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Biology

切断断片の検出と電流測定を組み合わせることにより、上皮性ナトリウムチャネル(ENaCの)のタンパク質分解活性の実証

Published: July 5, 2014 doi: 10.3791/51582

Summary

異種アフリカツメガエルで発現した上皮ナトリウムチャネル(ENaC)のタンパク質分解活性は、卵母細胞は、細胞表面でのイオンチャネルの切断生成物の出現を調査するためにビオチン化アプローチに電流測定を組み合わせることによって実証することができるツメガエル 。機能的に重要な切断部位は、部位特異的突然変異誘発を用いて同定することができる。

Introduction

プロテアーゼは、タンパク質の周知のタンパク質分解から、消化の文脈において、複雑な調節シグナル伝達経路に関与する高度に洗練されたプロテアーゼカスケードの範囲の様々な生理的反応に関与する酵素である。アスパラギン酸、アスパラギン、システイン、グルタミン酸、メタロ、セリンおよびスレオニンプロテアーゼ:プロテアーゼはそれらの触媒​​活性部位に記載の7つのグループに分類される。異なるプロテアーゼは、常に、タンパク質の一次構造から予測することは容易ではない別個の切断部位を標的とする。 MEROPSデータベース( http://merops.sanger.ac.uk/は )プロテアーゼとその優先切断部位の広い範囲で詳細な情報を提供します。機能的に関連する切断部位は、部位特異的突然変異誘発を用いて同定することができる。

それはよくENaCのタンパク質分解プロセシングは、番目の活性化の重要なメカニズムであることが確立されている特定のイオンチャネル1,2である。興味深いことに、関連する酸感受性イオンチャネル1a(のASIC1a)の関数でも1〜2のプロテアーゼにより改変され得るという証拠がある。現時点ではそれがタンパク質分解チャネル切断が他のイオンチャネルやトランスポーターの活性を調節することに関連する生理的な役割を果たしているかどうか未解決の問題のまま。しかしながら、周知のタンパク質分解切断はGタンパク質共役受容体、プロテアーゼ活性化受容体(PAR)の6基を活性化することが確立されている。いくつかのセリンプロテアーゼ( 例えば、チャネル活性化プロテアーゼ(CAP1-3)、キモトリプシン、トリプシン、フリン、プラスミン、好中球エラスターゼ、カリクレイン)のタンパク質分解的なENaC 2活性化することが示されている。セリンプロテアーゼに加えて、プロテアーゼの他のグループは、タンパク質分解のENaC活性化に関与することができる。実際、最近のデータはACTIVAもメタロ-βメプリン7とシステインプロテアーゼのカテプシン-S 8ができることを示しているTEのENaC。しかし、ENaCの活性化のための(病態)生理学的に関連するプロテアーゼが決定されずに残っているし、組織に組織とは異なる場合があります。

プロテアーゼは、優先的に、アミノ酸配列中の特定部位で切断することが知られている。例えば、セリンプロテアーゼキモトリプシンは芳香族アミノ酸はフェニルアラニンおよびチロシン残基の後に切断する特異的な切断パターンを示している。対照的に、セリンプロテアーゼは、塩基性残基をリジンまたはアルギニンの後に優先的に切断するトリプシン。部位特異的突然変異誘発により生成された変異ヒトγENaC構築物を用いて、卵母細胞異種発現系で発現するENaC機能的に関連する切断部位は8-13を同定することができた。

単離された卵母細胞に3 ENaCサブユニット(αβγ)のためのcRNAを注入することは、ENaCは、機能的に、これらの細胞において発現させることができ、原形質膜に存在するチャネルの活性によって測定することができる2電極電圧クランプ法を用いた。利尿薬アミロライド、特定のENaC阻害剤を用いることにより、アミロライド感受性のENaC媒介全細胞電流成分( アミ ΔI) 非特異リーク電流から、または他のイオンチャネルによって行わ電流から分離することができる。従って、ΔI アミ値が全体のENaC活性を反映し、アミロライドの非存在下で記録され、対応する全細胞電流からアミロライドの存在下で測定された全細胞電流を減算することによって決定することができる。プロテアーゼはのENaCに対する刺激効果を持っているかどうかをテストするには、ΔIAMI、 すなわち前およびプロテアーゼを含有する溶液中の卵母細胞を培養した後、同じ卵母細胞に二度測定されます。第二の測定の最初からΔIAMIの増加は、タンパク質分解のENaC活性化を示している。キモトリプシンまたはトリプシンを最大限卵母細胞発現系2,14内のENaCを刺激することが知られており、CONFIするために使用することができるRMそのタンパク質分解のENaCの活性化は卵母細胞の所与のバッチで検出可能である。

