrifuger les plaques brièvement (1 min à 2000 xg) puis ajouter 50 ul de siRNA de l'écran secondaire vers leurs nouveaux emplacements de la plaque sur la cerise cueillies plaque de maître.
4. Effectuer l'écran secondaire en utilisant le même protocole de base décrit à l'écran principal avec les modifications suivantes: (a) exécuter tous les trois répétitions, le même jour dans une plaque d'essai par répétition et (b) ajuster les volumes de réactifs en conséquence.

4. L'écran supérieur / de déconvolution

Remarque: le dépistage tertiaire ou déconvolution est effectuée sur un maximum de 20 siRNA de l'écran secondaire. Cette étape est d'examiner l'effet de l'utilisation de chaque siRNA knockdown individu de la poo originalel de quatre. Normalement, au moins deux duplex de siRNA individuels de chaque groupe devraient illicite le même phénotype d'avoir un degré de confiance raisonnable que le phénotype observé n'est pas dû à siARN effets hors-cible. Pour augmenter encore la confiance à ce stade, des duplex de siRNA individuels supplémentaires ciblant le gène en question peuvent être conçus et testés pour leur capacité à induire le phénotype donné. Les résultats de ces expériences peuvent alors être utilisés pour calculer le score de H, où H = 0,6 ou plus (c. où au moins 3 des 5 siRNA individuels susciter le phénotype) est considéré comme acceptable ^6.

1. Cultiver un flacon de 75 ^cm2 de cellules U20S-HRE à 80-90% de confluence dans du DMEM avec 10% de FBS.
2. Créer une carte de plaque pour l'écran supérieur de la planification de l'emplacement des quatre duplex de siRNA spécifiques de chaque coup sur la plaque de maître d'écran supérieur, laissant les colonnes 1 et 12 ans gratuit pour les contrôles. Préparer la plaque de maître de contrôle comme dans 1.9 mais avec un totalvolume de chaque commande de 50 pi.
3. Décongeler les plaques déconvolution / siRNA individu et ajouter 50 ul de siRNA individuels (200 nM) dans chaque puits de la plaque de maître d'écran tertiaire selon le plan de la plaque (4.2) pour permettre à trois x 10 répétitions de pi et un confortable 20 pl excès .
4. Effectuer l'écran supérieur en utilisant le même protocole de base décrit à l'écran principal avec les modifications suivantes: (a) exécuter tous les trois répétitions, le même jour dans une plaque d'essai par répétition et (b) ajuster les volumes de réactifs en conséquence

Note: Idéalement, le seuil de duplex de siRNA individuels devrait être fixé à la même rigueur de coupure que pour la piscine. Cependant, il peut être acceptable de se détendre le seuil de 10-20% pour les siRNA individuels, en particulier là où au moins un autre duplex en deçà du seuil fixé. Il est intéressant de palier à l'esprit que l'effet individuel de siRNA peut être inférieure à celle dela piscine, et à l'inverse, dans certains cas individuels siRNA peut montrer un effet plus fort sur le phénotype cellulaire dans l'isolement que quand il existe dans la piscine (même lorsque la concentration est comptabilisé).

Representative Results

Avant le dépistage, l'hypoxie-réponse des cellules U20S-EDH est établi. Cellules U20S-EDH expriment une construction rapporteur constitué de la luciférase de luciole fusionné en aval de trois copies en tandem de l'élément de réponse à l'hypoxie, qui est lié par l'hétérodimère HIF1A/HIF1B lors de l'exposition à l'hypoxie (figure 1A). Les cellules sont placées dans un poste de travail de l'hypoxie pour une plage de temps pour établir laquelle l'exposition à l'hypoxie produit la réponse la plus efficace pour le dépistage. Cellules U20S expriment des niveaux faibles de HIF2A donc lectures luciférase sont largement tributaires de la stabilisation de HIF1A hypoxie médiation ^7. L'exposition des cellules U20S-EDH à l'hypoxie pour 0 h, 2 h, 4 h, 6 h et 24 h dans les résultats de l'induction d'une hypoxie-dépendante de l'activité luciférase (figure 1B). L'exposition des cellules U20S-EDH à l'hypoxie pendant 24 résultats hr dans une induction ~ 10 fois de l'activité (figure 1B), donc cela représente unen une excellente réponse pour le dépistage du siRNA.

