Summary
Elastin-lignende polypeptider er stimulus-responderende biopolymerer med ansøgninger fra rekombinant protein oprensning til drug delivery. Denne protokol beskriver oprensning og karakterisering af elastin-lignende polypeptider og deres peptid eller protein fusioner fra Escherichia coli ved hjælp af deres lavere kritiske løsning temperatur faseovergang adfærd som et simpelt alternativ til kromatografi.
Abstract
Elastin-lignende polypeptider er gentagne biopolymerer, der udviser en lavere kritisk opløsningstemperatur faseovergang adfærd, eksisterende som opløselige unimers under en karakteristisk overgangstemperatur og aggregering i mikron-skala koacervater over deres overgangstemperatur. Udformningen af elastin-lignende polypeptider på det genetiske niveau tillader præcis styring af deres sekvens og længde, som dikterer deres termiske egenskaber. Elastin-lignende polypeptider anvendes i en lang række applikationer, herunder biosensorer, tissue engineering, og drug delivery, hvor overgangen temperaturen og biopolymer arkitektur ELP kan indstilles til den konkrete anvendelse af interesse. Endvidere er den nedre kritiske opløsningstemperatur faseovergang adfærd elastin-lignende polypeptider tillader deres oprensning ved deres termiske reaktion, således at deres selektive coacervation og resolubilization tillader fjernelse af både opløselige og uopløselige kontaminants følgende udtryk i Escherichia coli. Denne fremgangsmåde kan anvendes til oprensning af elastin-lignende polypeptider alene eller som en rensning værktøj til peptid-eller protein-fusioner, hvor rekombinante peptider eller proteiner genetisk vedlagt elastin-lignende polypeptid-tags kan oprenses uden chromatografi. Denne protokol beskriver oprensning af elastin-lignende polypeptider og deres peptid-eller proteinfusioner og diskuterer grundlæggende karakterisering teknikker til at vurdere den termiske opførsel af rene elastin-lignende polypeptidprodukter.
Introduction
Elastin-lignende polypeptider (ELPS) er biopolymerer sammensat af den gentagne pentapeptid VPGXG hvor X, gæsten rester, er en hvilken som helst aminosyre bortset fra prolin. ELPS udviser lavere kritiske opløsningstemperatur (LCST) faseovergang adfærd, såsom at en homogen ELP løsning adskilles i to faser ved opvarmning til dets LCST, som almindeligvis kaldes den inverse glasomdannelsestemperatur (T t) i ELP litteratur 1. De to faser består af en meget fortyndet ELP klump fase og en ELP rig sediment fase. ELP rige sediment er dannet på en kort tidshorisont ved sammenlægning af ELP kæderne i micron mellemstore partikler, der efterfølgende flyder sammen. Dette sker over et område af nogle få grader Celsius og er typisk reversible, som en homogen opløsning genvindes ved at vende tilbage til en temperatur under T t.
ELPS syntetiseres typisk i Escherichia coli (E. coli) from et kunstigt gen, som er ligeret ind i et ekspressionsplasmid. Dette plasmid transformeres derefter ind i en E. coli-cellelinie, som er optimal for protein-ekspression. Vi har udelukkende anvendes T7-lac pET vektor-system til ekspression af et stort udvalg af ELPS i E. coli, selv om andre ekspressionssystemer i gær 2-4, svampe 5 og planter 6-8 også er blevet anvendt af andre forskere. En række metoder eksisterer for at genetisk konstruere gentagne ELP gener, herunder rekursive retningsbestemt ligatur (RDL) 9, rekursive retningsbestemt ligation af plasmid genopbygning (Pre-RDL) 10, og overlapper udvidelse rullende cirkel forstærkning (OERCA) 11.. Evnen til at konstruere ELPS på det genetiske niveau giver mulighed for at anvende rekombinante DNA-teknikker til at skabe ELPS med forskellige arkitekturer (f.eks monoblocks, diblokke, triblokke, etc.), som yderligere kan tilføjes med funktionellepeptider og proteiner. Kontrol på det genetiske niveau sikrer også, at hver ELP udtrykkes med den nøjagtige længde og sammensætning dikteret af dens genetiske plasmidtemplate, hvilket giver perfekt monodisperse biopolymer produkter.