全細胞電流の測定と並行して、ビオチン化アプローチ9は 、細胞表面でのENaCの切断断片の出現と相関ΔI アミの増加はプロテアーゼに対する卵母細胞の曝露の際に検出されたかどうかを調査するために使用した。細胞表面にタンパク質がビオチンで標識され、標識されたニュートラアビジンアガロースビーズへのビオチン化タンパク質を結合することによって細胞内タンパク質から分離することができる。ビオチン化タンパク質をウェスタンブロットにより分析することができる。細胞表面でγENaC切断断片は、γENaCのC末端中のエピトープに対する特異抗体を用いて検出することができる。機能的に関連する切断部位を同定するために、切断部位は、部位特異的突然変異誘発を用いて変異させることができると予測した。野生型と変異型のチャネルはSからの卵母細胞を用いた平行実験で比較したAMEバッチ。

この方法論的アプローチではENaCの媒介全細胞電流のタンパク質分解的な活性化は、細胞表面でフラグメントを開裂ENaCの時間依存性の出現と相関することを初めて実証された。これらの結果は、チャネル切断およびチャネル活性化の因果関係を示唆している。さらに、2電極電圧クランプ法と組み合わせた推定上の切断部位の部位特異的突然変異誘発を用いて、プラスミン、キモトリプシン13及びカテプシン-S 8機能的に関連する切断部位を同定した。

Protocol

アフリカツメガエル卵母細胞およびcRNAのマイクロインジェクションの1。分離

  1. 大人の女性のアフリカツメガエル卵母細胞から入手します。 0.2%MS222に動物を麻酔し、小さな腹部切開を通して卵巣葉を切除。
  2. カルシウム自由OR2溶液( 表1のレシピ)に溶解したクロストリジウムヒストリチカムからタイプ2コラゲナーゼの600〜700 U / mlの3〜4時間、19℃で酵素消化により卵巣葉から卵母細胞を分離します。
  3. 選択のために、溶液( 表1中のレシピND96)を含む高ナトリウムでの双眼顕微鏡下でシャーレに濾胞除去卵母細胞を配置。
  4. ステージV〜VIの卵母細胞を選択し、パスツールピペットを用いて別のペトリ皿に入れます。注:ブラントパスツールピペットを卵母細胞の損傷を防ぐために、燃えるようで。
  5. cRNAを( 例えば 0.2 ngのあたりαβγENaCサブユニット)との卵母細胞を注入する。 RNaseフリー水にcRNAを溶解する。注:合計各卵母細胞に注入された量は46 NLです。
  6. 表1にレシピND9)ストアは卵母細胞のナトリウム負荷を防ぐために低ナトリウム溶液中で19℃で卵母細胞を注入した。細菌の増殖を防ぐために、100 U / mlのナトリウムペニシリンおよび100μg/ mlのストレプトマイシン硫酸塩を含む溶液を補足する。慎重に損傷したか死ん卵母細胞の量を制限し、cRNAを注入後2日間はバス溶液で満たされた12穴プレートのウェル中の個々の小グループでそれらを維持するために、卵母細胞を処理します。

2。2電極電圧クランプ実験を行う

  1. 2日間の注射後の卵母細胞を測定します。
  2. ND96溶液による重力供給灌流システムとアミロリド(2μM)を含むND96溶液で別の注射器の1注射器を埋める。マウントは50センチメートル卵母槽室の上に注射器。 NOTE:のENaC阻害剤アミロライドの濃度は、そのIC 50よりも20倍高くなるように選択された
  3. 150Wのハロゲン冷光源をオンにして、双眼顕微鏡との良好な可視化を可能にする卵母槽室10cm上にそれを調整します。その後、吸引をオンにし、卵母槽室の終了時に吸引チューブを調整します。卵母細胞の風呂に入るチューブ」アダプタを灌流吸引チューブの反対の位置を確認します。注:吸引力は、卵母細胞をsuperfusingソリューションを継続的にサポートするのに十分なものでなければならない。
  4. 静脈重力流量制御装置を使用して3〜5ミリリットル/分に各溶液の灌流速度を調整。卵母槽室アダプターに灌流チューブを接続します。
  5. <1ミクロンの先端径を得るために、マイクロピペットプラーとガラスキャピラリーを引き出します。その後、3 M KClで〜1月4日に毛細血管を埋める。注:電極ホルダの銀線の塩素部分が塩化カリウム溶液に浸漬されていることを確認してください。キャピラリの先端に空気の泡を確認してください。気泡がmeasuを損なう抵抗の浮遊容量を増加させることによりrement。
  6. 現在の電極ホルダと電圧電極に毛細血管を挿入し、マイクロマニピュレータを用いて、アミロライド(2μM)溶液を含むND96にそれらを配置します。

