Summary
Elastin-liknande polypeptider är stimulans-lyhörd biopolymerer med applikationer från rekombinanta proteinrening till drug delivery. Detta protokoll beskriver rening och karakterisering av elastin-liknande polypeptider och deras peptid eller proteinfusioner från Escherichia coli med hjälp av deras lägre kritisk lösningstemperatur fasövergång beteende som ett enkelt alternativ till kromatografi.
Abstract
Elastin-liknande polypeptider är repetitiva biopolymerer som uppvisar en lägre kritisk lösningstemperatur fasövergång beteende, befintliga som lösliga Unimers under en karakteristisk övergångstemperatur och aggregering i mikrometerstorlek koacervat ovanför deras övergångstemperatur. Utformningen av elastin-liknande polypeptider på genetisk nivå medger exakt kontroll av deras sekvens och längd, som dikterar sina termiska egenskaper. Elastin-liknande polypeptider som används i en mängd olika tillämpningar, inklusive biosensing, vävnadsteknik, och läkemedelsavgivning, där övergångstemperaturen och biopolymeren arkitekturen i ELP kan avstämmas för den specifika tillämpningen av intresse. Dessutom är den lägre kritiska lösningstemperaturen fasövergång beteende elastin liknande polypeptider tillåter deras rening genom deras termiska respons, så att deras selektiva koacervation och resolubilisering möjliggör avlägsnandet av både lösliga och olösliga kontaminants efter expression i Escherichia coli. Denna metod kan användas för rening av ensamma eller som en reningsverktyg för peptid-eller proteinfusioner där rekombinanta peptider eller proteiner genetiskt bifogats elastin-liknande polypeptid taggar kan renas utan kromatografi elastin-liknande polypeptider. Detta protokoll beskriver rening av elastin-liknande polypeptider och deras peptid eller proteinfusioner och diskuterar grundläggande karakterisering tekniker för att bedöma den termiska beteende rena elastin liknande polypeptidprodukterna.
Introduction
Elastin-liknande polypeptider (ELPS) är biopolymerer som består av den repeterande pentapeptiden VPGXG där X, gäst rest, är vilken aminosyra som helst utom prolin. ELPs uppvisar lägre kritisk lösningstemperatur (LCST) fasomvandling beteende, så att en homogen ELP lösningen separera i två faser vid upphettning till dess LCST, som ofta kallas för den inversa ningstemperatur (T ^) i ELP litteratur 1. De två faserna består av en mycket utspädd ELP globule fas och en ELP rik sedimentfasen. ELP rika sediment bildas på en kort tidsskala vid aggregering av ELP-kedjorna i micron stora partiklar som sedan smälter samman. Detta inträffar över ett område av några få grader Celsius och är vanligtvis reversibla, som en homogen lösning utvinnes efter återgång till en temperatur under T ^.
ELPs är oftast syntetiseras i Escherichia coli (E. coli) from en artificiell gen som ligeras in i en expressionsplasmid. Denna plasmid transformerades därefter i en E. coli-cellinje som är optimal för proteinuttryck. Vi har uteslutande används T7-lac pET-vektorsystem för expression av en stor variation av ELPs i E. coli, fastän andra uttryckningssystem i jäst 2-4, svampar 5, och växter som 6-8 har också använts av andra forskare. Ett antal metoder finns för att genetiskt konstruera repetitiva ELP-gener, inklusive rekursiv riktad ligering (RDL) 9, rekursiv riktad ligering av plasmid rekonstruktion (pre-RDL) 10, och överlappar förlängning rullande cirkel amplifiering (OERCA) 11. Förmågan att konstruera ELPs på genetisk nivå ger möjlighet att använda rekombinanta DNA-tekniker för att skapa ELPs med olika arkitekturer (t.ex., monoblock, diblocks, trisegment etc), vilken kan läggas ytterligare med funktionellapeptider och proteiner. Kontroll på genetisk nivå säkerställer också att varje ELP uttrycks med den exakta längden och sammansättningen betingade av genetiska plasmid mall, som ger perfekt monodisperse biopolymera produkter.
De termiska egenskaperna för varje ELP bero på parametrar inneboende till biopolymeren såsom dess molekylvikt (MW) och sekvensen, samt yttre faktorer inklusive dess koncentration i lösning och närvaron av andra cosolutes, såsom salter. Längden av ELP 12 och dess gäst återstoden komposition 1, 13, 14 är två ortogonala parametrar i ELP konstruktion som kan användas för att styra T t, där hydrofoba gästrester och längre kedjelängder ger lägre T ^ s, medan hydrofila gästrester och kortare kedjelängder ger högre T T S. ELP koncentration är omvänt relaterad till T-T, där lösningar av greater ELP koncentration har lägre t t s 12. Den typ och koncentration av salter påverkar också ELP Tt, där effekten av salter följer Hofmeister-serien 15. Kosmotropic anjoner (Cl - och högre på Hofmeister-serien) sänker ELP T t och ökande saltkoncentration förstärker denna effekt. Dessa inre och yttre parametrar kan ställas in för att erhålla termiska beteende inom ett mål-temperaturområde som krävs för en specifik tillämpning av en ELP.
