siRNA screening per identificare ubiquitina e ubiquitina-come regolatori del sistema di percorsi biologici in cellule di mammifero coltivate

Summary

Qui, descriviamo una metodologia per eseguire un siRNA mirato "ubiquitome" schermo per identificare nuovi ubiquitina e regolatori ubiquitina-simile della risposta cellulare HIF1a-mediata all'ipossia. Questo può essere adattata a qualsiasi percorso biologico in cui una lettura robusto di attività di giornalista è disponibile.

Abstract

Modificazione post-traslazionale di proteine ​​con ubiquitina e ubiquitina-come molecole (UBLs) sta emergendo come una rete di segnalazione cellulare dinamica che regola diverse vie biologiche, tra cui la risposta all'ipossia, proteostasis, la risposta al danno al DNA e la trascrizione. Per capire meglio come UBLs regolano i percorsi relativi alla malattia umana, abbiamo compilato una siRNA umano "ubiquitome" biblioteca composta da 1.186 siRNA piscine su due piani destinati a tutti noti e previsti componenti dei percorsi del sistema UBL. Questa libreria può essere proiettato contro una serie di linee cellulari esprimenti reporter di diverse vie biologiche per determinare i componenti UBL agiscono come regolatori positivi o negativi della via in questione. Qui, descriviamo un protocollo che utilizza questa libreria per identificare ubiquitome-regolatori della risposta cellulare HIF1a-mediata all'ipossia utilizzando un reporter luciferasi basato trascrizione. Una fase di sviluppo iniziale di analisiviene eseguita per stabilire parametri di schermatura della linea cellulare prima di eseguire lo schermo in tre fasi: di screening / deconvoluzione primaria, secondaria e terziaria. L'uso di mirata su intere librerie genoma siRNA sta diventando sempre più popolare in quanto offre il vantaggio di notifica solo per i membri del percorso con cui i ricercatori sono più interessati. Nonostante i limiti intrinseci dello screening siRNA, in particolare falsi positivi causati da siRNA effetti off-target, l'identificazione di veri e propri nuovi regolatori dei percorsi in questione superano queste carenze, che possono essere superati eseguendo una serie di esperimenti di controllo con attenzione intraprese.

Introduction

Modifica delle proteine ​​con ubiquitina e ubiquitina-come molecole (UBLs) rappresenta un sistema biochimico espansiva che regola diverse vie biologiche e risposte allo stress. L'attacco covalente di UBLs alle loro proteine ​​bersaglio può avere vari risultati che regolano la stabilità, localizzazione, funzione o interattoma del substrato ^1. I passaggi enzimatici sottostanti modifica UBL sono stati stabiliti in primo luogo per ubiquitina, e ora servono come paradigma per la modifica con la maggior parte UBLs, tra cui SUMO, NEDD8, ISG15 e FAT10. Per modifica si verifichi, il gruppo carbossilato del diglycine motivo LBM viene prima attivato da un enzima attivando E1 a formare un tiolo ad alta energia che viene trasferita al sito attivo di un enzima cisteina coniugare E2. Il E2 poi interagisce con un substrato con associazione E3 ligasi di mediare trasferimento della LBM su (di solito) un residuo di lisina bersaglio creando una catena ramificata (isopeptide) linkage ². Cicli successivi di modifica può verificarsi per costruire catene isopeptide sul substrato, che per ubiquitina può avvenire attraverso uno dei suoi sette lisine, o attraverso la metionina N-terminale per creare catene di ubiquitina lineari. Queste modifiche formano topologie discrete con finalità diverse come la creazione di nuovi motivi di interazione e di targeting delle proteine ​​per la degradazione prima della rimozione UBL da proteasi specializzati. Nel caso di ubiquitina ci sono due enzimi E1, E2 30-40 enzimi coniugando, almeno 600 E3 ligasi e circa 100 enzimi deubiquitylating (Dubs). Mentre le vie sono meno espansiva per gli altri 10 o giù di lì UBLs, complessità generale ubiquitome offre grande diversità nel risultato biologico di una modifica particolare UBL. Tuttavia, mentre sono stati compiuti importanti progressi nella UBL biologia, i ruoli cellulari precise della maggior parte di questi componenti ubiquitome rimangono sconosciute.