De termiske egenskaber af hver ELP afhænge af parametre, der er karakteristiske for biopolymeren såsom dets molekylvægt (MW) og sekvensen, såvel som ydre faktorer, herunder dets koncentration i opløsning, og tilstedeværelsen af andre cosolutes, såsom salte. Længden af ELP 12 og gæst rest sammensætning 1, 13, 14 er to ortogonale parametre i design ELP, der kan anvendes til at styre T t, hvor hydrofobe gæst rester og længere kædelængder resultere i en lavere T t s, mens hydrofile gæst rester og kortere kædelængde resulterer i højere T t sek. ELP koncentrationen er omvendt relateret til T-t, hvor opløsninger af gr.eater ELP koncentration har lavere T t s 12. Typen og koncentrationen af salte indflydelse også ELP T t, hvor effekten af salte følger Hofmeisterserien 15. Kosmotropic anioner (CL - og højere på Hofmeister serien) sænke ELP T t og stigende saltkoncentration forstærker denne effekt. Disse interne og eksterne parametre kan indstilles for at opnå termisk adfærd inden for et mål temperaturområde, der kræves til en bestemt anvendelse af en ELP.
Stimulus-reagerende adfærd ELPS er nyttigt for en bred vifte af applikationer, herunder biosensorer 16, 17, tissue engineering 18, og drug delivery 19, 20. Derudover, når ELPS fusioneres til peptider eller proteiner på det genetiske niveau, kan ELP tjene som en simpel rensning tag for at tilvejebringe en billig batch fremgangsmåde til oprensning af rekombinant peptidevand eller proteiner, der ikke kræver kromatografi 21. Ændring af rensningsprocessen sikrer, at aktiviteten af peptidet eller proteinet fusioneret til ELP opretholdes. Peptid-eller protein ELP fusioner kan oprenses til anvendelser, hvor ELP tag er nyttigt 22, 23 eller alternativt, når det frie peptid eller protein er påkrævet, kan et proteasegenkendelsessted indsættes mellem peptidet eller proteinet og ELP. Fjernelse af ELP tag kan derefter opnås ved fordøjelse med gratis protease eller en protease ELP fusion, hvor sidstnævnte giver den ekstra nem behandling som en sidste runde af ELP oprensning kan adskille ELP-tag og protease ELP fusion fra målet peptid eller protein i et enkelt trin 24, 25. Følgende protokol beskriver proceduren for ELPS og peptid eller protein ELP fusioner rensning ved deres termiske egenskaber og diskuterer grundlæggende teknikker til karakteriseringden termiske reaktion ELP produkter.
Protocol
1.. ELP Expression
- Podes 3 ml sterile Terrific Broth medier med en DMSO bestand eller agarplade koloni af E. coli egnede til proteinekspression, der indeholder den ønskede ELP-kodende plasmid under kontrol af T7-lac-promotoren. Tilsæt passende antibiotika, og der inkuberes ved 37 ° C natten over (O / N) med kontinuert rystning ved 200 rpm.
- 1 ml O / N-kulturen til 1 liter Terrific Broth sterile medier i et 4-L kolbe. Tilsæt passende antibiotika, og der inkuberes ved 37 ° C i 24 timer med kontinuert rystning ved 200 rpm. BEMÆRK: "utæt" baseline ekspression ses med T7-lac-promotoren er tilstrækkelig til højniveau-ekspression af mange ELPS hvis kulturen inkuberes i 24 timer. Imidlertid kan en mere konventionel fremgangsmåde anvendes, hvor protein-ekspression er yderligere induceret ved tilsætning af 0,2-1 mM isopropyl-beta-D-thiogalactosid (IPTG), når den optiske densitet af kulturen når 0,6. Overfør kultur fra 4-kolbe til en 1-L centrifuge-flaske, og der centrifugeres ved 4 ° C i 15 minutter ved 2.000 x g.