アミロライド感受性全細胞電流の3。測定

  1. ゼロは、V mとV eを調整することにより電圧電極(V m)の 、および電流電極(V eの )の電極電位は、 ボタンオフセットNOTE:抵抗はV mおよび0.5を測定するための電極用1-2MΩでなければならない電流注入電極用-1MΩ。
  2. 電圧検出電極に近接した浴槽室に卵母細胞を配置します。注:これらの転写工程のいずれかの間に卵母細胞に損傷を与えないでください。卵母細胞を転送するためにパスツールピペットを使用してください。ピペットのエッジが燃えることで平滑化されるべきである卵母細胞の損傷を避けるため。
  3. OOを突き刺す両方の微小電極でやさしくcytes。
  4. -60 mVまでアンプの保持電位を設定し、チャートレコーダーの電源をオンにします。溶液を含むアミロライド(2μM)をオンにします。注:現在は約0±0.5μAである必要があります。大きなリーク電流が漏れやすい串刺しを示す。したがって、これらの卵母細胞は拒絶されるべきである。また、アミロライドの存在下で測定リーク電流(2μM)は、卵母細胞に発現αβγ変異のENaCで測定されたものに卵母細胞に発現αβγ-WTに類似していなければならない。これは変異がチャンネルのアミロライド感受性に影響を与えないことを示しています。
  5. 録音を開始する。必要に応じてゲインを調整します。
  6. 測定された電流が安定したプラトーに達した後、アミロリドを含まない溶液に変更します。注:電流トレースの下向き現在たわみが内向き電流、細胞内への細胞外側から正電荷すなわち運動し(Na +)に対応しています。
  7. AF現在のプラトー(〜60秒後)に達するterを、背中溶液を含むアミロライドに灌流を切り替える。卵母細胞の電流が初期のベースライン電流に達すると、電圧クランプをオフにして、静かに電極を引き出す。
  8. 串刺し部位で細胞膜の再封可能にするために、プロテアーゼフリーのND96溶液を100〜150μLを含む96ウェルプレートの1ウェルに卵母細胞を置く。
  9. 5分後、30分のインキュベーション時間の溶液を含有するプロテアーゼまたはプロテアーゼを含まない対照溶液に卵母細胞を移す。注:インキュベーション時間は、プロテアーゼ、研究チャネルに依存します。
  10. インキュベーション工程の後に、現在の測定値(3.2および以下を参照してください)​​を繰り返します。 NOTE:これは、プロテアーゼ溶液中でのインキュベーション後、卵母細胞の> 90%を測定することが可能である。