L'uso di short intacido ribonucleico erfering (siRNA) è emersa come un potente strumento in genetica inversa a causa della capacità di siRNA per indirizzare specificamente mRNA cellulari per la distruzione, consentendo il ruolo dei singoli geni da esaminare in contesti biologici differenti ^3. Schermi genoma interi sono stati utilizzati per identificare e validare nuovi regolatori di molti processi cellulari, e hanno creato una grande quantità di dati utili accessibili alla più ampia comunità scientifica. Tuttavia, mentre gli schermi intero genoma si sono dimostrati estremamente utili, schermi mirati stanno diventando sempre più popolari come sono più economici, più veloci, coinvolgere meno la gestione dei dati e la relazione solo sui membri del genoma in cui il ricercatore è più interessati. Pertanto, per capire meglio quali componenti della famiglia processi cellulari UBL sono coinvolti in, abbiamo compilato una libreria siRNA umano mira tutti noti e previsti componenti del ubiquitome. Questo include i UBLs, E1, E2 enzimi attivatori coniugandoenzimi, ligasi E3, ubiquitina-legame dominio (UBD) contenenti proteine ​​e dubs. Questa libreria può essere usata per schermo contro un'ampia gamma di linee cellulari giornalista di problemi biologici distinti, permettendo così l'identificazione corretto di componenti UBL nuovi disciplinano queste vie.

Il protocollo che segue descrive come eseguire un rigoroso siRNA mirato ubiquitome schermo per identificare nuovi regolatori della risposta HIF1a-dipendente all'ipossia. Sotto tensione normale di ossigeno, HIF1a è soggetto a idrossilazione prolyl che induce a essere riconosciuto e mirato per la degradazione da parte del Von Hippel Lindau (VHL) E3 ligasi complesso ^4. Ipossia inibisce idrossilazione prolyl porta alla stabilizzazione di HIF1a e il suo successivo legame ad elementi di risposta ipossia (HRES) per guidare l'espressione genica. Qui, descriviamo uno schermo mediante cellule di osteosarcoma U20S che esprimono stabilmente lucciola luciferasi sotto il controllo di tre copie tandem del Hypoxia Response Element (cellule U20S-HRE) ^5. Questo protocollo può essere adattato per qualsiasi via biologica se un robusto lettura di attività di giornalista è realizzabile e può essere accoppiato con appropriati controlli positivi e negativi.

Protocol

1. Assay Fase di sviluppo

Nota: prima di iniziare la schermata siRNA, una fase di sviluppo di analisi è fondamentale per impostare i parametri importanti per lo screening con la linea cellulare giornalista. È essenziale investire sforzo significativo in questa fase, questo sosterrà il futuro successo della schermata.

