Proteolytisk aktivering av den epiteliala natriumkanal (ENaC) heterologt uttryckta i Xenopus laevis-oocyter kan påvisas genom att kombinera strömmätningar med en biotinylering tillvägagångssätt för att undersöka förekomsten av jonkanal klyvningsprodukterna vid cellytan. Funktionellt viktiga klyvningsställen kan identifieras genom användning av riktad mutagenes.
The described methods can be used to investigate the effect of proteases on ion channels, receptors, and other plasma membrane proteins heterologously expressed in Xenopus laevis oocytes. In combination with site-directed mutagenesis, this approach provides a powerful tool to identify functionally relevant cleavage sites. Proteolytic activation is a characteristic feature of the amiloride-sensitive epithelial sodium channel (ENaC). The final activating step involves cleavage of the channel’s γ-subunit in a critical region potentially targeted by several proteases including chymotrypsin and plasmin. To determine the stimulatory effect of these serine proteases on ENaC, the amiloride-sensitive whole-cell current (ΔIami) was measured twice in the same oocyte before and after exposure to the protease using the two-electrode voltage-clamp technique. In parallel to the electrophysiological experiments, a biotinylation approach was used to monitor the appearance of γENaC cleavage fragments at the cell surface. Using the methods described, it was demonstrated that the time course of proteolytic activation of ENaC-mediated whole-cell currents correlates with the appearance of a γENaC cleavage product at the cell surface. These results suggest a causal link between channel cleavage and channel activation. Moreover, they confirm the concept that a cleavage event in γENaC is required as a final step in proteolytic channel activation. The methods described here may well be applicable to address similar questions for other types of ion channels or membrane proteins.
Proteaser är enzymer som är involverade i olika fysiologiska reaktioner som sträcker sig från den välkända proteolytiska nedbrytningen av proteiner, i samband med matsmältningen, till mycket avancerade proteas kaskader involverade i komplexa reglerande signalvägar. Proteaser indelas i sju grupper enligt deras katalytiskt aktiva stället: aspartat, asparagin, cystein, glutaminsyra, metallo, serin och treonin-proteaser. Olika proteaser rikta olika klyvningsställen som inte alltid är lätt att förutse från den primära strukturen av ett protein. Den Merops databas ( http://merops.sanger.ac.uk/ ) ger detaljerad information om en rad olika proteaser och deras förmånliga klyvningsställen. Funktionellt relevanta klyvningsställen kan identifieras med användning av ställesriktad mutagenes.
Det är väl etablerat att proteolytiska bearbetningen av ENaC är en viktig mekanism för aktivering av thär särskilt jonkanal 1,2. Intressant nog finns det bevis för att funktionen av den relaterade syra-sensing jonkanal 1a (ASIC1a) kan också modifieras genom proteaser 3-5. För närvarande är det fortfarande en öppen fråga om proteolytiska kanal klyvning spelar en relevant fysiologisk roll i regleringen av aktiviteten av andra jonkanaler eller transportörer. Det är emellertid välkänt att proteolytisk klyvning aktiverar en grupp av G-proteinkopplade receptorer, det proteasresistenta aktiverade receptorer (PARS) 6. Flera serinproteaser (t.ex. kanalaktiverande proteaser (CAP1-3), kymotrypsin, trypsin, furin, plasmin, neutrofilt elastas, och kallikrein) har visats att proteolytiskt aktivera ENaC 2. Förutom serinproteaser kan andra grupper av proteaser vara involverade i proteolytisk ENaC aktivering. I själva verket visar de senaste uppgifterna att den metalloproteinas meprin-β 7 och cystein proteas cathepsin-S 8 kan också activate ENaC. Men de (pato-) fysiologiskt relevanta proteaser för ENaC aktivering återstår att fastställa, och kan skilja sig från vävnad till vävnad.