Stimulus-responsiv beteende ELPs är användbar för en mängd olika tillämpningar, inklusive biosensing 16, 17, vävnadsteknik 18 och läkemedelstillförsel 19, 20. Dessutom, när ELPs är fuserade till peptider eller proteiner på den genetiska nivån, kan ELP tjäna som en enkel reningsmarkör för att tillhandahålla en billig satsmetod för rening av rekombinant peptidvatten eller proteiner som inte kräver någon kromatografi 21. Modifiering av reningsprocessen säkerställer att aktiviteten av peptiden eller proteinet sammansmält med ELP bibehålls. Peptid-eller protein ELP-fusioner kan renas för applikationer där ELP-taggen är användbar 22, 23 eller alternativt, när det krävs fri peptid eller protein, kan en proteasigenkänningsställe införas mellan peptiden eller proteinet och ELP. Borttagning av ELP-taggen kan sedan uppnås genom uppslutning med gratis proteas eller ett proteas ELP fusion, där den senare ger det ytterligare lättare bearbetning som en sista omgång av ELP rening kan separera ELP-taggen och proteas ELP fusion från målet peptiden eller proteinet i ett enda steg 24, 25. Följande protokoll beskriver förfarandet för ELPs och peptid eller protein ELP-fusioner rening genom sina termiska egenskaper och diskuterar grundläggande tekniker för att karakteriseraden termiska respons av ELP produkter.
Protocol
1. ELP Expression
- Ympa 3 ml sterila Terrific Broth media med en DMSO lager eller agarplatta koloni av E. coli lämplig för proteinuttryck som innehåller den önskade ELP-kodning plasmid under kontroll av T7-lac-promotorn. Tillsätt en lämplig antibiotika och inkubera vid 37 ° C över natten (O / N) med kontinuerlig skakning vid 200 rpm.
- Tillsätt 1 ml O / N kulturen till 1 L av Terrific Broth sterila media i en 4-liters kolv. Tillsätt en lämplig antibiotika och inkubera vid 37 ° C under 24 h med kontinuerlig skakning vid 200 rpm. OBSERVERA: "läckande" baseline expression ses med T7-lac-promotorn är tillräcklig för högnivåexpression av många ELPs om kulturen inkuberas under 24 timmar. Emellertid kan man använda en mer konventionell metod, varvid proteinuttryck är vidare induceras genom tillsats av 0,2 till 1 mM isopropyl-beta-D-tiogalaktosid (IPTG), när den optiska densiteten av kulturen når 0,6. Överför kultur från 4-L-kolv till en 1-L centrifugflaska och centrifugera vid 4 ° C under 15 min vid 2000 x g..
- Kasta bort supernatanten. OBS: Om mer än 1 L kultur odlas de kan kondenseras genom att lägga till en annan liter kultur till pellets och upprepa steg 1.3. Upp till 2 liter kultur kan kondenseras till en enda cell pellet.
- Återsuspendera pelleten i fosfatbuffrad saltlösning (PBS), vatten eller annan önskad buffert för att nå 45 ml cellsuspension och överför till en 50 ml koniska rör.
2 ELP Rening:. Förberedelser och första rundan av Inverse Transition Cykling
- Sonikera suspenderades cellpelleten för totalt 9 min i cykler om 10 sek "på" och 20 sekunder "av" vid en uteffekt på 85 W, och samtidigt hålla provet på is. Tillåter kort på provet svalna på is och sedan upprepa 9 min cykel igen. OBS: Om ELP förutses för att ha en mycket låg T t Tt.
- Överför lysatet till en 50 ml rundbottnad centrifugrör.
- Tillsätt 2 ml 10% (vikt / volym) polyetylenimin (PEI) för varje liter odling och skaka för att blanda. OBS: PEI är en positivt laddad polymer som hjälper till vid kondensation av negativt laddade genetiska föroreningar. Utför inte den här åtgärden om ELP är negativt laddat, eftersom PEI kan också kondensera och avlägsna ELP produkten.
- Centrifugera vid 4 ° C under 10 min vid 16000 x g..
- Överför supernatanten till ett rent 50 ml rundbottnad centrifugrör och kasta pelleten.
- Eventuell "baka ut"-steget: Inkubera provet vid 60 ° C under 10 min för att denaturera proteinföroreningar och sedan överföra till 4 ° C eller till is tills ELP är helt resolubiliseras. Centrifugera provet vid 4 ° C under 10 min vid 16000 x g.. Överför supernatanten till ett clEAN 50 ml rund centrifugrör och kasta pelleten. OBS: Utför inte den här åtgärden om en peptid eller protein smält till ELP och förväntas denaturera i tillståndet av förhöjt värme. Detta kan leda till att ELP övergången till att bli värme irreversibel eller kan förstöra aktiviteten av smält delen.
- Inducera ELP övergång med tillsats av kristallint NaCl (högst 3 M). Alternativt kan natriumcitrat (som inte överstiger 0,3 M) användas för ELPs som har högre T ^ s eller låga utbyten. OBS! Lösningen ska vända grumlig när saltet har lösts upp, vilket indikerar att fasseparation av ELP från lösningen. Mycket hydrofila ELPs med hög T T S kan kräva en viss grad av upphettning, i kombination med tillsats av salt, för att inducera fasseparation av ELP i denna preliminära induktion av ELP övergång.