4。ビオチン化アッセイ

  1. 選択し、双眼顕微鏡下での不良卵母細胞を捨てる。注:使用して注入電流測定用とビオチン化実験のための同じバッチから卵母細胞を編
  2. 実験では、使用前に少なくとも20分間RTでビオチンを保管してください。
  3. 溶液を調製:ND96とND96は、適切なプロテアーゼを含有する。それらを標識することにより、短時間卵母細胞の傷害を避けるために、それらの先端を燃えることでパスツールピペットを準備します。 NOTE:ここで、ND96中のプロテアーゼキモトリプシンの2μg/ mlのに使用される。溶液の交差汚染を回避するために、別個のピペットで各グループを扱う。
  4. RTでプロテアーゼを含有する2.5ミリリットル制御ND96またはND96に6ウェルプレートの各ウェルを埋める。次いで、ウェルにつき30卵母細胞を堆積し、RTで30分間それをインキュベートする。注:以降の手順については、それがすべての回でサンプルを氷上で維持することが重要である。全ての遠心分離工程は4℃で行われる
  5. 2.5ミリリットルのND96(各グループが洗浄ステップのための3つのウェルを必要とします)を使用して新しい6ウェルプレートの各ウェルを記入し、ビオチンを比較検討する。注:2.5 mgのビオチンPERウェル(1 mg / ml)を必要とされている。 25ミリリットルビオチン化バッファー( 表1のレシピ)でのビオチン化バッファ10グループについて( すなわち 25mgのビオチン()にビオチンを溶解する。
  6. よく2.5ミリリットルのND96でいっぱいに卵母細胞の各グループを転送します。転送が残っているプロテアーゼを洗い流しND96との二つの追加のウェルに順次卵母。 ND96中で5分間の卵母細胞をインキュベートする。
  7. よく含む2.5ミリリットルビオチン溶液に卵母細胞を移し、15分間穏やかに攪拌( 'シェーカー')でそれらをインキュベートする。注:ビオチン溶液の希釈を避けるために、ピペットで移すND96を最小限に抑えます。
  8. ビオチン化反応を停止させるとともに含む2.5ミリリットルクエンチバッファー( 表1のレシピ)に卵母細胞の各グループを転送します。その後、また2.5ミリリットルを含む第二のウェルに卵母細胞の各グループを転送し、バッファと穏やかに攪拌しながら5分間インキュベートクエンチ。
  9. 損傷したか死ん卵母細胞を除去します。注:次の手順のためのグループごとの卵母細胞と同じ数を選択してください。
  10. 1.5ミリリットルのプラスチックマイクロチューブに卵母細胞の各グループを転送します。注:転送され、クエンチバッファーの量を最小限に抑えます。
  11. 続いて、プロテアーゼ阻害剤を補充した(レシピは表1を参照)を1mlの溶解緩衝液中の27 G針を介してそれらを通過させることにより卵母細胞を溶解する。
  12. 遠心1,500×gで10分間溶解物。
  13. 上清を吸引し、および0.5%トリトン-X-100および0.5%NP40を含む1.5 mlのマイクロ遠心チューブに移す。残ったペレットを捨てる。注:上清を、ビオチン化細胞膜タンパク質及び非ビオチン化細胞内タンパク質が含まれています。
  14. 氷上で20分間マイクロ遠心チューブをインキュベートします。繰り返し完全NP40およびTriton-X-100でタンパク質を溶解するために、この期間中にチューブをボルテックス。
  15. 遠心分離機1500 X gで3分間の卵母細胞のグループごとにアガロースビーズを100μl。後に遠心分離は、ビーズ溶液から上澄みを除去し、緩衝液でビーズを平衡化するために、溶解緩衝液で3回洗浄する。
  16. ビーズへのビオチン化タンパク質の結合を可能にするために4.13に調製されたタンパク質 - 界面活性剤溶液を含む各マイクロ遠心チューブに洗浄したビーズ100μLを加える。
  17. 4℃でオーバーヘッド回転のO / Nでマイクロチューブをインキュベート
  18. 遠心1,500 x gで3分間のマイクロ遠心チューブに。次に、新しいチューブに上清を移す。注:細胞内タンパク質をビオチンで標識されていません。上清を-20℃で保存することができますビーズを吸引しないでください。

ウェスタンブロット分析により、細胞表面でのENaCの切断断片の5。検出

  1. 溶解緩衝液でビーズを3回洗浄し、2×SDS-PAGE試料緩衝液100μlを加える。注:サンプルを-20℃で貯蔵するか、即座にウェスタンブロット分析のために調製することができる。
  2. 沸騰Sその後、95℃で5分間amples管を氷の上に置きます。
  3. 2万×gで3分間遠心サンプルと新しいマイクロチューブに上清をピペットで。注:この上清は、卵母細胞の細胞表面からビオチン化細胞膜タンパク質が含まれています。
  4. 細胞表面で切断断片を調査するために、ウエスタンブロットにより、この上澄み液30μlを分析します。
  5. 適切なゲル(調べ切断断片の分子量に応じて8%、10%、12%)を用いてSDS-PAGE(ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動)により、ビオチン化タンパク質を分離する。
  6. セミドライブロッティングによってポリビニリデンジフルオリド(PVDF)膜にタンパク質を移す。
  7. 図3および13を参照こと)C末端中のエピトープに対するヒトγENaCに対する特異的抗体を用いて膜をプローブ。
  8. 二次抗として西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギ抗体を使用しボディ。
  9. 化学発光シグナルを検出する。