1. Per caratterizzare l'ipossia-reattività del U20S-HRE linea cellulare giornalista, crescere 2 x 75 cm ² flaconi di cellule U20S-HRE al 80-90% di confluenza in Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% FBS.
2. Aspirare il supporto da un pallone di cellule, lavate due volte con 10 ml di PBS e staccare cellule aggiungendo 2 ml di 0,05% soluzione di tripsina-EDTA e incubando a 37 ° C per 5 min. Risospendere le cellule in 8 ml DMEM 10% FBS e pipetta su e giù per creare una sospensione cellulare omogenea.
3. Pipettare 20 ml di sospensione ad una camera di conteggio delle cellule, in duplicato, e inserire la camera in un cou cella automatizzatanter. Fare clic su "Visualizza immagine" sul software bancone cellulare e assicurarsi che le cellule sono a fuoco. Fare clic su "Count" e prendere nota della densità cellulare. Ripetere questa operazione per l'altro duplicato e calcolare la densità media cella. Diluire le cellule con DMEM 10% FBS ad una concentrazione di 60.000 cellule / ml.
4. Usando una pipetta multicanale, aggiungere 100 ml (6.000 cellule) delle cellule diluite agli stessi tre colonne (ad es A5-H5, H6 e A6-A7-H7), della 5 a 96 pozzetti piastre sterili bianche pareti saggio, e il trasferimento di un umidificata 37 ° C incubatore al 5% di CO ₂ durante la notte. Nota: queste piastre saranno utilizzati per determinare la potenza luciferasi ipossia-dipendente per una serie di esposizioni ipossia: 0 ore, 2 ore, 6 ore, 10 ore e 24 ore.
5. Alla fine del giorno seguente, nota del tempo e aggiungere la piastra ipossia 24 ore al set workstation ipossia al 1% di ossigeno. La mattina seguente, calcolare il tempo di 10 ore, 6 ore e 2 ore prima della piastra di 24 ore è dovuto essere rimosso from la workstation ipossia. In questi momenti, aggiungere 10 ore, 6 ore e 2 piastre hr alla workstation ipossia.
6. Preparare 30 ml di 2x combinato tampone di luciferasi lisi / dosaggio (50 mM Tris fosfato pH 7.8, 16 mM MgCl _2, 2 mM DTT, 2% Triton-X-100, il 30% di glicerolo, 1 mM ATP, 1% BSA, 0,25 mm luciferina e 8 mM Na ₄ P ₂ O _7). Nota: aggiungere i componenti nell'ordine indicato e permettere la BSA almeno 30 minuti per sciogliere prima dell'aggiunta di luciferina e Na ₄ P ₂ O _7.
7. Rimuovere tutte le piastre dalla workstation ipossia al momento opportuno. Aggiungere 100 ml di 2x tampone di luciferasi lisi / dosaggio nei rispettivi pozzetti della piastra di analisi e coprire con pellicola trasparente. Agitare le piastre su un agitatore per 10 min a 500 rpm per lisare le cellule accuratamente.
8. Trasferire lo stack piastra per un sistema automatico 96 e scolapiatti luminometro. Sotto il menu "Protocolli", selezionare "abs 595" ed evidenziare tutti welLS da leggere nella piastra mappa su schermo sotto il menu "bene di selezione". Fare clic su "run" per misurare la luminescenza di ogni bene quindi calcolare il valore medio di ogni piatto. Calcolare l'ipossia-dipendente fold-aumento dell'attività giornalista dividendo il valore medio di ogni piatto ipossia dalla lettura media del normoxia (0 hr ipossia) piastra di controllo. Nota: è essenziale osservare una robusta risposta luciferasi ipossia-dipendente per essere adatto per lo screening. Un metro e ottanta volte maggiore nell'attività giornalista è considerato eccellente.
9. Creare una piastra di controllo master che contiene quattro elevato controllo (HIF1a siRNA) replicati (pozzi A1-D1), quattro basso controllo (FIH1 siRNA) replica (pozzi A12-D12), quattro buffer di controllare solo repliche (pozzi E1-H1) e quattro replicati non bersaglio controllo siRNA (E12-H12), dove tutte le piscine siRNA sono ad una concentrazione di 200 nM. Nota: i controlli alti e bassi sono stabiliti sulla base di regolatori di via noti che aumentano e Decrfacilitare la risposta all'ipossia, rispettivamente. In alternativa, lo sviluppo di analisi utilizzando un sottoinsieme della libreria può essere utilizzato per identificare un adeguato controllo.
10. Usando una pipetta multicanale, trasferire 10 ml di ogni siRNA controllo per un piatto bianco test murato sterile. Preparare mix trasfezione di 0,1 microlitri di reagente di trasfezione in 10 microlitri di medio-siero ridotta (1:100) per bene, e il trasferimento di 10 ml di miscela di trasfezione ad ogni controllo bene. Pipetta su e giù brevemente per mescolare e lasciare la piastra a riposo per 20-60 minuti per consentire trasfezione formazione del complesso.
11. Preparare una sospensione cellulare di 75.000 cellule / ml con il secondo pallone di cellule U20S-HRE. Usando una pipetta multicanale, aggiungere 80 ml (6.000 cellule) della sospensione di cellule per ogni miscela di trasfezione. Trasferire la piastra ad un incubatore umidificato a 37 ° C con 5% di CO ₂ per 24 ore, quindi trasferirli su una workstation ipossia per altre 24 ore ed eseguire saggi di luciferasi come descritto ai punti 1.6-1.8.
12. Calcolare il Z-factor per i controlli di alti e bassi con la formula Z = 1 - [3 x (deviazione standard elevato controllo + deviazione standard di controllo basso) / (media di elevato controllo - medio bassa di controllo)]. Nota: un valore compreso fra 0,5-1 indica un saggio eccellente e dovrebbe essere adoperata per.

2. Schermata Principale

Nota: una volta che queste condizioni di base dalla fase di sviluppo di analisi sono in atto, la schermata principale può essere eseguita in triplicato in 96 formato micropiastre utilizzando il seguente protocollo.