- Centrifugera vid rums temperatue (RT) under 10 min vid 16000 x g (varmcentrifugering). OBS: En ELP pellets ska be observeras, vars storlek beror på uttrycket avkastningen av ELP. Denna ELP pellets kan vid första verkar ogenomskinliga, men efter kylning det kommer att visas genomskinliga och kan vara brun i färgen. ELP pellets kommer att bli mer färglösa eftersom renings vinning och föroreningar tas bort.
- Kasta bort supernatanten och tillsätt 1-5 ml önskad buffert till pelleten. Resuspendera pelleten genom pipettering eller inställning röret att rotera vid 4 ° C. OBSERVERA: Den erforderliga volymen av bufferten kommer att bero på storleken på ELP pellet, och sålunda utbytet av ELP uttryck, där en tillräcklig mängd av bufferten bör tillsättas för att göra det möjligt för resolubilisering av ELP pelleten. ELPs med högt cystein content nytta rening i vatten med 10 mM Tris (2-karboxietyl) fosfin hydroklorid (TCEP-HCl) vid pH 7 för att eliminera disulfid interaktioner med kontaminerande proteiner. ELPs med hög laddningsinnehåll nytta rening vid ett pH-justeras för att neutralisera sin laddning och minskar electrostatic interaktioner med kontaminerande proteiner.
- Överför den suspenderade ELP-lösning i 1 ml portioner i rena 1,5-ml mikrorör.
- Centrifugera vid 4 ° C under 10 min vid 16000 x g (kall centrifugering). Bör observeras En liten pellet av olösliga föroreningar.
- Överför supernatanten till ett rent rör och kasta pelleten.
. 3 ELP Rening: Efterföljande rundor av Inverse Transition Cycling
- Inducera ELP övergång med värme och / eller tillsats av NaCl. Prover kan inkuberas på ett värmeblock eller i ett vattenbad under 15 min vid en temperatur över T ^. Om emellertid ELP fuserad till ett protein (det utesluter användning av värme) eller om ELP har en hög T ^, som inte kan uppnås med enbart värme, en 5 M lösning av NaCl kan tillsättas droppvis för att inducera ELP övergång. OBS: Lösningen ska vända grumlig, vilket indikerar att fasseparation av ELP från lösningen.
- Kasta bort supernatanten, tillsätt 500 till 750 | il av önskad buffert, och återsuspendera pelleten genom pipettering eller inställning röret att rotera vid 4 ° C.
- Centrifugera vid 4 ° C under 10 min vid 16000 x g (kall centrifugering). Bör observeras En liten pellet av olösliga föroreningar.
- Överför supernatanten till ett rent rör och kasta pelleten.
- Upprepa steg från 3,1 till 3,5 tills ingen förorening pellets observeras under steg 3.4.
4. Post-rening Processing (tillval)
- Om du vill kan dialysera provet mot en lämplig buffert för att avlägsna överflödigt salt från det renade ELP lösningen. Anmärkning ELPs som skall lyofiliseras bör varadialyseras mot DDH 2 OO / N vid 4 ° C.
- Om så önskas lyofilisera ELP för långtidslagring genom frysning av lösningen vid -80 ° C under 30 min före lyofilisering O / N. OBS: Frystorkning bör inte användas för ELPs med bifogade proteiner.
- Om så önskas återvinna fri peptid eller protein från en peptid eller ett protein ELP fusion genom att avlägsna ELP tag:
- Digerera peptiden eller proteinet ELP fusion med biotinylerad proteas (såsom rekommenderas av proteas leverantören) eller med ett proteas ELP fusion motsvarande den proteasställe genetiskt utformad mellan peptiden eller proteinet och ELP.
- I förekommande fall, ta bort den biotinylerade proteas med hjälp av streptavidin-modifierade pärlor (som rekommenderas av proteas leverantören).
- Framkalla övergången av den kluvna ELP-och / eller proteas ELP fusion av droppvis tillsats av en 5 M NaCl-lösning.
- Centrifugera vid RT under 10 min vid 16000 x g.. OBS: En ELP pellets bör iakttas.
- Samla supernatanten och kassera ELP pellets. Dialysera supernatanten mot en önskad buffert eller använda en centrifugal-filter för att utföra ett buffertbyte för att avlägsna den höga saltkoncentrationen från den rena peptiden eller proteinet lösning.
- Kontrollera fullständig klyvning av fri peptid eller protein från ELP tagg genom natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE).
5 Karaktärisering:. SDS-PAGE
- Förbered ELP prover för SDS-PAGE genom att blanda 10 | il av ELP utspädda i vatten med 10 | il provbuffert innehållande 2-merkaptoetanol. OBS: 40 pg av ELP är ofta tillräckligt för att bedöma storleken och renheten av ELP produkten.
- Inkubera provet vid 100 ° C under 2 min och sedan lasta på en polyakrylamidgel tillsammans med en lämpligt dimensionerad protein stege.
- Kör gelen vid 180 V tills färgen närmar sig botten av gelén (cirka 45 min).