Representative Results

セリンプロテアーゼプラスミンのENaC媒介電流を活性化することができるかどうかを調べるために、個々のENaC発現卵母細胞のΔIAMIはプロテアーゼフリーでの卵母細胞の30分間のインキュベーション(コントロール)( 図2A)またはプラスミンを含有する溶液( の前と後に測定した2B)(図1参照)、2電極電圧クランプ法を用いた。プラスミンへの曝露は、測定された全ての卵母細胞にΔIAMIを増加させた。これとは対照的に、対照実験では、タンパク質分解酵素を含まない溶液中でのENaC発現卵母細胞の30分間のインキュベーションはほとんど影響します( 図2のC、D)を持っていた。したがって、この方法を用いることによりプラスミンのENaCにより媒介される電流の刺激を検出することができる。

ENaCの媒介電流の活性化の際と同様に、チャネル切断の際に推定される切断部位を変異の影響を研究するために、WT-のENaCに対するキモトリプシンの効果は、上と比較した変異体の変異プロスタおよびプラスミン切断部位でのENaC(γRKRK178AAAA、K189A)。キモトリプシンによるチャネルの活性化の時間経過、並びにENaCの出現は、細胞表面で切断産物の異なるプロテアーゼインキュベーション時間( 図4A)を用いて調べた。これは、変異体チャネルの遅​​延およびキモトリプシンによるのENaC媒介電流の活性化を減少させることが実証された。これは、完全に切断されたサブユニットに相当する67 kDaで低分子量γENaC切断断片の遅延出現と平​​行している。切断断片は、C末端中のエピトープに対して指向γENaC抗体( 図3)を用いて検出した。この方法論的アプローチは、ENaCの媒介電流のタンパク質分解的な活性化の時間経過は、細胞表面でγENaC67kDaの切断産物の出現( 図4のB、C)と相関することを示している。これはの概念をサポートしていますタンパク質分解チャネル切断およびチャネル活性化13の間に因果関係。さらに、細胞表面での電流測定値とγENaC断片の検出を組み合わせることにより、それが変異した切断部位は、タンパク質分解性チャネルの活性化のために機能的に関連していることが実証された。

図1
図1。異種アフリカツメガエルで表現するENaC上のプロテアーゼの刺激効果を決定する手順は、 ツメガエル卵母細胞。ENaC活性はアミロライド感受性細胞全体の電流成分ΔIAMIを測定することで推定される。

図2
図2。プラスミンはENaCの媒介カレンを刺激のENaCを発現する卵母細胞のTS。ヒトのENaCを発現する(AD)卵母細胞は、プロテアーゼを含まない溶液(対照)で、またはプラスミン(10μg/ mlの)を含有する溶液中で30分間インキュベートした。 ( - )の前に、ΔIAMIを決定し、(+)のインキュベーションの後、卵母細胞を-60mVの保持電位にクランプされた(A、B)の 4つの代表的な全細胞電流トレースは、卵母細胞の1バッチから。アミロライド(AMI)は、黒棒によって示されるように、具体的なENaCを阻害するために浴溶液中に存在した。(C)は 、個々の卵母細胞から得られたデータ点を線で接続されている。(D)は 、類似の実験の概要C.列に示されるように表すΔIAMIに対する相対的な刺激効果は、インキュベーションの前に測定された初期ΔIAMI(ΔI亜美初期)に30分のインキュベーション(ΔIAMI 30分)後に測定し、ΔIAMIの比率として計算されます。列中の数字は示している測定された個々の卵母細胞の数は、Nは、異なるバッチの卵母細胞の数を示す。 (この図は、[。:10.1085/jgp.201110763 Haerteis 2012 J玄生理学 140、375から389、DOI]から変更されている)

図3
図3のタンパク質分解活性化および使用される抗体の結合部位の切断部位を示すγENaCサブユニットの機種チャネルは原形質膜に到達する前にゴルジ体に関連する転換酵素フューリンによるタンパク分解切断は、生合成経路におけるENaCの成熟のために重要である。 76 kDaの断片をフリンによる切断後のγ-サブユニットのC末端におけるエピトープに対するビオチン化アプローチおよび抗体を用いて細胞表面で検出することができる。タンパク質分解ENにおいて極めて重要な最後のステップのaCの活性化は、おそらくγENaCが67kDaの切断フラグメントをもたらしフリンサイトへの先端領域における細胞外プロテアーゼ( 例えばプラスミンまたはキモトリプシン)によって切断され、細胞膜で起こる。 (この図は、[。:10.1085/jgp.201110763 Haerteis 2012 J玄生理学 140、375から389、DOI]から変更されている)