1. Grow 7 x 75 cm ² fiaschi di cellule U20S-HRE al 80-90% di confluenza in DMEM supplementato con 10% v / v di siero fetale bovino (FCS).
   Nota: I seguenti passaggi 2,2-2,13 devono essere effettuate il giorno 1.
2. Avviare la replica 1 preparando una piastra di controllo master contenente 200 ml di ogni controllo come descritto al punto 1.9 e lo scongelamento una serie di diluizioni del siRNA ubiquitome library per un minimo di 30 min. Nota: ogni pozzetto contiene un pool di 4 siRNA assemblate in 17 piastre x 96 pozzetti con colonne 1 e 12, lasciato vuoto per i controlli.
3. In una cappa a flusso laminare, etichetta (o codice a barre) 17 bianchi piastre di saggio murate sterili con coperchi dai numeri 1-17, corrispondente a ciascuna piastra della serie biblioteca siRNA.
4. Centrifugare la piastra di controllo master e il siRNA ubiquitome brevemente biblioteca (1 min a 2.000 xg) per garantire a tutti siRNA accumulano sul fondo del pozzo.
5. Utilizzare un dosatore automatico di robot "stamp" 10 ml di ogni controllo dalla piastra di controllo master sulle piastre di saggio 17, utilizzando la stessa pila punta 96 pozzetti per ciascuna piastra.
6. Utilizzando un fresco 96 pozzetti pila punta per ciascuna delle piastre di biblioteca 17, trasferimento 10 ml di ogni ubiquitome siRNA alla sua piastra di saggio corrispondente utilizzando un dosatore automatico.
7. Preparare 40 ml di reagente di trasfezione per i 17 piastre di saggio utilizzando i es rapportofermati in in 1.10. Nota: questo include altri 20 ml per spiegare il "volume morto" nel dispenser cella. Il "volume morto" si riferisce al volume di liquido continuamente presente all'interno della rete tubo nel dispenser cella.
8. Utilizzare il distributore automatico cella per trasferire 10 ml di reagente di trasfezione in ciascun pozzetto in piastre di saggio 17. Brevemente agitare le piastre di saggio su un agitatore (1 min a 500 rpm) per consentire un'accurata miscelazione di siRNA e reagente di trasfezione, poi lasciare ancora a temperatura ambiente per 20-60 minuti per consentire siRNA: reagente di trasfezione formazione del complesso.
9. Lavare due 75 centimetri ² fiaschi di cellule U20S-HRE due volte con 10 ml di PBS e staccare con 2 ml di tripsina-EDTA a 37 ° C per 5 min. Aggiungere 8 ml di DMEM 10% FBS ad ogni pallone e pipetta su e giù parecchie volte per creare una sospensione cellulare omogenea. Unire le celle di entrambe le boccette e trasferire a una sterile tubo di plastica da 50 ml.
10. Calcolare la concentrazione di cellule pipettando20 celle microlitri in duplicato in una camera di conteggio delle cellule e calcolare la concentrazione media di cella da due letture di un contatore automatico cella come descritto al punto 1.3.
11. Preparare 155 ml di sospensione cellulare diluendo con DMEM 10% FBS ad una concentrazione di 75.000 cellule per ml in un contenitore di plastica sterile. Nota: questo volume è sufficiente per 17 piastre e comprende ulteriori 25 ml di volume morto nel dispenser cella.
12. Aggiungere un agitatore magnetico sterile alla sospensione cellulare e posto su un agitatore allestito all'interno della cappa a flusso laminare per limitare aggregazione delle cellule. Equilibrare il dispenser cellulare automatizzata con la sospensione cellulare e impostarlo per erogare 80 ml di cellule per pozzetto (6.000 celle).
13. Posizionare ciascuna delle 17 piastre, a sua volta, al dispenser cella automatizzata e dispensare cellule. Registrare il tempo e le piastre dello stack in gruppi di 5 quindi inserire pile in un umido 37 ° C incubatore al 5% di CO ₂ per 24 ore. Nota: la concentrazione finale dipiscina siRNA sarà 20 nM in 100 microlitri di volume totale.
    Nota: Le seguenti operazioni 2,14-2,15 devono essere effettuate nel Day 2.
14. Avviare la seconda replica il giorno 2, seguendo la procedura descritta nel Day 1 per la replica 1 (2,2-2,13).
15. Dopo 24 ore di trasfezione, piastre di trasferimento di replica 1 in un ambiente sterile a una workstation ipossia fissati al 1% di ossigeno e lasciare per 24 ore per indurre il reporter HRE.
    Nota: Le seguenti operazioni 2,16-2,20 dovrebbe essere effettuata il giorno 3.
16. Avviare la terza replica, seguendo la procedura descritta nel Day 1 per la replica 1 (2,2-2,13).
17. Dopo 24 ore di trasfezione, piastre di trasferimento di replica 2 in un ambiente sterile a una workstation ipossia fissati al 1% di ossigeno e lasciare per 24 ore per indurre il reporter HRE.
18. Due ore prima replicano 1 piastre devono essere rimossi dalla workstation ipossia, preparare 200 ml di tampone di lisi 2x luciferasi / dosaggio come descritto al punto 1.6. Nota: questo volume inle aderiscono ulteriori 20 ml di garantire serbatoio tampone rimane ben coperto.
19. Rimuovere replicare 1 piastre di saggio dalla stazione di lavoro di ipossia dopo l'esposizione 24 ore ipossia e con un dosatore automatico, aggiungere 100 ml di tampone 2x luciferasi lisi / dosaggio per ogni piatto dosaggio e coprire con pellicola trasparente.
20. Agitare le piastre su un agitatore cella per 10 min a 500 rpm per lisare le cellule accuratamente. Trasferire ogni piatto, a sua volta a un lettore di piastre luminometro e registrare luminescenza come descritto al punto 1.8.
    Nota: Le seguenti operazioni 2,21-2,22 devono essere effettuate il giorno 4.
21. Dopo 24 ore di trasfezione, piastre di trasferimento di replica 3 in un ambiente sterile a una workstation ipossia fissati al 1% di ossigeno e lasciare per 24 ore per indurre il reporter HRE.
22. Leggi la replica 2 piastre seguendo i passaggi 2,18-2,20 utilizzati per replicare 1.
    Nota: la seguente operazione 2.23 deve essere effettuata il giorno 5.
23. Leggi le ripetute 3 piastre seguendopasso 2,18-2,20 utilizzato per replicare 1.
24. Compilare tutte e 3 le repliche dello schermo primario e calcolare il fattore Z per ogni piastra utilizzando la formula di cui al 1.12. Nota: se ogni piastra ha un fattore Z inferiore a 0,5, considerare ripetendo questa piastra per migliorare la qualità dei dati.
25. Calcolare il coefficiente di variazione (CV) per l'alta e la bassa controlli utilizzando la seguente formula: 100 x deviazione standard di controllo / media di controllo. Nota: CV deve essere il più basso possibile, è ragionevole aspettarsi che il 10-15% di variazione. Se la variazione è significativamente più elevata, considerare ripetendo la piastra.
26. Calcola cento attivazione di ogni siRNA per piastra utilizzando la seguente formula: [(media di elevato controllo - punteggio siRNA) / (media di elevato controllo - medio bassa di controllo)] x 100 Inoltre, calcolare il non-target (NT. )-fold di ogni siRNA utilizzando la formula [dati / medio di NT Esempio]. Sia per l'attivazione cento e NT-piega, calcolare la media dei tre ReplicAtes e compilare i valori.
27. Utilizzando i dati grezzi, calcolare Classificato Coefficiente di correlazione di Spearman (SRCC) per determinare quanto strettamente le tre piastre replicati in correlazione con la formula:
    
