Summary
엘라스틴 같은 폴리펩티드는 재조합 단백질 정제의 약물 전달에 이르기까지 다양한 응용 프로그램과 자극 - 반응 생물 고분자 물질이다. 이 프로토콜은 크로마토 그래피를 간단한 대안으로 그들의 낮은 임계 용액 온도 상전이 거동을 이용하여 대장균에서 엘라스틴 같은 폴리펩티드 및 그 펩티드 또는 단백질 융합체의 정제 및 특성을 설명한다.
Abstract
엘라스틴 같은 폴리펩티드 특징 전이 온도 이하로서 수용성 unimers 기존 그들의 전이 온도 이상 마이크론 스케일 코아세르베이트로 집계 낮은 임계 용액 온도 상전이 거동을 나타낼 반복적 바이오 폴리머이다. 유전자 수준에서 엘라스틴과 같은 폴리 펩타이드의 디자인은 자신의 열 특성을 지시 그들의 순서와 길이의 정밀한 제어를 허용합니다. 엘라스틴 같은 폴리펩티드는 바이오 센싱, 조직 공학 및 ELP의 전이 온도 및 생체 고분자의 구조는 또한 특정 애플리케이션에 대해 튜닝 될 수 약물 전달을 포함한 다양한 애플리케이션에 사용된다. 또한, 엘라스틴 같은 폴리펩티드의 낮은 임계 용액 온도 상전이 거동은 열 반응에 의해 그 자신의 정화를 허용 선택적 코아 세르 베이션 및 resolubilization 허용되도록 모두, 수용성 오염 물질의 제거의 대장균에서 발현 다음. 이 접근법은 엘라스틴 같은 폴리펩티드 단독으로 또는 유 전적으로 엘라스틴 같은 폴리펩티드 태그에 첨부 된 재조합 펩타이드 또는 단백질 크로마토없이 정제 될 수 펩타이드 또는 단백질 융합체를위한 정제 도구로의 정제를 위해 사용될 수있다. 이 프로토콜은 엘라스틴과 같은 폴리 펩타이드 및 그 펩타이드 또는 단백질 융합의 정화를 설명하고 순수한 엘라스틴 같은 폴리 펩타이드 제품의 열적 거동을 평가하는 기본 특성 기술에 대해 설명합니다.
Introduction
엘라스틴 같은 폴리펩티드 (ELPs)는 X, 숙박객 잔기는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산 임 반복 펜타의 VPGXG 이루어지는 바이오 폴리머이다. ELPs 전시 낮은 임계 용액 온도 (LCST) 상전이 거동, 균질 ELP 용액 일반적 ELP 문헌 1에서 역 전이 온도 (T의 t)라고 그 LCST로 가열하여 두 단계로 분리하는 것 등. 2 개의 상을 매우 묽은 ELP의 구체 상과 ELP 풍부한 침전물 단계로 구성된다. ELP 풍부한 침전물이어서 유착 미크론 크기의 입자로 ELP 사슬의 응집시 짧은 시간 척도에 형성된다. 이 문제는 몇 ℃의 범위에서 발생하고, 균일 한 용액 T를 t 이하의 온도로 복귀시 회수로서, 일반적 가역적이다.
ELPs는 일반적으로 아프로 대장균 (E. 콜라이)에서 합성된다발현 플라스미드로 결찰 된 인공 유전자를 해요. 이 플라스미드는 다음 E.로 변신 단백질 발현을위한 최적 대장균 세포 라인. 우리는 독점적으로 E.에 ELPs의 큰 다양성의 표현 T7-락 애완 동물 벡터 시스템을 사용했습니다 대장균, 효모 2-4, 곰팡이 5, 식물 6-8의 다른 표현 시스템이 다른 연구자에 의해 이용되어 있지만. 방법의 수는 유 전적으로 재귀 방향 결찰 (RDL) 9, 플라스미드 재건 (PRE-RDL) (10)에 의해 순환 방향 결찰을 포함, 반복적 인 ELP 유전자를 구축에 존재하고, 확장 압연 원형 증폭 (OERCA)를 11 겹칩니다. 유전자 수준에서 ELPs을 설계하는 능력은 추가 기능이 추가 될 수있는 다양한 아키텍처 (예, 모노 블럭, 디 블록, triblocks 등)로 ELPs를 만드는 재조합 DNA 기술을 사용하는 기회를 준다펩타이드 및 단백질. 유전자 수준에서 제어는 각 ELP는 완벽하게 단 분산 생체 고분자의 제품을 제공, 정확한 길이와 유전자 플라스미드 템플릿에 의해 결정 성분으로 표현되도록합니다.