図4
図4:プラスミン(K189)とプロスタ切断部位(RKRK178)の両方を変異させることのENaC媒介電流の活性化と、チャンネルのγサブユニットの67kDaの切断産物の出現を遅らせる卵母細胞は、WTを表現する(オープンシンボル)とγRKRK178AAAAは、K189AのENaC変異体チャネル(黒印)は、プロテアーゼを含まない溶液(対照)での30分間または5、3インキュベートした0、またはキモトリプシン(2μg/ mlの)を含有する溶液中で60分間のインキュベーションの前後で、ΔIAMIを決定するために、(A)は 、卵母細胞を-60mVの保持電位にクランプされた。円はインキュベーションの前に測定された初期ΔIAMI(ΔI亜美初期)に、5後に測定し、ΔIAMIの比率を表す30、または60分間のインキュベーション(ΔI 亜美分)。各データ点は、4つの異なるバッチの22〜24個々の卵母細胞において測定された平均ΔI アミを表す。(BD)ΔI アミの検出と並行して、細胞表面でビオチン化γENaCの発現は、SDS-PAGEにより分析した。 γENaC、人間γENaCのC末端中のエピトープに対する抗体を用いて検出した。各レーンの場合はBまたはDに示したものと同様の3ウエスタンブロット、Sの卵母細胞の1バッチからの代表的なウエスタンブロットを示している。(CE)の濃度測定分析76 KD(オープンカラム)と67 KD(灰色カラム)の地域で検出さignalsが決定され、検出された全信号の合計に対して標準化した。Nは卵母細胞の異なるバッチの数を示します。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

Discussion

本稿では成功してプロテアーゼによるENaCの活性化のメカニズムを研究するために適用された方法論的アプローチは8,13に記載されている。十分に確立されたアフリカツメガエル卵母細胞発現系が機能的なENaC明示するために使用されたツメガエル 。 ENaCの機能は、従来の2電極電圧クランプ法で評価した。部位特異的突然変異誘発を、機能的に関連するプロテアーゼ切断部位を同定した。電気生理学的測定と並行して行わビオチン化実験は、タンパク質分解、現在活性化に細胞表面でのENaC切断産物の出現を相関させることが可能となる。現在の活性化の時間経過と細胞表面でのタンパク質分解切断断片の出現との間の相関は、タンパク質分解チャネル活性化の概念をサポートしています。

2電極電圧クランプ記録は、Oの串刺しを必要とする2微小電極でocyte。この手順は、通常、個々の卵母細胞に一度だけ実行されます。しかし、卵母細胞には明らかな損傷なしで初期ホールセル電流の記録後、微小電極を除去することが可能であった。実際に、impalementsの部位で原形質膜は、数分以内に再密封するようである。これにより、第2電極電圧クランプ測定を完了した後に、マイクロチューブ又はで充填された96ウェルプレートのウェルに、2電極電圧クランプセットアップの実験的なフローチャンバーから卵母細胞を転送することが可能である試験または対照少量の溶液。その後、同じ卵母細胞は、フローチャンバーに戻しすることができ、第2電極電圧クランプ測定を実行するために再度突き刺され得る。驚くべきことには、ENaC媒介電流は卵母細胞が対照溶液中で維持された第一及び第二の測定値との間あまり変化しなかった。これとは対照的に、卵母細胞のインキュベーションゾルを含むプロテアーゼ中最初の測定後utionは第二の測定において増加したENaC媒介電流( 図2)となりました。この発見は、タンパク質分解チャネルの活性化を示している。