- Fläckgel med en 0,5 M CuCl2-lösning under 5 min, medan gunga. OBS! ELPs är normalt inte synliga genom Coomassie Brilliant Blue fläck, som vissa ELP sekvenser inte interagerar med denna färg. Coomassie Brilliant Blue interagerar i första hand med argininrester och interagerar svagt med andra basiska rester-histidin och lysin-och aromatiska rester-tryptofan, tyrosin och fenylalanin 26. Sålunda ELPs och peptid-eller protein ELP-fusioner kan färgas med Coomassie Brilliant Blue endast om deras primära sekvensen innehåller ett tillräckligt antal av dessa specifika rester.
- Kontrollera att MW ELP bandet motsvarar den för den teoretiska MW väntas från ELP-genen och att inga ovidkommande förorenande band är närvarande. OBS: Vissa ELPs migrerar med en skenbar MW upp till 20% högre än den förväntade MW 9, 27.
6 Karakterisering:. Matrix-assisted laser desorption /ionization Time-of-Flight-masspektrometri (MALDI-TOF-MS)
- Preparera en ELP-lösning i 50% vattenhaltig acetonitril innehållande 0,1% trifluoroättiksyra för att uppnå en ELP koncentration av ca 25 pM. OBS: Denna lösning ska vara fri från salt, så ELP måste dialyseras mot H2O efter rening.
- Bered en matrislösning av mättad sinapinsyra i 50% vattenhaltig acetonitril innehållande 0,1% trifluorättiksyra.
- Tillsätt 1 l av ELP-lösning till 9 l av matrisen lösningen för att uppnå en ELP koncentration på ca 2,5 pmol / ul. OBS: Denna blandning kan spädas ytterligare med matrislösning för att optimera MALDI-TOF-signal.
- Deposition 1-2 l av ELP-matris blandningen på en metall MALDI platta och låt fläcken torka helt.
- Skaffa 5-10 spektra med MALDI-TOF för att bestämma massan för att ladda förhållande (m / z) i ELP och avleda dess uppmätta MW.
7. Characterization: Temperatur programmerade Turbidimetri och dynamisk ljusspridning
- Bestäm Tt av ELP med temperaturprogrammerad turbidimetri:
- Bered en spädningsserie (t.ex. 5-100 M) av ELP-lösningar i önskad buffert.
- Med hjälp av en temperaturkontrollerad UV-Vis spektrofotometer, mäta den optiska densiteten (OD) vid 350 nm över ett område av temperaturer (t.ex. 20-80 ° C) med en upphettningshastighet av 1 ° C / min. OBS: Om ingen ökning i OD sett T t får överstiga den övre temperaturgränsen för instrumentet. Den sken Tt kan minskas genom tillsats av NaCl. Start vid 1 M NaCl och öka i steg om 0,5 M tills ELP övergången detekteras inom en mätbar temperaturområde.
- Verifiera reversibilitet ELP övergång genom att mäta minskningen i OD över samma temperaturområde vid en kylningshastighet av 1 ° C / min.
- Bestäm Tt av homopolymer ELP genom att identifiera en brytpunkt av turbiditeten profilen (OD avsattes mot temperatur). OBS: Denna temperatur kan lätt definieras från derivatan av OD-kurvan, där temperaturen som motsvarar det maximala av derivatet är definierad som T ^. Mer komplexa ELP arkitekturer kommer att visa mer komplicerade grumlighetsprofiler och bör analyseras vidare enligt beskrivningen i avsnitt 7.2.
- Ytterligare karakterisering av ELPs som visar mer komplexa termiska egenskaper (t.ex. ELP disegmentsampolymerer att själv montera in sfäriska miceller) uppnås genom dynamisk ljusspridning (DLS):
- Bered en ELP-lösning i önskad buffert och sålla provet genom ett filter med en 20 till 450 nm porstorlek. OBS: Valet av filter porstorlek beror på närvaro, storlek och stabilitet för eventuella ELP-församlingar i lösning. Den minsta möjliga filter porstorlek är föredragen för att eliminera föroreningar, såsomdamm, som minskar kvaliteten på DLS mätningar. En större filter porstorlek bör användas när betydande motstånd upplevs vid passage av en ELP-lösning genom mindre filter porstorlek.
- Mät den hydrodynamiska radien (R H) över ett intervall av temperaturer, som motsvarar en region av intresse som identifierats i grumlighet profilen. OBS: ELP Unimers har normalt en R H <10 nm, nanopartiklar församlingar har en R-H ~ 20-100 nm, och aggregaten har en R-H> 500 nm. Varje ökning av R H bör motsvara en ökning av OD vid 350 nm mättes genom UV-Vis-spektrofotometri såsom en funktion av temperatur, som är proportionell mot storleken av partikeln.