Proteaser är kända för att företrädesvis klyva vid speciella ställen i aminosyrasekvensen. Till exempel visar serinproteaset kymotrypsin ett specifikt klyvningsmönster klyvning efter den aromatiska aminosyrarester fenylalanin och tyrosin. I motsats till detta serinproteas trypsin preferentiellt klyver efter grundresterna lysin eller arginin. Använda mutanta humana γENaC konstruktioner genererade av platsriktad mutagenes, kunde funktionellt relevanta klyvningsställen i ENaC heterologt uttryck i oocyt-expressionssystemet identifieras 8-13.
Genom att injicera cRNA för de tre ENaC subenheter (αβγ) i isolerade oocyter kan ENaC funktionellt uttryckas i dessa celler och aktiviteten för kanaler som är närvarande vid plasmamembranet kan mätas genommed hjälp av två elektroder spänning-clamp teknik. Genom att använda den diuretiska amilorid, en specifik ENaC hämmaren skall amilorid känsliga ENaC medierad helcells-strömkomponent (aI ^ ami) kan separeras från ospecifika läckströmmar eller strömmar som utförs av andra jonkanaler. Sålunda AI ami värden återspeglar total ENaC aktivitet och kan bestämmas genom att subtrahera helcells-strömmar som mäts i närvaro av amilorid från motsvarande helcells-strömmar som registrerats i avsaknad av amilorid. För att testa om ett proteas har en stimulerande effekt på ENaC, är AI ami mäts två gånger i samma äggcellen, det vill säga före och efter inkubation av äggcellen i ett proteas som innehåller lösning. En ökning av AI ami från den första till den andra mätningen indikerar proteolytisk ENaC aktivering. Kymotrypsin eller trypsin är kända för att maximalt stimulera ENaC i oocyt-expressionssystemet 2,14 och kan användas för att insynsrm som proteolytiska ENaC aktivering kan detekteras i en given sats av oocyter.
Parallellt med hel-cell strömmätningar, var en biotinylation strategi 9 används för att undersöka om ökningen av AI ami upptäcktes vid exponering av oocyter till proteaser korrelerar med utseendet på ENaC klyvning fragment vid cellytan. Proteiner vid cellytan är märkta med biotin och kan separeras från intracellulära proteiner genom bindning av de biotinylerade proteiner till neutravidin Märkta agarospärlor. De biotinylerade proteinerna kan analyseras med western blöt. γENaC klyvningsfragment vid cellytan kan detekteras med användning av en specifik antikropp riktad mot en epitop i den C-terminalen av γENaC. För att identifiera funktionellt relevanta klyvningsställe (n), förutsagda klyvningsställen kan muteras med hjälp av ställesriktad mutagenes. Vildtyp och muterade kanaler jämförs i parallella experiment med ägg från samn parti.
Med denna metodik visades för första gången att proteolytiska aktiveringen av ENaC-medierade hel-cellströmmar korrelerar med den tidsberoende utseende ENaC klyvning fragment vid cellytan. Dessa resultat tyder på ett orsakssamband mellan kanal klyvning och kanalaktivering. Dessutom, med hjälp av ställesriktad mutagenes av förmodade klyvningsställen i kombination med två-elektrodspänning-clamp-tekniken, funktionellt relevanta klyvningsställen för plasmin, kymotrypsin 13 och katepsin-S-8 identifierades.
I detta manuskript en metodologisk ansats som framgångsrikt tillämpades för att studera mekanismerna bakom aktiveringen av ENaC av proteaser beskrivs 8,13. Den väletablerade Xenopus laevis oocyt expressionssystem användes för att funktionellt uttrycka ENaC. ENaC funktion bedömdes med den konventionella två-elektrodspänning-clamp teknik. Ställesriktad mutagenes användes för att identifiera funktionellt relevanta proteas-klyvningsställen. Biotinylation experiment som utförts parallellt med de elektrofysiologiska mätningar gjort det möjligt att korrelera uppkomsten av ENaC spjälkningsprodukter på cellytan med proteolytiska nuvarande aktivering. En korrelation mellan tidsförloppet av aktuell aktivering och uppkomsten av proteolytiska klyvningsfragment på cellytan stöder idén om proteolytiska kanalaktivering.