각 ELP의 열적 특성은 분자량 (MW) 및 시퀀스뿐만 아니라, 그 용액의 농도 등의 염과 같은 다른 cosolutes의 존재 등 외적 요인으로서 생체 고분자에 고유 파라미터들에 달려있다. ELP (12)과 그 숙박객 잔류 조성물의 길이가 1, 13, 14, 소수성 숙박객 잔기 및 긴 사슬 길이가 낮은 T의 t 초 초래할 T의 t를 제어하는 데 사용될 수 ELP 디자인이 직교 파라미터 반면 친수성은 게스트 잔류 짧은 사슬 길이가 높은 T의 T s의 결과. ELP 농도는 반비례의 T t, GR의 해법 관련된공룡 ELP 농도가 낮은 T의 T의 12가있다. 염의 종류 및 농도는 염의 효과 Hofmeister에서 시리즈 (15)를 다음과 ELP T의 t를, 영향을 미친다. 코스모 트로픽 음이온 된 (C1 - 그리고 Hofmeister에서 시리즈 이상) ELP T (T)를 낮추고 증가 소금 농도는이 효과를 향상시킵니다. 이러한 고유 및 비 고유 파라미터 ELP의 특정 어플리케이션에 필요한 목표 온도 범위 내에서 열적 거동을 얻기 위하여 조정될 수있다.
ELPs의 자극에 반응하는 동작은 바이오 센서 (16, 17), 조직 공학 (18) 및 약물 전달 (19, 20)를 포함하여 다양한 애플리케이션에 유용하다. ELPs는 유전자 수준에서 펩티드 또는 단백질에 융합되는 경우 또한, ELP 재조합 PEP 정화용 저렴 배치 방법을 제공하는 간단한 정제 태그로서 역할을 할 수더 크로마토 그래피 (21)를 필요로하지 않는다 조수 또는 단백질. 정제 공정의 변형 ELP에 융합 된 펩티드 또는 단백질의 활성이 유지되는 것을 보장한다. 펩티드 또는 단백질 ELP 융합체는 ELP 태그 (22), (23) 또는 대안 적으로, 프리 펩티드 또는 단백질이 필요한 경우, 단백질 분해 효소 인식 부위가 펩티드 또는 단백질과 ELP 사이에 삽입 될 수있는 유용한되는 애플리케이션에 정제 할 수있다. ELP 태그의 제거는 자유 프로테아제 또는 후자 대상 펩티드 또는부터 ELP 태그와 프로테아제 ELP 융합을 분리 할 수 ELP 정제의 최종 라운드로 처리 부가 용이성을 제공 프로테아제 ELP 융합체와 소화함으로써 달성 될 수있다 단일 단계 (24, 25)의 단백질. 다음 프로토콜은 자신의 열 특성에 의해 ELPs 펩타이드 또는 단백질 ELP 융합의 정화 과정을 설명하고 특성화를위한 기본 기술에 대해 설명합니다ELP 제품의 열 반응.
Protocol
1. ELP 식
- DMSO의 주식 또는 E.의 한천 평판 식민지로 멸균 좋아요 국물 미디어의 3 ㎖를 접종 T7-lac 프로모터의 제어에서 원하는 ELP-인코딩 플라스미드를 포함 단백질 발현에 적합한 대장균. 적절한 항생제를 추가하고 연속 200 rpm에서 진탕 37 ° C 하룻밤 (O / N)에서 배양한다.
- 4-L 플라스크에 좋아요 국물 멸균 매체의 1 L에 O / N 문화의 1 ML을 추가합니다. 적절한 항생제를 추가하고 연속 200 rpm에서 진탕 24 시간 동안 37 ° C에서 알을 품다. 참고 : 문화는 24 시간 동안 배양하면 T7-lac 프로모터와 함께 볼 "새는"기준의 표현이 많은 ELPs 높은 수준의 발현에 충분하다. 문화의 광학 밀도가 0.6에 도달 할 때 단백질 발현이 더욱 0.2-1 mM의 이소 프로필-β-D-티오 갈 락토 시드 (IPTG)를 첨가하여 유도되는 것을 특징으로하지만, 더 많은 종래의 방법이 사용될 수있다. 2,000 X g에서 15 분 동안 4 ° C에서 1-L 원심 분리기 병 및 원심 분리기 4-L 플라스크에서 문화를 전송합니다.
- 상층 액을 버린다. 주 : 문화의 이상 1 L가 성장하는 경우가 펠릿에 문화의 또 다른 리터를 추가하고 1.3 단계를 반복하여 응축 될 수있다. 문화의 최대 2 L은 하나의 세포 펠렛에 응축 될 수있다.
- 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 세포 현탁액 및 전송의 45 ㎖에 도달하는 인산염 완충 식염수 (PBS), 물, 또는 기타 원하는 버퍼에 펠렛을 재현 탁.
2 ELP 정화 :. 준비 단계 및 역 전환 사이클의 첫 번째 라운드
- 얼음에 샘플을 유지하면서, 10 '의'초와 85 W의 출력 전력에서 20 초 '오프'의 사이클 9 분 총 재현 탁 세포 펠렛을 초음파 처리. 간단히 샘플이 얼음에 냉각 한 후 한 번 더 9 분주기를 반복 할 수 있습니다. 참고 : ELP는 매우 낮은 T의 T가 예상되는 경우 t 상기 용액의 가열을 방지하기 위해 40 초까지 증가 될 수있다.
- 바닥 원심 관의 둘레에 50 ㎖에 용해 액을 전송합니다.