Representative Results
Här beskriver vi representativa resultat för rening och karakterisering av en ELP homopolymer och ett ELP disegmentsampolymer. Efter 24 h av expression i E. coli-cellerna uppsamlades genom centrifugering och lyserades genom sonikering. Normalt uppstår en subtil förändring i färg efter ultraljudsbehandling, vilket bekräftar tillräcklig cellys (Figur 1A). Efter tillsatsen av PEI, är genomiska komponenter och cellrester genom centrifugering, separation av en stor pellet av olösliga föroreningar från den lösliga ELP i supernatanten (Figur 1B). ELP renas ytterligare genom invers omvandling cykling (ITC), som utnyttjar LCST beteende att separera ELP från både lösliga och olösliga föroreningar (figur 2) 28. Fasövergången för ELP utlöses genom tillsats av värme och / eller salt. Centrifugeresulterar i bildning av en pellet i botten av röret, som består av ELP ennd några olösliga föroreningar (Figur 1C). Detta steg-kallas en varm spin-utrangeringar lösliga föroreningar i supernatanten medan ELP pellets behålls och suspenderades i kall buffert. Den resolubiliseras ELP centrifugeras igen vid 4 ° C. Detta steg-kallas en kall spin-kastas överbord i pellets av olösliga föroreningar medan supernatanten innehållande lösliga ELP bibehålls. Upprepning av cykeln av omväxlande varma och kalla spins ökar renheten av ELP, men på bekostnad av något minskande utbyte, som rest ELP förloras under varje ITC runda i centrifugrör och på pipettspetsar.
Lyckad rening av ELPs och peptid-eller protein ELP-fusioner bekräftas genom SDS-PAGE. Små alikvoter som tas under hela reningsprocessen visar den progressiva reningen av ELP från E. coli-lysat. ELP överuttrycks i den råa E. coli lysat och föroreningar minskar kvickheth successiva rundor av ITC (Figur 3). Renat ELP visas som ett enda band i närheten av den förutsagda teoretisk MW.
ELP T t präglas av temperaturprogrammerad turbidimetri. Den grumlighet profilen för en ELP homopolymer uppvisar en kraftig ökning av OD vid 350 nm (ca 2,0 enheter över baslinjen för en ELP koncentration av 25 M) (Figur 4A). Kylning grumlighet avsökningar bekräfta den reversibla naturen av ELP övergång som OD återgår till baslinjen när temperaturen sänks under T t (Figur 4B). ELP disegmentsampolymerer uppvisar en mer komplex grumlighet profil, i jämförelse med homopolymeren ELPs. OD ökar vanligtvis först till 0,1-0,5 enheter över utgångsvärdet, varefter OD ökar kraftigt till 2,0 enheter över baslinjen (Figur 5A). DLS mätningar ger information om ändringen i R H med avseende på temperatur, co rroborating den information de fått från grumlighet profilen (Figur 5B).
Figur 1. Preliminär ELP rening. Efter 24 timmar av uttryck, E. coli-celler uppsamlades genom centrifugering och återsuspenderades i PBS. är A) Celler lyserades genom sonikering, som åtföljs av en subtil förändring i färg så att lysatet mörknar efter sonikering. B) Efter tillsats av PEI för att kondensera DNA-kontaminanter, är lysatet centrifugeras och en stor pellet av olösligt skräp separeras från lösligt ELP i supernatanten. C) ELP övergången induceras med tillsats av värme och / eller salt och centrifugeringsformer en genomskinlig ELP pellet.ank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Invers övergång cykling. ELP renas medelst dess LCST beteende från både lösliga och olösliga föroreningar. Börjar med ELP-rika lysat (1) ELP övergången induceras med tillsats av värme och / eller salt och ELP separeras genom centrifugering (varmcentrifugering) (2). ELP pellet behålls (3a) medan supernatanten innehållande lösliga föroreningar kastas (3b). ELP återsuspenderas i kall buffert (4) och centrifugerades på nytt vid 4 ° C (kall centrifugering) (5). Den pellet som innehåller olösliga föroreningar kastas (6a) medan supernatanten innehållande lösliga ELP behålls (6b). Cykler av omväxlande varma och kalla snurrar upprepas tills den önskade renheten har uppnåtts, enligt bestämning medSDS-PAGE. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. SDS-PAGE-analys av ELP-reningsprodukter. Lyckad rening av en ELP bekräftas genom SDS-PAGE. Overexpressed ELP är tydligt i den råa E. coli lysat efter ultraljudsbehandling (2). Efter tillsatsen av PEI och centrifugering av den lösliga ELP är till stor del kvarhålls i den överstående vätskan (3), även om vissa ELP går förlorad i den kasserade pelleten av olösliga föroreningar (4). Supernatanten efter den första varma spinn innehåller betydande halter av lösliga föroreningar (5). Supernatanten efter den första kalla spin indikerar god separation av ELP från olösliga föroreningar (6). Ytterligare cykler av varma (7) och cgammal snurrar (8) avlägsnande av kvarvarande lösliga och olösliga föroreningar, respektive, tills de slutliga varma (9) och kall spin (10) supernatanter uppvisar inga ovidkommande förorenande band, vilket bekräftar tillfredsställande renhet ELP produkten. Denna ELP homopolymer, med en sekvens av SKGPG-(VGVPG) 80-Y, har en förväntad molekylvikt på 33.37 kDa. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Karakterisering av ELP homopolymeren av temperaturprogrammerad turbidimetri. ELP T t bestäms genom övervakning av OD vid 350 nm, medan ökning av temperaturen med en hastighet av 1 ° C / min. A) ELP-homopolymerer uppvisar en enda skarp ökning av OD som defines deras T t vid en viss koncentration. B) reversibilitet ELP övergången verifieras genom övervakning av OD vid 350 nm i en 25 μ M lösning samtidigt minska temperaturen, där reversibilitet bekräftas av returen av OD till baslinjen. Denna ELP homopolymer har sekvensen SKGPG-(VGVPG) 80-Y. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Karaktärisering av ELP disegmentsampolymeren av temperaturprogrammerad turbidimetri och dynamisk ljusspridning. ELPs som genomgår nanonivå självorganisering, exempelvis ELP disegmentsampolymerer att själv montera in sfäriska miceller, uppvisar mer komplexa grumlighetsprofiler.