    dove r = SRCC; d = differenza tra i due numeri in ciascuna coppia di ranghi e n = numero di coppie di dati. Nota: una buona correlazione tra le repliche piastra darà valori prossimi a 1 Se una replica mostra partire SRCC contro gli altri 2 piastre, approfondire e considerare ripetere quel piatto..
28. Decidere quali siRNA sono di sufficiente interesse per lo screening secondario (fino al 80). Impiegare cut off definite dall'utente (ad esempio, la selezione di tutti i siRNA mostrano meno del 5% o oltre il 95% per cento di attivazione, o inferiore a 0,5 NT volte o più di 1,5 NT-fold) o applicare la bioinformatica o ragionamento basato sulla conoscenza per la ricerca di cluster di colpisce rientrano la stessa via UBL. Nota:normalmente, una combinazione di questi approcci determina quale siRNA sono presi in screening secondario.

3. Schermo secondario

Nota: una schermata di conferma secondario è effettuata sulla base di un massimo di 80 siRNA di interesse dalla schermata principale. Questo numero può essere convenientemente con ciascun replicato placcato su una singola piastra a 96 pozzetti con i comandi completi come da schermata principale (vedi 2.2). E 'molto utile per confermare che le autorità di regolamentazione individuati nella schermata principale riproducibile suscitano lo stesso fenotipo, e questo aiuterà ad affinare le decisioni di triage su cui risultati dovrebbero essere effettuati fino alla schermata finale terziaria / deconvoluzione.

1. Grow 1 x 75 cm ² boccetta di cellule U20S-HRE al 80-90% di confluenza in DMEM con 10% FBS.
2. Prendere nota del numero di targa e la posizione dei colpi dello schermo primario, e pianificare la loro nuova posizione sullo schermo secondario ciliegia raccolto piatto principale, lasciando colonne 1 and 12 gratuito per i controlli. Preparare la piastra di controllo master come in 1.9 ma con un volume totale di ogni controllo di 50 microlitri.
3. Scongelare una seconda serie di diluizioni della biblioteca ubiquitome (mettere da parte per i singoli piscine siRNA-cherry picking) per un minimo di 30 min. Centrifugare la piastre brevemente (1 min a 2.000 xg), quindi aggiungere 50 ml di i siRNA schermo secondario per le loro nuove posizioni piastra sulla ciliegia scelto piastra master.
4. Effettuare lo schermo secondario utilizzando lo stesso protocollo di base delineato per la schermata principale con le seguenti modifiche: (a) eseguire tutti e tre repliche nella stessa giornata in una piastra di saggio per ogni replica e (b) regolare i volumi di reagenti di conseguenza.

4. Terziario Deconvolution Schermo /

Nota: lo screening terziaria o deconvoluzione viene eseguita su un massimo di 20 siRNA dallo schermo secondario. Questo passo è quello di esaminare l'effetto di knockdown con ogni singolo siRNA dalla cacca originalel di quattro. Normalmente, almeno due duplex siRNA individuali di ogni pool dovrebbero illecito lo stesso fenotipo di avere un ragionevole grado di fiducia che il fenotipo osservato non è dovuta a siRNA effetti off-target. Per aumentare ulteriormente la fiducia in questa fase, individuali supplementari duplex siRNA rivolti al gene in questione possono essere progettati e testati per la loro capacità di suscitare il fenotipo dato. I risultati di questi esperimenti possono quindi essere utilizzati per calcolare il punteggio H, dove H = 0,6 o superiore (cioè dove almeno 3 su 5 siRNAs singoli suscitare il fenotipo) è considerato accettabile ^6.