- 문화의 각 리터에 대해 10 %의 2 ㎖ (w / v)의 폴리에틸렌 이민 (PEI)를 추가하고 혼합 흔들어. NOTE : PEI는 음전하 유전 오염 물질의 응축을 보조 양전하 중합체이다. PEI는 또한 응축 ELP 제품을 제거 할 수 있습니다으로 ELP가 부정적으로 위탁되는 경우이 단계를 수행하지 마십시오.
- 16,000 X g에서 10 분 동안 4 ° C에서 원심 분리기.
- 바닥 원심 관의 둘레에 깨끗한 50 ㎖에 뜨는을 전송하고 펠렛을 폐기합니다.
- 선택 단계」을 구워 "단백질 오염 물질을 변성하고 ELP가 완전히 재용 될 때까지 4 ° C 또는 얼음에 전송하는 10 분 동안 60 ° C에서 샘플을 품어. 원심 분리기 16,000 X g에서 10 분 동안 4 ° C에서 샘플. CL에 뜨는을 전송라운드 EAN 50 ㎖ 바닥 원심 분리 관 및 펠렛을 폐기합니다. 참고 : 펩타이드 또는 단백질이 ELP에 융합되고, 높은 열 상태에서 변성 것으로 예상되는 경우이 단계를 수행하지 마십시오. 이 ELP의 전환이 열 돌이킬가하거나 융합 부분의 활동을 파괴 할 수 있습니다 발생할 수 있습니다.
- 결정의 NaCl의 추가 (안 3 M 초과)와 ELP의 전환을 유도한다. 대안 적으로, (하지 0.3 M 이하) 시트르산 나트륨은 높은 T t s 또는 낮은 수율을 ELPs 위해 사용될 수있다. 주 : 염이 용해되면, 용액을 용액으로부터 ELP의 상분리를 나타내는 백탁한다. 높은 T를 t s 인 아주 친수성 ELPs는 ELP 전이의이 예비 감응 소재 ELP의 상 분리를 유도하기 위해, 식염의 첨가와 함께, 어느 정도의 가열을 필요로 할 수있다.
- 16,000 XG (뜨거운 스핀)에서 10 분 동안 실내 temperatue (RT)에서 원심 분리기. 참고 : ELP 펠릿 ㄱ한다E 크기가 ELP의 발현 수율에 따라, 관찰했다. 이 ELP 펠릿이 처음 불투명 나타날 수 있지만 냉각 후 반투명 나타나고 색상이 갈색이 될 수 있습니다. 정화의 진행 및 오염 물질 제거로 ELP 펠릿은 더 무색이 될 것입니다.
- 뜨는을 취소하고 펠렛에 원하는 버퍼의 1 ~ 5 ML을 추가합니다. 피펫으로 펠렛을 재현 탁 또는 4 ℃에서 회전 튜브를 설정 NOTE : 버퍼의 필요한 부피 ELP 펠릿의 크기에 의존 한 것이다, 따라서 버퍼의 충분한 양 ELP 펠릿 resolubilization 있도록 추가되어야 ELP 발현의 수율. 것은 오염 단백질과 이황화 상호 작용을 제거하는 pH가 7에서 10 mM 트리스 (2 - 카르복시 에틸) 포스 하이드로 클로라이드 (TCEP 염산) 물에 정제에서 높은 시스테인 함량 혜택을 ELPs. 조정 된 pH에서 정화의 높은 충전 콘텐츠 혜택을 ELPs는 전하를 중화하고 ELE을 줄이기 위해오염 단백질과 상호 작용 ctrostatic.
- 깨끗한 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 1 ㎖ 분량 씩의 재 부유 ELP 솔루션을 전송합니다.
- 16,000 XG (차가운 스핀)에서 10 분 동안 4 ° C에서 원심 분리기. 불용성 오염 물질의 작은 펠릿을 준수해야합니다.
- 깨끗한 튜브에 뜨는을 전송하고 펠렛을 폐기합니다.
. 3 ELP 정화 : 역 전환 사이클의 후속 라운드
- 열 및 / 또는 염화나트륨의 첨가 ELP 전환을 유도한다. 시료 T의 t 이상의 온도에서 15 분 동안 가열 블록이나 수욕 배양 될 수있다. 그러나, ELP는 (열을 사용하는 방법을 배제) 단백질에 융합되거나 ELP 단독 열에 도달 할 수없는 높은 T를 t, 염화나트륨의 5 M 용액이있는 경우 유도하도록 적가를 추가 할 수 있다면 ELP 전환. NOTE : 용액은 용액으로부터 ELP의 상분리를 나타내는 백탁한다.
- , 상층 액을 버린다 원하는 버퍼의 500 ~ 750 μl를 추가하고 피펫으로 펠렛을 재현 탁 또는 4 ℃에서 회전 튜브를 설정
- 16,000 XG (차가운 스핀)에서 10 분 동안 4 ° C에서 원심 분리기. 불용성 오염 물질의 작은 펠릿을 준수해야합니다.
- 깨끗한 튜브에 뜨는을 전송하고 펠렛을 폐기합니다.
- 어떤 오염 물질 펠렛 단계 3.4 동안 관찰되지 않을 때까지 반복 3.5 3.1 단계를 반복합니다.