Pour établir des contrôles haut et bas appropriés, siRNA à HIF1A et FIH1 sont utilisés pour inverser transfection de cellules U20S-EDH. Les cellules sont transfectées avec les contrôles pendant 24 h et exposées à une hypoxie pendant encore 24 h avant les essais de luciférase sont effectués. HIF1A siRNA diminue le signal d'hypoxie de 10% environ alors que la FIH1 siRNA améliore le signal d'hypoxie à environ 170% par rapport au siRNA non-cible (figure 2). Ces contrôles donnent lieu à un facteur de Z moyenne de 0,8, ce qui est un excellent résultat pour le criblage. Les paramètres de contrôle ont été mis en place avec succès pour un écran robuste.

L'écran principal est réalisée en format de plaque 96 puits en utilisant le flux de travail montre la figure 3. Contrôle et siRNA de la bibliothèque sont estampillés sur les plaques d'essai (figure 3A), et les cellules U20S-EDH sont transfectées inverse alors jencubated à 37 ° C pendant 24 heures. Les plaques d'essai sont ensuite exposées à une hypoxie pendant 24 heures (figure 3B) avant de dosages de luciférase sont effectués et les données analysées (Figure 3C). l'analyse du contrôle de la qualité de l'écran comprend la détermination du facteur de Z pour chaque plaque, où un facteur de Z au-dessus de 0,5 est souhaitable ^{8, 9.} Le facteur Z est calculée pour chaque plaque de l'écran primaire triple en utilisant la formule de la figure 4A. Les facteurs de Z pour chaque plaque sont visualisés à l'aide d'un diagramme de dispersion, où il peut être vu chaque plaque a un facteur supérieur à 0,5 Z (figure 4B). Calcul du facteur de Z est important car il rend compte à quel point une fenêtre de séparation existe entre les contrôles et peut mettre en évidence des problèmes potentiels avec des plaques d'essai d'écran individuel. Le CV des contrôles haut et bas sont également calculés, et les moyennes sont de 5,95% + / - 0,4 et 8,04% + / - 1,2 respectivement. L'écran principalun élément de distribution de duplex de cARNi formant un continuum entre les commandes basses et hautes. Typiquement, il y aura un nombre approximativement égal de régulateurs positifs et négatifs, avec la majorité des siRNA ayant aucun effet sur ​​le rapporteur (figure 5). Régulateurs d'intérêt sont prises par le biais de dépistage puis tertiaire secondaire d'établir une liste des organismes de réglementation de grande confiance pour l'analyse de suivi et de validation.

Figure 1. Exposition hypoxie induit U20S-EDH rapporteur luciférase. (A) Schéma représentant la construction hypoxie rapporteur dans des cellules U20S-EDH utilisés pour le dépistage siRNA. Trois copies en tandem de l'élément de réponse à l'hypoxie (HRE) sont liés par l'hétérodimère HIF1A/HIF1B à conduire le eXpression de la luciférase de luciole. (B) L'augmentation de l'exposition des cellules U20S-EDH à 2 h, 6 h, 10 h et 24 h aux résultats de l'hypoxie dans des quantités de l'activité de la luciférase de reporter l'augmentation. 24 h hypoxie résultats d'exposition de ~ 10 fois plus en activité luciférase par rapport à 0 h contrôle (de normoxie). Barres d'échelle représentent l'erreur standard de la moyenne.

Figure 2. Mise en place des contrôles haut et bas siARN pour le dépistage. Cellules U20S-EDH reverse transfectées avec le siRNA à HIF1A (faible contrôle) et FIH1 (contrôle élevé) baisse et augmentent la réponse à 24 h exposition à l'hypoxie respectivement. Ces contrôles donnent un facteur de 0,8 de Z, qui est considéré comme un excellent score pour le criblage. L'effet de la non-cible (NT) siRNA est indiqué pourcomparaison. Les barres d'erreur représentent les erreurs types de la moyenne.