- Supernatanten. BEMÆRK: Hvis der er mere end 1 liter kultur dyrkes de kan kondenseres ved at tilføje en anden liter kultur til pillen og gentage trin 1.3. Op til 2 L af kultur kan koges ned til en enkelt celle pellet.
- Pellet resuspenderes i phosphatbufret saltvand (PBS), vand eller anden ønsket puffer for at nå 45 ml cellesuspension og overføres til en 50 ml konisk rør.
2 ELP rensning. Indledende trin og første runde af Inverse Transition Cycling
- Sonikeres resuspenderet cellepellet for i alt 9 min i cyklusser af 10 sek 'on' og 20 sek 'off' ved en udgangseffekt på 85 W, og samtidig holde prøven på is. Kortvarigt tillader prøven køle på is og derefter gentage 9 min cyklus igen. BEMÆRK: Hvis ELP forventes at have en meget lav T t t.
- Overfør lysatet til en 50 ml rundbundet centrifugeglas.
- Tilsæt 2 ml 10% (w / v) polyethylenimin (PEI) for hver liter kultur og ryst for at blande. BEMÆRK: PEI er et positivt ladet polymer, der hjælper med kondensering af negativt ladede genetiske forureninger. Må ikke udføre dette trin, hvis ELP er negativt ladet, som PEI også kan kondensere og fjern ELP produkt.
- Der centrifugeres ved 4 ° C i 10 minutter ved 16.000 x g.
- Supernatanten overføres til en ren 50 ml rundbundet centrifugeglas og kassere bundfaldet.
- Valgfri "bage ud" step: Prøven inkuberes ved 60 ° C i 10 min for at denaturere proteinkontaminanter og derefter overføre til 4 ° C eller til is, indtil ELP er helt resolubiliseres. Centrifugeres prøven ved 4 ° C i 10 minutter ved 16.000 x g. Supernatanten overføres til et clEAN 50 ml rundbundet centrifugeglas og kassér bundfaldet. BEMÆRK: Du må ikke udføre dette trin, hvis et peptid eller protein er fusioneret til ELP og forventes at denaturere i den tilstand af forhøjet varme. Dette kan forårsage ELP overgangen til at blive varme-irreversibel eller kan ødelægge aktiviteten af den kondenserede del.
- Fremkald ELP overgang med tilføjelse af krystallinsk NaCl (ikke over 3 M). Alternativt kan natriumcitrat (højst 0,3 M) bruges til ELPS, der har højere T t s eller lave udbytter. BEMÆRK: Opløsningen skal blive uklar, når saltet er opløst, hvilket indikerer faseseparation af ELP fra opløsningen. Meget hydrofile ELPS med høj T t r kan kræve en vis grad af varme, i kombination med tilsætning af salt, til at inducere faseseparation af ELP i denne indledende induktion af ELP overgang.
- Centrifuger ved stuetemperatur temperatue (RT) i 10 minutter ved 16.000 xg (varm centrifugering). BEMÆRK: Et ELP pellet skal be observeret, hvis størrelse afhænger af udtryk udbyttet af ELP. Dette ELP pellet kan ved første synes uigennemsigtigt, men efter afkøling det vises gennemsigtigt og kan være brun i farven. ELP pellet vil blive mere farveløs som rensning provenuet og forurenende stoffer fjernes.
- Supernatanten fjernes, og tilføje 1-5 ml ønskede puffer til pelleten. Pelleten resuspenderes ved pipettering eller indstilling røret til at rotere ved 4 ° C. BEMÆRK: Den nødvendige mængde puffer vil afhænge af størrelsen af ELP pellet, og dermed udbyttet af ELP udtryk, hvor en tilstrækkelig mængde af puffer bør tilføjes for at muliggøre resolubilization af ELP pellet. ELPS med højt cystein gavn af oprensning i vand med 10 mM Tris (2-carboxyethyl) phosphin, hydrochlorid (TCEP-HCI) ved pH 7, for at fjerne disulfid-interaktioner med kontaminerende proteiner. ELPS med højt gebyr gavn af rensning ved en pH justeret til at neutralisere deres ladning og reducere electrostatic interaktioner med kontaminerende proteiner.