4. 후 정화 처리 (옵션)
- 원하는 경우, 정제 된 ELP 용액으로부터 과량의 염을 제거하기 위해 적당한 완충액에 대해 샘플을 dialyze. 참고 : 동결 건조 할 ELPs이 있어야한다4 ℃에서 DDH 2 OO / N 투석
- 원하는 경우, 종래 O / N.를 동결 건조에 30 분 동안 -80 ° C에서 상기 용액을 동결하여 장기 저장을 위해 냉동 건조를 ELP 참고 : 동결 건조가 추가 된 단백질과 ELPs에 사용할 수 없습니다.
- 원하는 경우, ELP 태그를 제거함으로써 펩타이드 또는 단백질 ELP 융합체로부터 자유 펩티드 또는 단백질을 회수 :
- (단백질 분해 효소 공급 업체에서 권장하는대로) 비오틴 분해 효소 또는 유전자 펩타이드 또는 단백질과 ELP 년 사이에 단백질 분해 효소 사이트에 해당하는 단백질 분해 효소 ELP의 융합 펩타이드 또는 단백질 ELP 융합 다이제스트.
- 해당되는 경우, (단백질 분해 효소 공급 업체에서 권장하는대로) 스트렙 타비 딘 - 수정 구슬을 사용하여 비오틴 분해 효소를 제거합니다.
- 5 M NaCl 용액의 적가에 의해 첨가 분해 ELP 및 / 또는 프로테아제 ELP 융합체의 전환을 유도한다.
- 16,000 X g에서 10 분 동안 실온에서 원심 분리기. 참고 : ELP 펠릿 관찰되어야한다.
- 상층 액을 수집하고 ELP 펠렛을 폐기합니다. 원하는 버퍼에 대해 상청액을 Dialyze 또는 순수한 펩타이드 또는 단백질 용액으로부터 높은 염 농도를 제거하기 위하여 버퍼 교환을 수행하는 원심 필터를 사용한다.
- 도데 실 황산나트륨 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE)에 의하여 ELP 태그없는 펩타이드 또는 단백질의 완전한 절단을 확인한다.
5 특성 :. SDS-PAGE
- 2 - 머 캅토 에탄올을 포함하는 샘플 버퍼 10 μL 물에 희석 ELP의 10 μl를 혼합하여 SDS-PAGE에 ELP 샘플을 준비합니다. NOTE : ELP 40 μg 종종 ELP 상품의 크기 및 순도를 평가하기에 충분하다.
- 2 분 동안 100 ° C에서 샘플을 품어하고 적절한 크기의 단백질 사다리와 함께 폴리 아크릴 아마이드 겔에로드합니다.
- 염료 겔 (약 45 분)의 하단에 근접 할 때까지 180 V에서 젤을 실행.
- 얼룩록킹 동안, 5 분 동안 0.5 M의 CuCl 2 수용액으로 겔화. 주 : 일부 ELP 서열이 염료와 상호 작용하지 않는 ELPs는 일반적으로 쿠마시 브릴리언트 블루 염색에 의해 가시화되지 않습니다. 쿠 매시 브릴리언트 블루 아르기닌 잔류와 주로 상호 작용 및 기타 기본 잔류-히스티딘과 라이신 및 방향족 잔류 트립토판, 티로신, 페닐알라닌 (26)과 약하게 상호 작용한다. 따라서 ELPs 펩타이드 또는 단백질 ELP 융합은 기본 시퀀스는 이러한 특정 잔류 충분한 수의 포함 된 경우에만 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색 할 수 있습니다.
- ELP 밴드의 MW가 ELP 유전자에서 더 외부 오염 물질의 밴드가 존재하지 않음이 예상되는 이론적 MW의에 해당하는지 확인합니다. 참고 : 일부 ELPs는 예상 MW 9, 27보다 최대 20 % 높은 겉보기 MW로 마이그레이션 할 수 있습니다.
6 특성 :. 매트릭스 보조 레이저 탈착 /이온화 비행 시간 질량 분석기 (MALDI-TOF-MS)
- 약 25 μM의 ELP 농도를 달성하기 위하여 0.1 % 트리 플루오로 아세트산을 함유하는 50 % 아세토 니트릴에 ELP 용액을 준비한다. 참고 : ELP 정화 다음 H 2 O 투석해야합니다 있도록이 솔루션은, 소금이 없어야합니다.
- 0.1 % 트리 플루오로 아세트산을 함유하는 50 % 아세토 니트릴 포화 sinapinic 산의 매트릭스 용액을 준비한다.
- 약 2.5 pmol의 / μL의 ELP 농도를 달성하기 위해 매트릭스 솔루션의 10 μL에 ELP 용액 1 μl를 추가합니다. NOTE :이 혼합물을 상기 MALDI-TOF의 신호를 최적화하기 위해 매트릭스 용액으로 희석 될 수있다.
- 예금 1-2 금속 MALDI 판에 ELP 매트릭스 혼합물의 μL와 그 자리가 완전히 건조 보자.
- ELP의 비 (m / z)를 충전하고 그 측정 MW를 유추 질량을 결정하는 MALDI-TOF와 5-10 스펙트럼을 얻습니다.