Figure 3. Dépistage flux de travail pour identifier des régulateurs de la réponse HIF1A hypoxie. (A) Disposition des plaques à 96 puits pour le dépistage siRNA. siRNA de contrôle sont estampillés sur les colonnes à l'extérieur comme indiqué et la bibliothèque siRNA ubiquitome est estampillé sur les colonnes internes, réparties sur 17 planches. Cellules U20S-EDH sont inverse-transfectées et incubées à normoxie pendant 24 heures. (B) Les piles de plaques d'essai sont transférés dans un environnement stérile à un poste de travail de l'hypoxie fixé à 1% d'oxygène pendant 24 heures. (C) Les plaques sont retirées de la station de travail de l'hypoxie et de l'activité de la luciférase dosages sont effectués sur toutes les plaques de dosage. La luminescence estenregistrée sur un luminomètre et l'analyse des données réalisée pour établir l'activité du rapporteur de cellules transfectées avec chacune des bibliothèques de siRNA.

Le contrôle de qualité figure 4. Est effectuée en calculant le facteur de Z de chaque plaque. (A) Le facteur Z pour chaque plaque est calculée en utilisant la formule donnée, où s représente l'écart-type, m représente la moyenne, p le témoin positif et n le témoin négatif. (B) Diagramme de dispersion afficher le facteur de Z calculée de chaque plaque de trois répétitions de l'écran de ubiquitome. Un seuil de coupure de 0,5 est appliqué, et dans ce cas toutes les plaques afficher un facteur Z> 0,5, et par conséquent passer le contrôle de la qualité.

Figure 5. Graphique montrant la répartition de la bibliothèque siRNA. Graphique affichant la fréquence de siRNA de l'écran de siRNA ubiquitome triple qui aboutissent à l'activation de pour cent correspondant. Contrôles basses et hautes sont à 0% et 100% respectivement. La bibliothèque siRNA est uniformément répartie entre la commande haut et bas, de sorte que la majorité des siRNA n'ont aucun effet sur le phénotype cellulaire. Une petite proportion de siRNA sont observées pour augmenter et diminuer la réponse, et représentent donc les nouveaux régulateurs potentiels de la voie.

Discussion

L'utilisation d'écrans de siRNA du génome dans les cellules de mammifères s'est avérée extrêmement utile dans l'identification de nouveaux régulateurs de voies biologiques distinctes. Ici, nous avons décrit l'utilisation d'un écran de siRNA ciblé ubiquitome pour identifier des régulateurs de la réponse cellulaire médiée par HIF1A à l'hypoxie. Écrans ciblés sont de plus en plus attrayant car ils sont généralement moins cher, plus rapide, plus facile à gérer et rapport uniquement sur ​​les composants de la voie dans laquelle les enquêteurs s'intéressent ^{7, 10, 11.}

Il est essentiel de mettre un effort important dans la phase de développement de dosage pour assurer le journaliste de la cellule de base est adapté pour le dépistage, et que la reproductibilité et faible variabilité peut être atteint. Il est également important de sélectionner des contrôles robustes positifs et négatifs pour créer une fenêtre de séparation à l'intérieur de laquelle les organismes de réglementation de la bibliothèque vont tomber. En outre, ceux-ci agissent en tant que contrôle interne de chaque plaque de dosage d'l'écran permettant l'identification rapide des problèmes avec des assiettes individuelles.

Un problème commun dans criblage à haut débit est l'apparition d'effets de bord de la plaque, qui peut être causée par une différence d'humidité locale dans les puits à l'extérieur de la plaque par rapport aux puits internes. Avoir les contrôles appropriés en place et la création d'une carte de chaleur de la sortie de la plaque peut aider à identifier ce problème. Nous avons découvert que les effets de bord peuvent être surmontés en utilisant du papier de soie humide à la base des plaques, et à placer un sac en plastique rigide et transparent au-dessus de la pile de plaques pour rendre le micro-environnement de chaque plaque à l'intérieur de l'incubateur plus encore.