1. Crescere un 75 centimetri ² fiasco di cellule U20S-HRE al 80-90% di confluenza in DMEM con 10% FBS.
2. Creare una mappa piastra per lo schermo superiore pianificando la posizione dei quattro duplex siRNA individuali di ciascun colpo sul piatto maestro schermo superiore, lasciando colonne 1 e 12, gratuito per i controlli. Preparare il piatto principale di controllo come in 1.9, ma con un totalevolume di ciascuna controllo di 50 microlitri.
3. Scongelare le piastre deconvolution / siRNA individuale e aggiungere 50 ml di singoli siRNA (200 Nm) in ciascun pozzetto della piastra maestro schermo terziaria secondo la mappa piastra (4.2) per consentire tre x 10 replicati microlitri e un comodo eccesso di 20 microlitri .
4. Effettuare la schermata terziaria utilizzando lo stesso protocollo di base delineato per la schermata principale con le seguenti modifiche: (a) eseguire tutte e tre le repliche nello stesso giorno in una piastra di saggio per ogni replica e (b) adeguare i volumi di reagenti di conseguenza

Nota: Idealmente la soglia per i singoli duplex siRNA deve essere impostato alla stessa rigorosità cut-off come per la piscina. Tuttavia, può essere accettabile per rilassare la soglia del 10-20% per i singoli siRNA, specialmente dove almeno un'altra duplex rientra nella soglia impostata. È cuscinetto pena ricordare che l'effetto individuale di siRNA può essere inferiore a quello dila piscina, e viceversa, in alcuni casi specifici siRNA può mostrare un forte effetto sul fenotipo cellulare in isolamento rispetto a quando esiste in piscina (anche quando la concentrazione è rappresentato).

Representative Results

Prima della proiezione, viene stabilita la ipossia-responsività delle cellule U20S-HRE. Cellule U20S-HRE esprimono un costrutto giornalista costituito da luciferasi di lucciola fuso valle di tre copie tandem dell'elemento risposta all'ipossia, che è vincolato da dell'eterodimero HIF1A/HIF1B in caso di esposizione all'ipossia (Figura 1A). Le cellule sono posti in una workstation ipossia per un intervallo di tempo per stabilire l'esposizione ipossia produce la risposta più efficace per lo screening. Cellule U20S esprimono bassi livelli di HIF2A, quindi le letture luciferasi sono in gran parte dipende stabilizzazione HIF1a ipossia-mediata ^7. L'esposizione delle cellule U20S-HRE all'ipossia per 0 ore, 2 ore, 4 ore, 6 ore e 24 risultati hr in una induzione di ipossia-dipendente dell'attività luciferasi (Figura 1B). Esposizione di cellule U20S-HRE all'ipossia per 24 hr risultati in una induzione ~ 10 volte dell'attività (Figura 1B), quindi questo rappresenta unn risposta eccellente per lo screening siRNA.

Per stabilire controlli di alti e bassi adatti, siRNA per HIF1a e FIH1 sono utilizzati per invertire trasfezione le cellule U20S-HRE. Le cellule vengono trasfettate con i controlli per 24 ore ed esposti a ipossia per altre 24 ore prima di saggi di luciferasi vengono eseguite. HIF1a siRNA diminuisce il segnale di ipossia a circa il 10%, mentre il FIH1 siRNA migliora il segnale di ipossia a circa il 170% rispetto al non-bersaglio siRNA (Figura 2). Questi controlli determinano un fattore Z media di 0,8, che è un segno eccellente per lo screening. I parametri di screening sono state ormai stabilito con successo per uno schermo robusto.

La schermata principale viene effettuata in piastre da 96 pozzetti utilizzando il flusso mostrato nella Figura 3. Controllo e siRNA biblioteca sono stampati su piastre di saggio (Figura 3A), e cellule U20S-HRE vengono inversa trasfettate poi incubated a 37 ° C per 24 ore. Piastre di saggio sono quindi esposti ad ipossia per 24 ore (Figura 3B) prima saggi di luciferasi sono eseguiti ed i dati analizzati (Figura 3C). Analisi di controllo qualità dello schermo include la determinazione del fattore Z per ogni piastra, dove il fattore Z superiore a 0,5 è auspicabile ^{8, 9.} Il fattore Z è calcolato per ogni piatto dello schermo primario triplice copia utilizzando la formula nella Figura 4A. I fattori Z per ogni piastra vengono visualizzati utilizzando un diagramma a dispersione, dove può essere consultato ogni piastra ha un fattore Z maggiore di 0,5 (Figura 4B). Calcolo del fattore Z è importante quanto riferisce su quanto è buono esiste una finestra separazione tra controlli e può mettere in evidenza potenziali problemi con piastre di saggio di schermo individuale. Il curriculum vitae dei controlli alte e basse vengono calcolati, e le medie sono 5.95% + / - 0,4 e 8,04% + / - 1.2, rispettivamente. La schermata principalerisultati in una distribuzione di duplex siRNA formano un continuum tra i controlli alte e basse. Tipicamente, ci saranno un numero approssimativamente uguale di regolatori positivi e negativi, con la maggior parte dei siRNA avere alcun effetto sul reporter (Figura 5). Regolatori di interesse vengono prese attraverso lo screening poi terziaria secondaria di stabilire un elenco di regolatori ad alta fiducia per l'analisi di follow-up e validazione.