- Overfør resuspenderede ELP opløsning i portioner på 1 ml i rene 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Der centrifugeres ved 4 ° C i 10 minutter ved 16.000 xg (kold centrifugering). Bør der indlægges en lille pille af uopløselige stoffer.
- Supernatanten overføres til et rent rør og kassere bundfaldet.
. 3. ELP Oprensning: efterfølgende runder af Inverse Transition Cykling
- Inducere ELP overgang med varme og / eller tilsætning af NaCl. Prøverne kan inkuberes på en varmeblok eller i et vandbad i 15 minutter ved en temperatur over T t. Hvis imidlertid ELP fusioneret til et protein (hvilket udelukker brugen af varme), eller hvis ELP har en høj T t, der ikke kan nås med varme alene, en 5 M opløsning af NaCl kan tilsættes dråbevis til at inducere ELP overgang. BEMÆRK: Opløsningen skal slå uklar, med angivelse af fase adskillelse af ELP fra opløsningen.
- Supernatanten tilsættes 500-750 pi af den ønskede puffer, og pellet resuspenderes ved pipettering eller indstilling røret til at rotere ved 4 ° C.
- Der centrifugeres ved 4 ° C i 10 minutter ved 16.000 xg (kold centrifugering). Bør der indlægges en lille pille af uopløselige stoffer.
- Supernatanten overføres til et rent rør og kassere bundfaldet.
- Gentag trin 3.1 til 3.5, indtil der ikke forurenende pellet observeret under trin 3.4.
4.. Post-rensning Processing (valgfrit)
- Hvis det ønskes, dialyseres prøven mod en egnet puffer for at fjerne overskydende salt fra oprensede ELP løsning. BEMÆRK: ELPS skal lyofiliseres, bør væredialyseret mod ddH 2 OO / N ved 4 ° C.
- Hvis det ønskes, lyofilisere ELP til langtidsopbevaring ved nedfrysning af opløsningen ved -80 ° C i 30 minutter før lyofilisering O / N. BEMÆRK: Lyofilisering bør ikke anvendes til ELPS med vedføjede proteiner.
- Hvis det ønskes, gendanne frit peptid eller protein fra et peptid eller protein ELP fusion ved fjernelse ELP tag:
- Skær peptidet eller proteinet ELP fusion med biotinyleret protease (som anbefalet af leverandøren protease) eller med en protease ELP fusion svarende til protease stedet genetisk konstrueret mellem peptidet eller proteinet og ELP.
- Hvis det er relevant, fjernes den biotinylerede protease ved hjælp af streptavidin-modificerede perler (som anbefalet af protease leverandøren).
- Fremkald overgangen af det spaltede ELP og / eller protease ELP fusion ved dråbevis tilsætning af en 5 M NaCl-opløsning.
- Centrifugeres ved stuetemperatur i 10 minutter ved 16.000 x g. BEMÆRK: En ELP pille bør overholdes.
- Saml supernatanten og kassér ELP pellet. Dialyseres supernatanten mod en ønsket puffer eller bruge en centrifugalfilterenhed til at udføre en pufferudveksling for at fjerne den høje saltkoncentration fra det rene peptid eller protein løsning.
- Bekræfte fuldstændig spaltning af frit peptid eller protein fra ELP tag ved natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE).
5. Karakterisering. SDS-PAGE
- Forbered ELP prøver til SDS-PAGE ved at blande 10 pi af ELP fortyndes i vand med 10 ul prøvebuffer indeholdende 2-mercaptoethanol. BEMÆRK: 40 ug ELP er ofte tilstrækkeligt at vurdere størrelsen og renheden af ELP produkt.