7. CharacterizatioN : 온도 프로그램 탁도 및 동적 광산란
- 온도 프로그램 혼탁에 의한 ELP의 T (T)를 결정합니다 :
- 원하는 버퍼에 ELP 솔루션 (5-100 μM에서 예) 희석 시리즈를 준비합니다.
- 온도 제어 UV-VIS 분광 광도계를 사용하여, 1 ° C / 분의 승온 속도로 온도 (예 : 20 ~ 80 ℃)의 범위에서 350 nm에서 광학 밀도 (OD)를 측정한다. NOTE : OD의 증가가 보이지 않는 경우 T의 t는 악기의 온도 상한을 초과 할 수도있다. 명백한 T의 t는 염화나트륨의 첨가에 의해 감소 될 수있다. 1 M의 NaCl에서 시작하고 ELP 전환이 측정 온도 범위 내에서 검출 될 때까지 0.5 M의 단계로 증가한다.
- 1 ° C / 분의 냉각 속도로 온도를 동일한 범위에서 OD의 감소를 측정함으로써 전이 ELP의 가역성을 확인한다.
- 호모의 T (T)를 결정중합체 ELP는 탁도 프로파일의 변곡점을 식별하여 (OD 온도 대 플롯). NOTE :이 온도를 쉽게 유도체의 최대에 대응하는 온도 T를 t로 정의된다 OD 곡선의 유도체로부터 정의 될 수있다. 더 복잡한 ELP 아키텍처는 더 복잡 탁도 프로파일을 표시하고 7.2 절에 설명 된대로 더 분석해야한다.
- 더 복잡한 열적 특성 (구형 미셀에 자기 조립 예를 들어, ELP의 디 블록 공중 합체)를 표시 ELPs의 추가 특성은 동적 광산란 (DLS)에 의해 달성된다 :
- 원하는 버퍼에 ELP 솔루션을 준비하고 20-450 nm의 기공 크기의 필터를 통해 샘플을 전달합니다. 주 : 필터의 기공 크기의 선택은 용액 중 어느 ELP 어셈블리의 존재, 크기 및 안정성에 의존 할 것이다. 가장 작은 가능한 필터의 기공 크기는 다음과 같은 오염 물질을 제거하는 것이 바람직하다DLS 측정의 품질을 감소 먼지. 작은 필터 공경 통해 ELP 용액을 통과 할 때 상당한 저항이 발생하면 큰 필터 기공의 크기가 사용되어야한다.
- 탁도의 프로파일에서 식별 된 관심 영역에 해당하는 온도 범위에 걸쳐 유체 역학적 반경 (R H)를 측정한다. 참고 : ELP의 unimers는 일반적으로 R H <10 nm의 나노 입자 어셈블리 R의 H ~ 20 ~ 100 nm의, 그리고 집계 R H가> 500 nm의가있다. R H의 각각의 증가는 입자의 크기에 비례하는 온도의 함수로서 UV-VIS 분광 광도법에 의해 측정 된 350 nm에서의 OD의 증가에 대응한다.
Representative Results
여기에서 우리는 ELP 단독 중합체 및 ELP의 디 블록 공중 합체의 정제 및 특성에 대한 대표적인 결과를 설명합니다. E.에서 표현의 24 시간을 따라 콜라이, 균체를 원심 분리에 의해 수집하고, 초음파 처리에 의해 용해된다. 일반적으로, 색상의 미묘한 변화는 충분한 세포 용해 (그림 1A)를 확인하고, 초음파 처리 한 후 발생합니다. PEI의 첨가 후, 게놈 성분 및 세포 파편을 상등액에 용해 ELP (도 1b)에서의 불용성 불순물 큰 펠렛을 분리, 원심 분리에 의해 수집된다. ELP는 더 가용성과 불용성 두 오염 물질 (그림 2) (28)로부터 ELP를 분리하는 LCST 동작을 활용 역 전환 순환 (ITC)에 의해 정제된다. ELP의 상전이는 열 및 / 또는 염의 첨가에 의해 트리거된다. ELP의 구성되어 튜브의 아래쪽 펠릿 형성 원심 결과차 일부 불용성 오염 물질 (그림 1C). ELP 펠렛 유지하고 차가운 완충액 동안이 뜨는에 뜨거운 스핀 폐기 수용성 오염을 단계는 -라고. 재용 ELP는 4 ℃에서 다시 원심 분리 수용성 ELP가 포함 된 상층 액이 유지되는 동안이 감기 스핀 폐기 불용성 오염 물질의 펠릿 단계는 -라고. 따뜻한 스핀 교류의주기를 반복하는 ELP의 순도를 증가하지만 잔류 ELP는 원심 분리기 튜브 및 피펫 팁의 각 ITC 라운드 도중 분실되는 등 약간, 수율 감소의 비용.
ELPs 펩타이드 또는 단백질 ELP 융합의 성공적인 정제 SDS-PAGE에 의해 확인된다. 정제 과정에서 찍은 작은 분취는 E.에서 ELP의 진보적 인 정제을 보여 대장균 해물. ELP는 조질 E.에서 과발현 대장균 해물과 오염 물질은 기지를 감소ITC (그림 3)의 H 연속 라운드. 정제 된 ELP는 예측 이론 MW 근처에 하나의 밴드로 나타납니다.