Figura 1. Esposizione ipossia induce U20S-HRE reporter della luciferasi. (A) Schema che rappresenta il costrutto ipossia giornalista in cellule U20S-HRE utilizzati per lo screening siRNA. Tre copie tandem dell'elemento risposta all'ipossia (HRE) sono vincolati dal dell'eterodimero HIF1A/HIF1B per guidare la postaxpression della luciferasi di lucciola. (B) La crescente esposizione delle cellule U20S-HRE a 2 ore, 6 ore, 10 ore e 24 ore per i risultati di ipossia in quantità crescenti di attività luciferasi giornalista. 24 hr ipossia risultati esposizione a ~ 10 volte aumento dell'attività della luciferasi rispetto a 0 il controllo hr (normoxia). Barre di scala rappresentano l'errore standard della media.

Cellule Figura 2. Stabilire controlli alti e bassi siRNA per lo screening. U20S-HRE invertono trasfettate con siRNA per HIF1a (controllo basso) e FIH1 (alto controllo) diminuire o aumentare, rispettivamente, la risposta al 24 l'esposizione all'ipossia ore. Questi controlli danno un fattore Z di 0,8, che è considerato un segno eccellente per lo screening. L'effetto di non-bersaglio (NT) siRNA viene mostrato perconfronto. Le barre di errore rappresentano gli errori standard della media.

Figura 3. Flusso di lavoro di screening per identificare regolatori della risposta HIF1a ipossia. (A) Disposizione delle piastre da 96 pozzetti per lo screening siRNA. SiRNA di controllo sono stampati sulle colonne esterne come indicato e la libreria siRNA ubiquitome viene impresso sulle colonne interne, si sviluppa su 17 tavole. Cellule U20S-HRE sono reverse-trasfettate e incubate a normoxia per 24 ore. (B) Le pile di piastre di saggio vengono trasferiti in un ambiente sterile a una workstation ipossia fissato a 1% di ossigeno per 24 ore. (C) Le piastre vengono rimossi dalla workstation ipossia e attività di luciferasi saggi vengono eseguiti su tutte le piastre di saggio. Luminescenza èregistrato su un luminometro e analisi dei dati eseguita per stabilire l'attività giornalista di cellule trasfettate con siRNA ciascuna libreria.

Figura 4. Controllo qualità è effettuato calcolando il fattore Z di ciascuna piastra. (A) Il fattore Z per ciascuna piastra viene calcolato utilizzando la formula data, dove s rappresenta la deviazione standard, m rappresenta la media, p il controllo positivo e n il controllo negativo. (B) Scatter plot visualizza il fattore Z calcolato di ogni piatto dai tre repliche dello schermo ubiquitome. Un cut-off di 0,5 è applicato, e in questo caso tutte le piastre visualizzare un fattore Z> 0,5 e quindi passare il controllo di qualità.

Figura 5. Grafico che mostra la distribuzione della biblioteca siRNA. Grafico che visualizza la frequenza di siRNA dallo schermo siRNA ubiquitome triplice copia che provocano l'attivazione percentuale corrispondente. Controlli di bassi e alti vengono impostati a 0% e 100%, rispettivamente. La biblioteca siRNA è distribuita uniformemente tra il controllo alta e bassa, per cui la maggior parte dei siRNA hanno alcun effetto sul fenotipo cellulare. Una piccola percentuale di siRNA sono osservate per aumentare e diminuire la risposta, e quindi rappresentano potenziali nuovi regolatori della via.

Discussion

L'uso di genoma di ampiezza schermi siRNA in cellule di mammifero ha dimostrato di essere estremamente utile per identificare nuovi regolatori di vie biologiche distinte. Qui, abbiamo descritto l'uso di uno schermo ubiquitome siRNA targeting per identificare regolatori della risposta cellulare HIF1a mediata da ipossia. Schermi mirati stanno diventando sempre più attraente in quanto sono generalmente più economiche, più veloce, più facile da gestire e riferire solo sui componenti della via in cui gli investigatori sono interessati ^{7, 10, 11.}

E 'fondamentale per mettere un grande sforzo in fase di sviluppo test per garantire il reporter cella base è adatto per lo screening, e che la riproducibilità e bassa variabilità può essere raggiunto. E 'anche importante selezionare controlli positivi e negativi robusti per creare una finestra di separazione entro cui i regolatori di libreria cadrà. Inoltre, questi agiscono come controllo interno in ciascuna piastra di saggio dila schermata che consente la rapida individuazione di eventuali problemi con piatti individuali.