Två-elektrodspänning-clamp inspelningar kräver impalement av en oocyte med två mikroelektroder. Proceduren utförs vanligtvis endast en gång i ett enskilt äggcellen. Det var emellertid möjligt att avlägsna de mikroelektroder efter en initial hel-cell aktuella inspelningen utan uppenbar skada på oocyten. I själva verket tycks plasmamembranet vid ställena för impalements att återförsluta inom några få minuter. Alltså, efter att ha avslutat en första två-elektrodspänningsklämma mätning, är det möjligt att överföra äggcellen från den experimentella flödeskammaren i två-elektrodspänningsklämma inställning till ett mikrofugrör eller en brunn på en 96-hålsplatta fylld med en liten volym av test-eller kontrolllösningen. Efteråt kan samma äggcellen föras tillbaka till flödet kammaren och kan spetsas igen för att utföra en andra två-elektrodspänningsklämmätning. Remarkably lämnade ENaC-medierade strömmar inte variera mycket mellan de första och andra mätningen när oocyten bibehölls i kontrollösning. Däremot inkubation av oocyten i en proteas innehållande solution efter den första mätningen gav ökad ENaC medierad ström i den andra mätningen (Figur 2). Detta indikerar proteolytiska kanalaktivering.
Performing två separata strömmätningar i en enda oocyt erbjuder fördelen att oocyten kan exponeras för proteaser eller andra farmakologiska medel mellan de två mätningarna för en variabel tidslängd i en liten volym av testlösning. Detta är viktigt när man använder medel som är dyra och / eller otillgänglig i stora mängder, t.ex. renade proteas preparat. Den begränsade tillgången på medel kan göra det omöjligt (eller dyr) att använda dem i kontinuerlig två-elektrodspänning-clamp inspelningar på grund av de stora volymer av testlösning som krävs för att kontinuerligt superfusing oocyter med flöden från flera milliliter per minut. Vidare är kontinuerliga två-elektrodspänningsklämma mätningar begränsas av den välkända phenomEnon av spontan kanal genomgång beskrivs också för ENaC 15. Däremot exponera oocyterna för att testa lösningar mellan två separata mätningar i upp till en timme eller mer i allmänhet inte utgöra ett problem (se figur 4A). Slutligen två sekventiella mätningar som utförs i samma äggcellen tillåter parade observationer av läkemedelseffekter. Detta har en fördel jämfört oparade mätningar från två separata grupper av ägg (proteas-behandlade och fordon-behandlad), eftersom det minskar problemet med hög variabilitet mellan ägg, vanligen observerats i jonkanal uttryck. Med parade observationer och möjligheten att normalisera data till den första mätningen är färre oocyter behövs per experimentgrupp för att visa en signifikant effekt av ett farmakologiskt medel. Normalisering av data gör det också enkelt att sammanfatta data från olika partier av ägg med olika jonkanal uttrycksnivåer och därmed olika grundlinjeströmmar (Figur 2D). Självklart, kontrollförsök är nödvändiga för detta tillvägagångssätt för att visa att jonkanalaktiviteten av intresse är fortsatt stabil i fordonsbehandlade kontroll äggceller från den första till den andra mätningen (se figur 2).
För att demonstrera att proteolytisk aktuella aktiverings korrelerar med uppträdandet av ENaC klyvningsprodukterna vid cellytan, en biotinylering tillvägagångssätt som ursprungligen beskrivits av Harris et al. 9 kan användas. Detta förfarande (enligt beskrivningen i protokollenheten och visas i Figur 4) har anpassats för att demonstrera att exponering av kanaler att proteaser och efterföljande aktivering av ENaC-medierade strömmar är parallellt med den tidsberoende utseendet på klyvningsfragment. Den biotinylation Metoden gör det också möjligt att analysera en ökning eller minskning av membranproteiner på cellytan. Således är denna metod lämplig för att undersöka effekten av proteaser och andra farmamacological ombud när kanal insättning i plasmamembranet eller vid kanal hämtning. Dessutom tillåter western blot-analys av de biotinylerade plasmamembranproteiner detektering av proteinfragment (t.ex. proteolytiska ENaC fragment) eller förändringar i glykosyleringsmönstret som kan vara funktionellt relevanta.