単一卵母2つの別々の電流の測定を実行すると、卵母細胞は、試験溶液の少量の時間の長さを可変するための2つの測定値の間のプロテアーゼまたは他の薬理学的作用物質に暴露することができるという利点を提供する。 例えば 、精製されたプロテアーゼの準備を大量に高価かつ/または使用できない薬剤を使用する場合に重要です。薬剤の限定された状況を理由に連続分当たり数ミリリットルの流量で卵母細胞superfusingに必要な試験溶液を大量のが不可能(または手が届かない)連続する2つの電極電圧クランプ記録で使用することができる。また、連続する2つの電極電圧クランプ測定は、周知の天才によって制限される自発的なチャネルランダウンのENONものENaC 15について記載した。対照的に、時間以上までのための2つの別々の測定値間のソリューションをテストするために卵母細胞を曝露すると、一般に、( 図4Aを参照)問題はない。最後に、同じ卵母細胞で行われる2連続した測定値は、薬物効果のペアの観測を可能にします。それは通常のイオンチャネル発現で観察された卵母細胞、間に高い変動性の問題を減少させるので、これは、卵母細胞(プロテアーゼ処理およびビヒクル処理した)2つの別々のグループからの不対の測定値よりも有利である。ペアの観察と最初の測定にデータを正規化する可能性が少なく卵母細胞は薬剤の重要な効果を実証する実験群ごとに必要とされている。データの正規化はまた、 図2D(異なるイオンチャネルの発現レベル、従って異なるベース電流で卵母細胞の異なるバッチからのデータを要約することを容易にする)。このアプローチは、目的のイオンチャネル活性( 図2参照)から第二測定媒体処理対照卵母細胞内に安定していることを実証するために、明らかに、対照実験が必要である。

タンパク質分解現在のアクティベーションは、細胞表面での切断産物ENaCの出現と相関することを実証するために、ビオチン化アプローチは、本来ハリスによって記載され、図9用いることできる。この手順は、(プロトコルセクションに詳述し、 図4に示すように)プロテアーゼに対するチャネルの曝露を実証するように適合したENaCが媒介する電流のその後の活性化は、切断断片の時間依存性の出現と平行している。ビオチン化方法はまた、細胞表面における膜タンパク質の全体的な増加または減少の分析を可能にする。したがって、この方法は、プロテアーゼおよび他のpharの効果を調べるのに適している原形質膜へのまたはチャンネル検索時にチャネルの挿入時にmacological薬。さらに、ビオチン化された原形質膜タンパク質のウェスタンブロット分析は、タンパク質断片( 例えば、タンパク質分解断片のENaC)または機能的に関連する可能性があるグリコシル化パターンの変化の検出を可能にする。

結論としては、ENaC媒介全細胞電流に対するプロテアーゼの刺激効果を調査し、細胞表面でのENaC切断産物の発生との相関を示すために用いられる方法との組み合わせは、広範囲の用途に有用であり得る。特に、これらの方法は、他のイオンチャネル、トランスポーター、または膜貫通受容体( 例えば、プロテアーゼ活性化受容体PARライト)の調節に関する同様の問題に取り組むために適切であり得る。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Bath clamp headstage for OC-725C-V Warner Instrument Corporation
Cold light source - Schott KL 1500 LCD Schott #SCOC150200EU brightness 4; mechanical aperture: D; color temperature: 3,000 K
E Series electrode holder (Str, Vent, Ag Wire, 1.2 mm) ADinstruments #ESW-F10v
Left micromanipulator; MM-33L Warner Instrument Corporation #64-0055
LIH 1600 - computer interface HEKA
Magnetic valve system (ALA BPS-8) in combination with a TIB14 interface (HEKA) ALA Scientific Instruments, HEKA
OC-725C amplifier for two-electrode voltage-clamp recordings Warner Instrument Corporation
P-97 FLAMING/BROWN Micropipette Puller Sutter Instruments heat = 550; velocity = 22; time = 200
Right micromanipulator; MM-33R Warner Instrument Corporation #64-0056
Series electrode holder (45°, Vent, Handle, Ag Wire, 1.2 mm) ADinstruments #E45w-f10vh
STAT 2 IV gravity flow controller Conmed #P-S2V-60
Vacuum generator ejector SEG - for suction to remove bath solution Schmalz
INFUJECT 60 ml pump syringes for solutions Braun #22050
Injekt-F for lysing the oocytes Braun #9166033V
Standard wall borosilicate tubing with filament Sutter Instruments #BF150-86-10 outside diameter: 1.5 mm; inside diameter: 0.86 mm; length: 10 cm
Complete, Mini, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets Roche Applied Science #11836170001
EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin Thermo Scientific #21217
Horseradish peroxidase-labeled secondary goat anti-rabbit antibody Santa Cruz Biotechnology #sc-2004
NeutrAvidin Agarose Thermo Scientific #29200 Neutravidin-labeled agarose beads
NP40 (Nonidet P-40) Sigma-Aldrich #I8896
Roti-Load 1 (2x SDS-PAGE sample buffer) Carl Roth #K929.2
SuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrate for detection of chemiluminescent signals Thermo Scientific #34095
Triton-X-100 Sigma-Aldrich #T8787