Discussion
ELPs erbjuda ett billigt och kromatografiska fria medel för rening med utnyttjande av deras stimulans svarande fasbeteende. Detta tillvägagångssätt drar fördel av LCST beteende ELPs och peptid-eller protein ELP-fusioner för att eliminera både lösliga och olösliga föroreningar efter expression av genetiskt kodade ELPs i E. coli. Denna enkla rening kan användas för att producera ELPs för en mängd olika tillämpningar, eller kan utnyttjas för rening av rekombinanta peptider eller proteiner i vilka ELP kan agera som en reningsmarkör som kan tas bort med efterreningsbehandling.
ELP rening innebär förberedande steg för att lysera E. coli och ta bort iska och olösliga cellfragment från den råa kulturen lysatet (Figur 1), följt av avlägsnande av kvarvarande lösliga och olösliga föroreningar från ITC (Figur 2). Centrifugering efter utlösning ELP övergången av ytterligarening av värme eller saltet separerar ELP från lösliga föroreningar i supematanten, i ett steg benämns en varm spinn. Efter resolubilizing ELP, lösningen centrifugerades igen vid en temperatur under T ^ för att avlägsna den olösliga kontaminant pellet, i ett steg benämns en kall spinn. Omväxlande varma och kalla spins förbättrar renheten för ELP lösningen med varje cykel, till en liten kostnad för att ge. Renings utbytena varierar beroende på ELP T t, längd och fuserade peptider eller proteiner. Normalt ger detta protokoll 100 mg renat ELP per liter E. coli-kultur, men avkastningen kan nå upp till 500 mg / L. Den slutliga renheten hos ELP produkt bekräftas genom SDS-PAGE (fig 3). Den MW av det renade ELP ska matcha ett nära samarbete med den teoretiska MW kodas av ELP-genen. Men vissa ELPs migrerar i SDS-PAGE med en skenbar molekylvikt på upp till 20% högre än den förväntade MW 9, 27. Mer exakt analys av ELPMW kan uppnås genom MALDI-TOF-MS, vilket också kan ge ytterligare information om renhet ELP produkten tillsammans med ortogonala analytiska tekniker såsom högpresterande vätskekromatografi (HPLC).
Efter rening är ELP T t mäts av temperaturprogrammerad turbidimetri. Denna teknik övervakar OD av en ELP lösning medan temperaturen ökas. The T t är koncentrationsberoende så är det lämpligt att karakterisera en koncentrationsserie relevant för den avsedda tillämpningen av ELP. För ELP homopolymerer turbiditeten profil uppvisar en enda skarp ökning som motsvarar den ELP övergången från Unimer till mikrometerstorlek aggregat (Figur 4A). The T t definieras som den temperatur som motsvarar inflektionspunkten i grumlighet profilen bestämmas exakt som den maximala av den första derivatan av OD i förhållande till temperaturen. Den reversibilitetELP fasövergång bekräftas av en minskning i OD till baslinjen som temperaturen sänks under Tt (Figur 4B). Den grumlighet profil med ökande och minskande temperaturramper kommer att skilja sig åt i storlek och kinetik grund av sedimente av ELP koacervat och variabel hysteres i ELP resolubilisering. Peptid eller protein ELP-fusioner på liknande sätt uppvisar LCST uppträdande på detta sätt, där peptiden eller proteinet sammansmält med ELP påverkar T t. För protein ELP-fusioner övergången är reversibel under smälttemperaturen hos proteinet. Medan temperaturprogrammerad turbidimetri är en utmärkt metod för den inledande termisk karakterisering av ELP-produkter, alternativa tekniker, såsom differentiell svepkalorimetri (DSC), kan också användas för att mäta den ELP Tt.
ELPs med mer komplexa arkitekturer uppvisar mer komplicerade termiska beteenden som också kan kännetecknas av temperatur-programmed turbidimetri. ELP disegmentsampolymerer, till exempel, uppvisar ett karakteristiskt grumlighet profil som motsvarar deras temperatur-utlöst självorganisering till sfäriska miceller vid deras kritiska micellization temperatur. För sådana ELP disegmentsampolymerer OD ökar vanligtvis först 0,1-0,5 enheter ovanför baslinjen indikerar övergången från Unimers till miceller, varefter en kraftig ökning av OD (upp till 2,0 enheter över baslinjen) vid en högre temperatur indikerar bildandet av mikrometerskala aggregat (Figur 5A). Ytterligare information om temperatur-utlöst själv monterade ELP strukturer erhålls med DLS, en teknik som mäter R H av ELP-aggregat i lösning. Förändringar i R H överens nära med förändringar i OD mätt med turbidimetri (Figur 5B). ELP Unimers uppvisar normalt en R H <10 nm medan nanopartiklar församlingar uppvisar ett R H ~ 20-100 nm och aggregat uppvisar en R H 17, 23, 29.