ELP T (T)는 온도 프로그램 혼탁이 특징입니다. ELP 단독 중합체의 탁도 프로파일 (약 2.0 단위 25 μM의 ELP 농도에 대한 기준 이상) 350 nm에서 OD에서 하나의 급격한 증가 (그림 4A)를 나타낸다. OD가 온도 T의 t (도 4b) 이하로 하강 할 때베이스 라인으로 복귀로 냉각 탁도 스캔 ELP 천이의 리버시블 활동을 확인한다. ELPs을 단독 중합체에 비교하여 ELP 디 블록 공중 합체는,보다 복잡한 탁도 프로파일을 나타낸다. OD는 일반적으로 첫 번째 기준보다 0.1 ~ 0.5 단위로 증가하는 후 기준 이상 2.0 단위로 급격히 OD 증가 (그림 5A). DLS 측정 온도, CO에 대하여 R H의 변화에 대한 정보를 제공한다 정보를 rroborating하면 탁도 프로파일 (그림 5B)에서 얻었다.
그림 1. 예비 ELP 정화. 표현, E.의 24 시간 후 대장균 세포를 원심 분리에 의해 수집하고 PBS에 재현 탁된다. A) 세포를 용해 액이 DNA의 오염 물질을 응축하기 PEI 첨가 한 후 초음파. B) 후 어두워 지도록, 파쇄물은 색 미묘한 변화에 의해 수반되는 초음파에 의해 용균 원심 분리 및 불용 찌꺼기 큰 펠릿 ELP 전이는 열 및 / 또는 염 및 원심 형태 반투명 ELP 펠릿의 첨가로 유도된다 상청액. C)에 용해 ELP로부터 분리된다.ANK는 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 역 전환 사이클링. ELP는 수용성과 불용성 두 오염 물질의 LCST 동작에 의해 정제한다. (1) ELP의 전환이 열 및 / 또는 소금과 ELP의 추가와 함께 유도 ELP 풍부한 해물을 시작으로 원심 분리 (뜨거운 회전)로 구분됩니다 (2). 수용성 오염 물질을 함유하는 상등액을 폐기하면서 ELP 펠렛 (3A) 보유된다 (도 3b). ELP는 차가운 버퍼 (4)에 재현 탁하고 4 ° C (감기 스핀)에서 다시 원심 분리 (5). 수용성 ELP 함유 상등액이 유지되는 동안 불용성 오염물을 함유 펠렛 (6A) 폐기된다 (도 6B). 로 결정 원하는 순도가 도달 할 때까지 따뜻한 스핀 교대주기는 반복된다SDS-PAGE. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
ELP 정화 제품도 3. SDS-PAGE 분석. ELP의 성공적인 정제는 SDS-PAGE에 의해 확인된다. 과발현 ELP는 조질 E.에 명백 초음파 후 대장균 해물 (2). 일부 ELP 불용성 오염물 폐기 펠릿 손실 되더라도 PEI 첨가하고 원심 분리 한 후 수용성 ELP는 크게, 상청 (3)에 유지된다 (4). 첫 번째 뜨거운 스핀 다음 상층 액 수용성 오염의 중요한 레벨을 포함하고 있습니다 (5). 첫 번째 감기 스핀 다음 상층 액을 불용성 오염 물질 ELP의 좋은 분리를 나타냅니다 (6). 뜨거운 (7)와 (c)의 추가주기이전 최종 핫 (9) 차가운 스핀 (10) 상층 액이 더 외부 오염 물질의 밴드를 전시하지 않을 때까지 (8) ELP 제품의 만족 순도를 확인, 각각 잔류, 수용성 오염 물질을 제거 회전합니다. SKGPG - (VGVPG)의 순서로이 ELP 호모 폴리머, 80-Y는 33.37 kDa의의 예상 분자량을 갖는다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 온도 프로그램 혼탁으로 ELP의 호모 폴리머의 특성. ELP T (T)는 1 ° C / 분.) ELP 단독 중합체 전시의 속도에 하나의 급격한 증가에 온도가 증가하면서 350 nm에서 OD를 모니터링에 의해 결정된다 OD 그 데프네스 주어진 농도. B에서 자신의 T의 t)는 ELP 전환의 가역성은 가역성을 기준으로 OD의 반환에 의해 확인 온도를 감소하면서 25 μ M 용액의 350 nm에서 OD를 모니터링하여 확인됩니다. 이 ELP 단독 중합체 시퀀스 SKGPG - (VGVPG) 80-Y있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
온도 프로그램 된 탁도와 동적 광산란에 의한 ELP 디 블록 공중 합체도 5. 특성화. 구면 미셀로 자기 조립 ELP 디 블록 공중 합체, 전시 복잡한 탁도 정보로서 나노 스케일 자기 조립을 겪는다 ELPs.