Une limitation de dépistage siRNA est la présence de faux positifs et de faux négatifs. Les faux négatifs peuvent se produire en raison d'un certain nombre de facteurs, y compris effet de choc insuffisante de l'ARNm correspondant, ou la capacité de l'ARNm résiduelle de produire suffisamment acteive protéine de s'acquitter efficacement de sa fonction. Faux positifs sont plus problématiques, car ils peuvent causer un enquêteur à investir beaucoup de temps suite à un coup qui ne peuvent pas gouverner effectivement la voie en question. Faux-positifs peuvent être générés par un certain nombre de mécanismes, y compris par l'intermédiaire de siRNA effets hors-cible. C'est là que le siRNA renverse non seulement l'ARNm en question, mais également d'autres cibles non identifiées qui sont les véritables régulateurs de la voie ^{12, 13.} Un certain nombre d'approches sont couramment utilisée et acceptée comme la confirmation que le phénotype observé est un vrai résultat de frapper bas du gène cible en question ^14. Par exemple, le problème des effets hors cible peut être surmontée en partie par tamisage tertiaire, grâce à quoi la probabilité de plus d'un individu à partir de siRNA de la piscine à partir de quatre avec les mêmes effets hors cible est diminué. En outre, la réalisation avec succès des expériences de sauvetage avec le siRNA-résistantADNc correspondant au résultat également d'exclure des effets hors-cible. Il convient de noter que cette approche n'est pas en soi sans réserves, par exemple des protéines exogènes surexprimés ne seront pas nécessairement agir de façon identique à son homologue endogène due à la stoechiométrie altération des complexes pertinents ou perturbé modifications post-traductionnelles etc Une approche alternative pour frapper validation donc est de générer ou d'acquérir KO ou knock-in des lignées de cellules correspondant aux résultats, et de déterminer si ces lignées cellulaires affichent le même phénotype que le knockdown siARN. Ainsi, les limites du dépistage siRNA peuvent être surmontés avec attention suivi expérimental. En outre, l'identification objective des véritables modificateurs des voies sous la loupe emporte de loin sur les problèmes liés à potentiellement des faux positifs.

En résumé, le dépistage siRNA avec un "ubiquitome" base de données siRNA ciblé est un powerfméthode ul d'identifier de nouveaux membres de l'ubiquitine et des modificateurs de ubiquitine régulation des voies biologiques distinctes. Le protocole décrit ici peut être appliqué à tout problème biologique s'il existe un solide lecture de l'activité du rapporteur. La liste définitive des haut confiance frappe de l'écran représente le point de lieu pour établir le mécanisme de base de la façon dont chaque coup régit la filière en question de départ. En fin de compte, cela va ajouter à la connaissance de plus en plus de la façon dont l'ubiquitine et ubiquitine modificateurs régulent les voies biologiques distinctes.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automated Liquid Dispenser	Fluid-X	XPP-721	http://www.fluidx.eu/BIOTRACK/xpp-721-liquid-handling-system.html
White Walled Assay Plate	Greiner Bio One	655083	http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/37_11/13221/
Clear Plate Film	Perkin Elmer	1450-461	http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Product/ID/1450-461
siRNA library	Thermo Scientific	On-Target Plus	http://www.thermoscientificbio.com/rnai-and-custom-rna-synthesis/sirna/on-targetplus-sirna/search-gene/
Transfection reagent	Invitrogen	Lipofectamine RNAimax	http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Transfection-Selection/lipofectamine-rnaimx.html
Reduced Serum Medium	Invitrogen	Optimem	http://products.invitrogen.com/ivgn/product/31985062?ICID=search-product
DMEM	Invitrogen	41965-039	http://products.invitrogen.com/ivgn/product/41965039#
FBS	Invitrogen	16000-044	https://products.invitrogen.com/ivgn/product/16000044?ICID=search-product#
Tryspin-EDTA	Invitrogen	25300-054	https://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300054?ICID=search-product#