Un problema comune a screening ad alto rendimento è il verificarsi di effetti di bordo piatto, che può essere causato da una differenza locale dell'umidità ai pozzetti esterni della piastra rispetto ai pozzetti interni. Avere gli opportuni controlli in posto e creare una mappa di calore dell'uscita piastra può aiutare a identificare questo problema. Abbiamo trovato che gli effetti di bordo possono essere superate usando carta velina umida alla base delle piastre, e mettendo un sacchetto di plastica rigida, trasparente sopra la pila di piastre per rendere il microambiente di ciascuna piastra all'interno dell'incubatrice più uniforme.

Una limitazione dello screening siRNA è la presenza di falsi positivi e falsi negativi. Falsi negativi possono verificarsi a causa di vari fattori tra cui insufficiente knockdown del mRNA corrispondente, o la capacità di mRNA residuo di produrre abbastanza attoive proteine ​​per eseguire in modo efficiente la sua funzione. Falsi positivi sono più problematici, in quanto possono causare un investigatore di investire tempo significativo a seguito di un colpo che non può effettivamente governare il percorso in questione. Falsi positivi possono essere generati attraverso una serie di meccanismi tra cui via siRNA effetti off-target. Questo è dove il siRNA abbatte non solo l'mRNA in questione, ma anche altri, gli obiettivi non identificati, che sono i veri regolatori pathway ^{12, 13.} Un certo numero di approcci sono comunemente utilizzata e riconosciuta come la conferma che il fenotipo osservato è un vero risultato di bussare giù il gene bersaglio in questione ^14. Ad esempio, il problema degli effetti off bersaglio può essere superata in parte dallo screening terziaria, per cui la probabilità di più di un siRNA individuo dal pool iniziale di quattro avente effetti off-target è diminuita. Inoltre, eseguendo con successo gli esperimenti di soccorso con siRNA-resistentecDNA corrispondenti alla risposta anche escludere gli effetti off-target. Va notato che questo approccio di per sé non è senza avvertimenti, per esempio proteine ​​esogenamente overexpressed non necessariamente agire in modo identico alla controparte endogena causa alterata stechiometria dei complessi pertinenti o perturbato modificazioni post-traduzionali ecc Un approccio alternativo per colpire convalida pertanto, è quello di generare o acquisire knockout o knock-in linee cellulari corrispondenti ai colpi, e determinare se queste linee cellulari mostrano lo stesso fenotipo come knockdown siRNA. Pertanto, le limitazioni dello screening siRNA possono essere superati con un'attenta sperimentale follow-up. Inoltre, l'identificazione imparziale dei modificatori genuini dei percorsi in esame supera di gran lunga i problemi connessi con potenzialmente identificazione falsi positivi.

In sintesi, lo screening siRNA con un "ubiquitome" libreria siRNA mirata è un powerfMetodo ul identificare nuovi membri della ubiquitina e modificatori ubiquitina-like che regolano vie biologiche distinte. Il protocollo qui descritto può essere applicato a qualsiasi problema biologico se vi è un robusto lettura di attività di giornalista. La lista finale di elevata fiducia colpisce dallo schermo rappresenta il punto di partenza da dove stabilire la base meccanicistica di come ogni colpo governa il percorso in questione. In definitiva, questo si aggiungerà alla crescente conoscenza di come ubiquitina e ubiquitina-come modificatori regolano vie biologiche distinte.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automated Liquid Dispenser	Fluid-X	XPP-721	http://www.fluidx.eu/BIOTRACK/xpp-721-liquid-handling-system.html
White Walled Assay Plate	Greiner Bio One	655083	http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/37_11/13221/
Clear Plate Film	Perkin Elmer	1450-461	http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Product/ID/1450-461
siRNA library	Thermo Scientific	On-Target Plus	http://www.thermoscientificbio.com/rnai-and-custom-rna-synthesis/sirna/on-targetplus-sirna/search-gene/
Transfection reagent	Invitrogen	Lipofectamine RNAimax	http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Transfection-Selection/lipofectamine-rnaimx.html
Reduced Serum Medium	Invitrogen	Optimem	http://products.invitrogen.com/ivgn/product/31985062?ICID=search-product
DMEM	Invitrogen	41965-039	http://products.invitrogen.com/ivgn/product/41965039#
FBS	Invitrogen	16000-044	https://products.invitrogen.com/ivgn/product/16000044?ICID=search-product#
Tryspin-EDTA	Invitrogen	25300-054	https://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300054?ICID=search-product#