Discussion
ELPs은 자극 - 반응 단계 행동의 착취에 의한 정화의 저렴하고 크로마토 그래피 - 무료 수단을 제공합니다. 이 접근법은 E.있는 유전자에 의해 코딩 ELPs 발현 후 양, 수용성 오염 물질을 제거하기 위해 ELPs 펩타이드 또는 단백질 ELP 융합체의 LCST 거동 활용 대장균. 정화이 용이성 다양한 용도 ELPs을 생산하는 데 사용될 수 있거나, ELP 사후 정화 처리로 제거 될 수있다 정제 태그로서 동작 할 수있는 재조합 펩타이드 또는 단백질의 정제를 위해 이용 될 수있다.
ELP 정화는 E.을 용해하는 예비 단계를 포함 대장균과 ITC에 의해 잔류, 수용성 오염 물질의 제거 (그림 2) 다음에 조 문화 해물 (그림 1)에서 게놈과 불용성 세포 파편을 제거합니다. 원심 분리 ADDI하여 ELP 전환을 트리거 후열이나 소금의 기이 단계는 뜨거운 스핀이라고에서, 상층 액에 용해 오염 물질 ELP를 분리합니다. ELP를 resolubilizing 후, 용액, 불용성 펠렛 오염물을 제거하기 위해 T를 t 이하의 온도에서 다시 원심 분리 단계에서 냉 스핀을 칭했다. 따뜻한 스핀을 교류하는 것은 양보 할 수있는 작은 비용으로, 각주기 ELP 솔루션의 순도를 향상시킵니다. 정화 금리는 ELP T 티셔츠, 길이 및 융합 펩타이드 또는 단백질에 따라 다릅니다. 일반적으로이 프로토콜은 E. 리터당 정제 ELP 100 밀리그램을 산출 대장균 문화는, 그러나 수율은 500 ㎎ / L.까지 도달 할 수있다 ELP 제품의 최종 순도 SDS-PAGE (그림 3)에 의해 확인된다. 정제 된 ELP의 MW는 ELP 유전자에 의해 코딩 이론 MW와 밀접하게 일치해야합니다. 그러나 일부 ELPs는 예상 MW 9, 27보다 최대 20 % 높은 겉보기 MW와 SDS-PAGE로 이동한다. ELP의 더 정확한 분석MW는 또한 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC)와 같은 직교 분석 기법과 함께 ELP 제품의 순도에 대한 추가적인 정보를 제공 할 수있는 MALDI-TOF-MS에 의해 달성 될 수있다.
정제 후, ELP T의 t는 온도 프로그램 된 탁도에 의해 측정된다. 온도가 증가하면서이 기술 ELP 용액의 OD를 모니터링한다. 는 ELP의 의도 된 응용 프로그램과 관련된 농도 시리즈의 특성을하는 것이 좋습니다 있도록 T의 T 농도 의존적이다. ELP는 탁도 프로필 unimer 미크론 크기의 집계에서 ELP의 전환에 대응하는 하나의 급격한 증가 (그림 4A)를 나타내는 단일 중합체를 들어. T의 t 정확하게 온도에 대한 OD의 제 유도체의 최대로서 결정 탁도 프로파일의 변곡점에 대응하는 온도로서 정의된다. 의 가역성ELP 위상 천이 온도 T를 t (도 4b) 이하로 하강 할 기준 OD의 감소에 의해 확인된다. 온도 경사를 증가 및 감소와 탁도의 프로필로 인해 ELP의 코아세르베이트 및 ELP의 resolubilization의 변수 이력의 정착에 크기와 반응 속도에 차이가 있습니다. 펩타이드 또는 단백질 ELP 융합 유사 ELP 융합 펩타이드 또는 단백질이 T의 T에 영향을 미치는이 방법에 LCST 동작을 나타냅니다. 단백질 ELP는 전이 단백질의 용융 온도 아래 리버시블 융합체이다. 온도 프로그램 된 탁도는 시차 주사 열량계 (DSC)와 같은 ELP 제품, 대체 기술의 초기 열 특성화 우수한 방법이지만, 또한 ELP T의 t를 측정하는데 사용될 수있다.
또한 온도 PROGRA 특징으로 할 수있는 더 복잡한 구조의 전시보다 복잡한 열 행동과 ELPsmmed 혼탁. ELP 디 블록 공중 합체는, 예를 들어, 자신의 임계 미셀 온도에서 구면 미셀로 그들의 온도 트리거 자기 조립에 대응하는 특징적인 탁도 프로파일을 나타낸다. 이러한 ELP의 디 블록 공중 합체의 경우 OD는 일반적으로 먼저 높은 온도에서 OD의 급격한 증가 (최대 2.0 단위 기준 이상) 마이크론 스케일의 형성을 나타냅니다 후 미셀에 unimers의 전환을 나타내는 기준선 위의 0.1 ~ 0.5 단위 증가 집계 (그림 5A). 온도 트리거 자기 조립 ELP 구조에 대한 추가 정보는 DLS 솔루션에 ELP 어셈블리의 R의 H를 측정하는 기술로 얻을 수있다. R H의 변화는 탁도 (그림 5B)로 측정 OD의 변화와 밀접하게 동의합니다. 나노 입자 어셈블리 R H에게 전시 R의 H ~ 20 ~ 100 nm의 집계를 전시하면서 ELP의 unimers는 일반적으로 R H <10 nm의 전시 현미경으로 17, 23, 29에 의해 얻어 질 수있다.