Sammanfattningsvis, en kombination av metoder som används för att undersöka den stimulatoriska effekten av proteaser på ENaC-medierade helcell-strömmar och för att visa en korrelation med förekomsten av ENaC klyvningsprodukterna vid cellytan kan vara användbara för ett brett spektrum av tillämpningar. I synnerhet kan dessa metoder vara lämpliga att ta upp liknande frågor beträffande regleringen av andra jonkanaler, transportörer eller transmembranreceptorer (t.ex. proteas-aktiverade receptorer Pars).
The authors have nothing to disclose.
The expert technical assistance of Céline Grüninger, Christina Lang, Sonja Mayer, and Ralf Rinke is gratefully acknowledged. We thank Dr. Morag K. Mansley for carefully reading the manuscript. This project was supported by a grant of the Deutsche Forschungsgemeinschaft (Grant SFB 423: Kidney Injury: Pathogenesis and Regenerative Mechanisms, to C. Korbmacher), grants of the Interdisziplinäres Zentrum für Klinische Forschung (to S. Haerteis and M. Krappitz), the ELAN program (to S. Haerteis) of the Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg, and the University Library of Erlangen-Nürnberg.
Bath Clamp Headstage for OC-725C-V | Warner Instrument Corporation | – | |
Cold light source – Schott KL 1500 LCD | Schott | #SCOC150200EU | brightness 4; mechanical aperture: D; color temperature: 3000 K |
E Series Electrode Holder (Str, Vent, Ag Wire, 1.2 mm) | ADinstruments | #ESW-F10v | |
left micromanipulator; MM-33L | Warner Instrument Corporation | #64-0055 | |
LIH 1600 – computer interface | HEKA | – | |
magnetic valve system (ALA BPS-8) in combination with a TIB14 interface (HEKA) | ALA Scientific Instruments, HEKA | – | |
OC-725C amplifier for two-electrode voltage-clamp recordings | Warner Instrument Corporation | – | |
P-97 FLAMING/BROWN Micropipette Puller | Sutter Instruments | – | heat=550; velocity=22; time=200 |
right micromanipulator; MM-33R | Warner Instrument Corporation | #64-0056 | |
Series Electrode Holder (45°, Vent, Handle, Ag Wire, 1.2 mm) | ADinstruments | #E45w-f10vh | |
STAT 2 IV Gravity Flow Controller | Conmed | #P-S2V-60 | |
vacuum generator ejector SEG – for suction to remove bath solution | Schmalz | – | |
Material | |||
INFUJECT 60ml pump syringes for solutions | Braun | #22050 | |
Injekt-F for lysing the oocytes | Braun | #9166033V | |
standard wall borosilicate tubing with filament | Sutter Instruments | #BF150-86-10 | outside diameter: 1.50 mm; inside diameter: 0.86 mm; length: 10 cm |
Reagent | |||
complete, Mini, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche Applied Science | #11836170001 | |
EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin | Thermo Scientific | #21217 | |
Horseradish peroxidase-labeled secondary goat anti-rabbit antibody | Santa Cruz Biotechnology | #sc-2004 | |
NeutrAvidin Agarose | Thermo Scientific | #29200 | Neutravidin-labeled agarose beads |
NP40 (Nonidet P-40) | Sigma-Aldrich | #I8896 | |
Roti-Load 1 (2× SDS-PAGE sample buffer) | Carl Roth | #K929.2 | |
SuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrate for detection of chemiluminescent signals | Thermo Scientific | #34095 | |
Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | #T8787 |