På grund av avstämbarhet av ELP termiska egenskaper, är ett urval av T t s erhålls genom olika ELP mönster. Det är viktigt att hålla i minnet att det inneboende T t kommer att påverka optimeringen av reningsprotokollet för varje ELP, där extremt låg eller hög T T S kräver mest modifiering av denna standardprotokoll. ELPs med extremt höga övergångstemperaturer kan vara olämpliga för rening med detta tillvägagångssätt. Om konstruktionen av nya ELPs och peptid eller protein ELP-fusioner kan äventyra den termiska respons av ELP, kan en enkel histidinmärkning inkluderas för alternativ rening genom immobiliserad metall affinitetskromatografi. Dessutomegenskaper ELP sekvensen kan kräva modifiering av detta protokoll om gästen återstoden debiteras. Manipulering av pH kan användas som en metod för att ändra den totala laddningen av ELP i ett försök att eliminera elektrostatiska interaktioner med föroreningar 17. Dessutom är lämplig för den särskilda omständighet av ELP fusioner med peptider och proteiner när lämpliga åtgärder vidtagits för att säkerställa reningsprocessen inte störa aktiviteten hos den sammansmälta delen detta protokoll. Anteckningar hela protokollet om sådana ändringar tjänar till direkt rening av ELPs som kan presentera dessa utmaningar med avseende på T t, laddning, eller fusions oro.
Reningen av ELPs medelst deras LCST beteende presenteras en enkel och kromatografi fritt tillvägagångssätt för att rena huvuddelen av ELPs och peptid-eller protein ELP fusioner uttrycks i E. coli. Protokollet sammanfattas här tillåter rening of ELPs i en enda dag med hjälp av utrustning som är gemensamma för de flesta biologiska laboratorier. Lättheten att reningen av ELPs och deras fusioner kommer, hoppas vi, uppmuntra ett ständigt växande mångfald av ELP mönster för nya tillämpningar inom materialvetenskap, bioteknik och medicin.
Disclosures
Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NSF: s Research Triangle MRSEC (DMR-1.121.107).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pET-24a(+) pET-25b(+) |
Novagen | 69749-3 69753-3 |
T7-lac expression vectors with resistance to kanamycin (pET-24) or ampicillin (pET-25). |
| Ultra BL21 (DE3) competent cells | Edge BioSystems | 45363 | Competent E. coli for recombinant protein expression. |
| Terrific Broth (TB) Dry Powder Growth Media | MO BIO Laboratories | 12105 | Media is reconstituted in DI H2O and autoclaved before use. |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactoside (IPTG) | Gold Biotechnology | I2481C | IPTG is reconstituted in DI H2O, sterile filtered, and added to cultures to induce enhanced expression. |
| Phosphate buffered saline (PBS) tablet | Calbiochem | 524650 | These PBS tablets, when dissolved in 1 L of DI H2O, yield a 10 mM phosphate buffer with 140 mM NaCl, and 3 mM KCl with a pH of 7.4 at 25 °C. |
| Polyethyleneimine (PEI) Solution (~50% w/v) | MP Biomedicals | 195444 | PEI is prepared as a 10% (w/v) solution in deionized H2O. |
| Nalgene Oak Ridge high-speed centrifuge tubes, 50 ml | Thermo Scientific | 3138-0050 | These round-bottom tubes withstand high-speed centrifugation of 30-50 ml. |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP-HCl) | Thermo Scientific | 20491 | A stock solution of TCEP-HCl is prepared at 100 mM in DI H2O and adjusted to pH 7.0. For ELPs with a high cysteine content the stock solution of this reducing agent is added to the ELP pellet to reach 10 mM in H2O. |
| Ready Gel Tris-HCl gel, 4-20% linear gradient polyacrylamide gel, 10 well, 30 μl | Bio-Rad Laboratories | 161-1105 | These linear gradient gels offer good visualization of ELPs with a range of MWs. |
| Cupric chloride dihydrate (CuCl2·2H2O) | Fisher Scientific | C454-500 | A filtered 0.5 M solution is prepared for negative staining of Tris-HCl polyacrylamide gels. |
| Anotop 10 syringe filter: 0.02 μm 0.1 μm 0.2 μm |
Whatman | 6809-1002 6809-1012 6809-1022 |
These 10-mm diameter syringe filters allow preparation of small volumes for DLS measurements. |
| Millex-HV filter: 0.45 μm |
EMD Millipore | SLHVX13NK | These 13-mm diameter syringe filters allow preparation of small volumes of solutions with large nanoparticle assemblies for DLS measurements. |
References
- Urry, D. W. Physical Chemistry of Biological Free Energy Transduction As Demonstrated by Elastic Protein-Based Polymers. J. Phys. Chem. B. 101, 11007-11028 (1997).
- Sallach, R. E., Conticello, V. P., Chaikof, E. L. Expression of a recombinant elastin-like protein in pichia pastoris. Biotechnology progress. 25, 1810-1818 (2009).
- Schipperus, R., Teeuwen, R. L., Werten, M. W., Eggink, G., de Wolf, F. A. Secreted production of an elastin-like polypeptide by Pichia pastoris. Appl Microbiol Biotechnol. 85, 293-301 (2009).