ELP 인해 열적 특성 조정 기능을, T를 t (S)의 범위는 다양 ELP 설계에 의해 얻어진다. 그것은 고유의 T (T)가 매우 낮거나 높은 T의 T (S)가이 표준 프로토콜에 가장 수정이 필요합니다 각 ELP에 대한 정화 프로토콜의 최적화에 영향을 미친다는 점을 명심해야합니다. 매우 높은 전이 온도를 가진 ELPs는이 방법 정화에 적합하지 않은 경우가 있습니다. 신규 ELPs 펩타이드 또는 단백질 ELP 융합체의 디자인 ELP의 열 반응을 손상시킬 수있는 경우, 간단한 히스티딘 태그가 고정화 금속 친 화성 크로마토 그래피에 의한 정제를 위해 대체 포함될 수있다. 또한,게스트 잔류가 부과되는 경우 ELP 시퀀스의 특성은이 프로토콜의 수정을 필요로 할 수있다. 버퍼의 pH 조작은 오염 물질 (17)의 정전 상호 작용을 제거하기위한 노력으로 ELP의 전체 전하를 변경하는 방법으로서 사용될 수있다. 또한,이 프로토콜은 펩티드 및 적절한 조치가 정제 공정이 융합 잔기 활동을 교란되지 않는 보장 찍힌다 단백질과 ELP 융합체 중 특별한 상황에 적합하다. 이러한 변형의 프로토콜에 걸쳐 참고 T의 T, 책임, 또는 융합 문제와 관련하여 이러한 과제를 제시 할 수있다 ELPs의 정화를 지시하는 역할을한다.
그들의 LCST 거동 의해 ELPs의 정제 E. 표현 ELPs 대다수 펩타이드 또는 단백질 ELP 융합체를 정화하는 간단한 크로마토없는 접근법을 제시 대장균. 여기에 요약이 프로토콜은 정화 (을)를 허용F 가장 생물학 실험실에 공통 장비를 사용하여 하루에 ELPs. ELPs과 그 융합의 정제의 용이성, 우리는 희망, 재료 과학, 생명 공학, 의학의 새로운 애플리케이션을위한 ELP 디자인의 계속 성장하는 다양성을 격려 할 것이다.
Disclosures
저자는 공개 할 경쟁 금전적 이해 관계가 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NSF의 리서치 트라이앵글 MRSEC (DMR-1121107)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pET-24a(+) pET-25b(+) |
Novagen | 69749-3 69753-3 |
T7-lac expression vectors with resistance to kanamycin (pET-24) or ampicillin (pET-25). |
| Ultra BL21 (DE3) competent cells | Edge BioSystems | 45363 | Competent E. coli for recombinant protein expression. |
| Terrific Broth (TB) Dry Powder Growth Media | MO BIO Laboratories | 12105 | Media is reconstituted in DI H2O and autoclaved before use. |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactoside (IPTG) | Gold Biotechnology | I2481C | IPTG is reconstituted in DI H2O, sterile filtered, and added to cultures to induce enhanced expression. |
| Phosphate buffered saline (PBS) tablet | Calbiochem | 524650 | These PBS tablets, when dissolved in 1 L of DI H2O, yield a 10 mM phosphate buffer with 140 mM NaCl, and 3 mM KCl with a pH of 7.4 at 25 °C. |
| Polyethyleneimine (PEI) Solution (~50% w/v) | MP Biomedicals | 195444 | PEI is prepared as a 10% (w/v) solution in deionized H2O. |
| Nalgene Oak Ridge high-speed centrifuge tubes, 50 ml | Thermo Scientific | 3138-0050 | These round-bottom tubes withstand high-speed centrifugation of 30-50 ml. |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP-HCl) | Thermo Scientific | 20491 | A stock solution of TCEP-HCl is prepared at 100 mM in DI H2O and adjusted to pH 7.0. For ELPs with a high cysteine content the stock solution of this reducing agent is added to the ELP pellet to reach 10 mM in H2O. |
| Ready Gel Tris-HCl gel, 4-20% linear gradient polyacrylamide gel, 10 well, 30 μl | Bio-Rad Laboratories | 161-1105 | These linear gradient gels offer good visualization of ELPs with a range of MWs. |
| Cupric chloride dihydrate (CuCl2·2H2O) | Fisher Scientific | C454-500 | A filtered 0.5 M solution is prepared for negative staining of Tris-HCl polyacrylamide gels. |
| Anotop 10 syringe filter: 0.02 μm 0.1 μm 0.2 μm |
Whatman | 6809-1002 6809-1012 6809-1022 |
These 10-mm diameter syringe filters allow preparation of small volumes for DLS measurements. |
| Millex-HV filter: 0.45 μm |
EMD Millipore | SLHVX13NK | These 13-mm diameter syringe filters allow preparation of small volumes of solutions with large nanoparticle assemblies for DLS measurements. |
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