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References

  1. Kleyman, T. R., Carattino, M. D., Hughey, R. P. ENaC at the cutting edge: regulation of epithelial sodium channels by proteases. The Journal of Biological Chemistry. 284, 20447-20451 (2009).
  2. Rossier, B. C., Stutts, M. J. Activation of the epithelial sodium channel (ENaC) by serine proteases. Annu Rev Physiol. 71, 361-379 (2009).
  3. Poirot, O., Vukicevic, M., Boesch, A., Kellenberger, S. Selective regulation of acid-sensing ion channel 1 by serine proteases. The Journal of Biological Chemistry. 279, 38448-38457 (2004).
  4. Vukicevic, M., Weder, G., Boillat, A., Boesch, A., Kellenberger, S. Trypsin cleaves acid-sensing ion channel 1a in a domain that is critical for channel gating. The Journal of Biological Chemistry. 281, 714-722 (2006).
  5. Clark, E. B., Jovov, B., Rooj, A. K., Fuller, C. M., Benos, D. J. Proteolytic cleavage of human acid-sensing ion channel 1 by the serine protease matriptase. The Journal of Biological Chemistry. 285, 27130-27143 (2010).
  6. Ossovskaya, V. S., Bunnett, N. W. Protease-activated receptors: contribution to physiology and disease. Physiological reviews. 84, 579-621 (2004).
  7. Garcia-Caballero, A., et al. Activation of the epithelial sodium channel by the metalloprotease meprin β-subunit. Channels (Austin. 5, 14-22 (2011).
  8. Haerteis, S., et al. Proteolytic activation of the epithelial sodium channel (ENaC) by the cysteine protease cathepsin-S. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 464, 353-365 (2012).
  9. Harris, M., Firsov, D., Vuagniaux, G., Stutts, M. J., Rossier, B. C. A novel neutrophil elastase inhibitor prevents elastase activation and surface cleavage of the epithelial sodium channel expressed in Xenopus laevis oocytes. The Journal of Biological Chemistry. 282, 58-64 (2007).
  10. Passero, C. J., Mueller, G. M., Rondon-Berrios, H., Tofovic, S. P., Hughey, R. P., Kleyman, T. R. Plasmin activates epithelial Na+ channels by cleaving the γ-subunit. The Journal of Biological Chemistry. 283, 36586-36591 (2008).
  11. Svenningsen, P., et al. Plasmin in nephrotic urine activates the epithelial sodium channel. Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 20, 299-310 (2009).
  12. Patel, A. B., Chao, J., Palmer, L. G. Tissue kallikrein activation of the epithelial Na channel. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 303, (2012).
  13. Haerteis, S., Krappitz, M., Diakov, A., Krappitz, A., Rauh, R., Korbmacher, C. Plasmin and chymotrypsin have distinct preferences for channel activating cleavage sites in the γ-subunit of the human epithelial sodium channel. The Journal of General Physiology. 140, 375-389 (2012).
  14. Chraibi, A., Vallet, V., Firsov, D., Hess, S. K., Horisberger, J. D. Protease modulation of the activity of the epithelial sodium channel expressed in Xenopus oocytes. The Journal of General Physiology. 111, 127-138 (1998).
  15. Volk, T., Konstas, A. A., Bassalay, P., Ehmke, H., Korbmacher, C. Extracellular Na+ removal attenuates rundown of the epithelial Na+-channel (ENaC) by reducing the rate of channel retrieval. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 447, 884-894 (2004).
切断断片の検出と電流測定を組み合わせることにより、上皮性ナトリウムチャネル(ENaCの)のタンパク質分解活性の実証
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Krappitz, M., Korbmacher, C., Haerteis, S. Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel (ENaC) by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments. J. Vis. Exp. (89), e51582, doi:10.3791/51582 (2014).More

Krappitz, M., Korbmacher, C., Haerteis, S. Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel (ENaC) by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments. J. Vis. Exp. (89), e51582, doi:10.3791/51582 (2014).

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