- Schipperus, R., Eggink, G., de Wolf, F. A. Secretion of elastin-like polypeptides with different transition temperatures by Pichia pastoris. Biotechnology progress. 28, 242-247 (2012).
- Herzog, R. W., Singh, N. K., Urry, D. W., Daniell, H. Expression of a synthetic protein-based polymer (elastomer) gene in Aspergillus nidulans. Appl Microbiol Biotechnol. 47, 368-372 (1997).
- Conley, A. J., Joensuu, J. J., Jevnikar, A. M., Menassa, R., Brandle, J. E. Optimization of elastin-like polypeptide fusions for expression and purification of recombinant proteins in plants. Biotechnology and bioengineering. 103, 562-573 (2009).
- Conrad, U., et al. ELPylated anti-human TNF therapeutic single-domain antibodies for prevention of lethal septic shock. Plant biotechnology journal. 9, 22-31 (2011).
- Kaldis, A., et al. High-level production of human interleukin-10 fusions in tobacco cell suspension cultures. Plant biotechnology journal. 11, 535-545 (2013).
- Meyer, D. E., Chilkoti, A. Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system. Biomacromolecules. 3, 357-367 (2002).
- McDaniel, J. R., Mackay, J. A., Quiroz, F. G., Chilkoti, A. Recursive directional ligation by plasmid reconstruction allows rapid and seamless cloning of oligomeric genes. Biomacromolecules. 11, 944-952 (2010).
- Amiram, M., Quiroz, F. G., Callahan, D. J., Chilkoti, A. A highly parallel method for synthesizing DNA repeats enables the discovery of 'smart' protein polymers. Nat Mater. 10, 141-148 (2011).
- Meyer, D. E., Chilkoti, A. Quantification of the effects of chain length and concentration on the thermal behavior of elastin-like polypeptides. Biomacromolecules. 5, 846-851 (2004).
- Urry, D. W., et al. Temperature of Polypeptide Inverse Temperature Transition Depends on Mean Residue Hydrophobicity. Journal of the American Chemical Society. 113, 4346-4348 (1991).
- Urry, D. W. The change in Gibbs free energy for hydrophobic association - Derivation and evaluation by means of inverse temperature transitions. Chem Phys Lett. 399, 177-183 (2004).
- Cho, Y., et al. Effects of Hofmeister anions on the phase transition temperature of elastin-like polypeptides. The journal of physical chemistry. B. 112, 13765-13771 (2008).
- Kim, B., Chilkoti, A. Allosteric actuation of inverse phase transition of a stimulus-responsive fusion polypeptide by ligand binding. J Am Chem Soc. 130, 17867-17873 (2008).
- Hassouneh, W., Nunalee, M. L., Shelton, M. C., Chilkoti, A. Calcium binding peptide motifs from calmodulin confer divalent ion selectivity to elastin-like polypeptides. Biomacromolecules. 14, 2347-2353 (2013).
- Nettles, D. L., Chilkoti, A., Setton, L. A. Applications of elastin-like polypeptides in tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 62, 1479-1485 (2010).
- MacEwan, S. R., Chilkoti, A. Elastin-like polypeptides: biomedical applications of tunable biopolymers. Biopolymers. 94, 60-77 (2010).
- McDaniel, J. R., Callahan, D. J., Chilkoti, A. Drug delivery to solid tumors by elastin-like polypeptides. Adv Drug Deliv Rev. 62, 1456-1467 (2010).
- Hassouneh, W., Christensen, T., Chilkoti, A. Elastin-like polypeptides as a purification tag for recombinant proteins. Curr Protoc Protein Sci. , (2010).
- Shamji, M. F., et al. Development and characterization of a fusion protein between thermally responsive elastin-like polypeptide and interleukin-1 receptor antagonist: sustained release of a local antiinflammatory therapeutic. Arthritis Rheum. 56, 3650-3661 (2007).
- Hassouneh, W., et al. Unexpected multivalent display of proteins by temperature triggered self-assembly of elastin-like polypeptide block copolymers. Biomacromolecules. 13, 1598-1605 (2012).
- Lan, D. M., et al. An improved nonchromatographic method for the purification of recombinant proteins using elastin-like polypeptide-tagged proteases. Analytical Biochemistry. 415, 200-202 (2011).
- Bellucci, J. J., Amiram, M., Bhattacharyya, J., McCafferty, D., Chilkoti, A. Three-in-one chromatography-free purification, tag removal, and site-specific modification of recombinant fusion proteins using sortase A and elastin-like polypeptides. Angewandte Chemie. 52, 3703-3708 (2013).
- Compton, S. J., Jones, C. G. Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay. Anal Biochem. 151, 369-374 (1985).
- McPherson, D. T., Xu, J., Urry, D. W. Product purification by reversible phase transition following Escherichia coli expression of genes encoding up to 251 repeats of the elastomeric pentapeptide GVGVP. Protein expression and purification. 7, 51-57 (1996).
- Meyer, D. E., Chilkoti, A. Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides. Nat Biotechnol. 17, 1112-1115 (1999).
- McDaniel, J. R., et al. Self-assembly of thermally responsive nanoparticles of a genetically encoded peptide polymer by drug conjugation. Angewandte Chemie. 52, 1683-1687 (2013).