- Prøven inkuberes ved 100 ° C i 2 minutter og derefter indlæse på en polyacrylamidgel sammen med en passende størrelse protein stigen.
- Kør gelen ved 180 V, indtil farvestoffet nærmer sig bunden af gelen (ca. 45 min.)
- Farvgel med en 0,5 M CuCl2 opløsning i 5 minutter, mens rocking. BEMÆRK: ELPS er typisk ikke visualiseret ved Coomassie Brilliant Blue farvning, som nogle ELP sekvenser ikke interagerer med dette farvestof. Coomassie Brilliant Blue interagerer primært med argininrester og interagerer svagt med andre grundlæggende rester-histidin og lysin-og aromatiske rester-tryptophan, tyrosin og phenylalanin 26. Således ELPS og peptid eller protein ELP fusioner kan farves med Coomassie Brilliant Blue, hvis deres primære sekvens omfatter et tilstrækkeligt antal af disse specifikke rester.
- Kontroller, at MW ELP bånd svarer til den teoretiske MW forventes ELP-genet, og at ingen uvedkommende forurenende bånd er til stede. BEMÆRK: Visse ELPS migrere med en tilsyneladende MW op til 20% højere end deres forventede MW 9, 27..
6. Karakterisering:. Matrix-assisteret laserdesorption /ionisering Time-of-Flight massespektrometri (MALDI-TOF-MS)
- Forbered en ELP opløsning i 50% vandig acetonitril indeholdende 0,1% trifluoreddikesyre for at opnå en ELP koncentration på cirka 25 uM. BEMÆRK: Denne løsning skal være fri for salt, så ELP skal dialyseres mod H 2 O efter rensning.
- Forbered en matrix opløsning af mættet sinapininsyre i 50% vandig acetonitril indeholdende 0,1% trifluoreddikesyre.
- Tilsættes 1 ul af ELP opløsning til 9 pi af matricen løsning til at opnå en ELP koncentration på cirka 2,5 pmol / ul. BEMÆRK: Denne blanding kan fortyndes yderligere med matrix-opløsning for at optimere MALDI-TOF-signal.
- Depositum 1-2 ul ELP-matrix blandingen på en metal MALDI plade og lad stedet tørre helt.
- Opnå 5-10 spektre med MALDI-TOF at bestemme massen til-ladningsforhold (m / z) ELP og aflede målte MW.
7.. Characterization: Temperatur-programmerede Turbidimetri og Dynamic lysspredning
- Bestem T t af ELP ved temperatur-programmerede turbidimetri:
- Forbered en fortyndingsrække (fx 5-100 uM) af ELP-løsninger i den ønskede buffer.
- Ved hjælp af en temperatur-kontrolleret UV-Vis spektrofotometer, måle den optiske densitet (OD) ved 350 nm over en række temperaturer (f.eks 20-80 ° C) ved en opvarmning på 1 ° C / min. BEMÆRK: Hvis ingen stigning i OD set T t kan overstige den øvre temperaturgrænse for instrumentet. Den tilsyneladende T t kan reduceres ved tilsætning af NaCl. Start ved 1 M NaCl og øge i trin på 0,5 M, indtil ELP overgangen detekteres indenfor en målbar temperaturområde.
- Kontroller reversibilitet ELP overgang ved at måle nedgangen i OD over det samme temperaturområde ved en afkølingshastighed på 1 ° C / min.
- Bestem T t homopolymer ELP ved at identificere inflektionspunkt turbiditet profil (OD afbildet mod temperatur). BEMÆRK: Denne temperatur kan let fastlægges ud fra den afledte af OD-kurven, hvor temperaturen svarer til den maksimale af derivatet er defineret som T t. Mere komplekse ELP arkitekturer vil vise mere komplicerede turbiditet profiler og bør analyseres yderligere som beskrevet i afsnit 7.2.
- Yderligere karakterisering af ELPS, der viser mere komplekse termiske egenskaber (f.eks ELP diblokcopolymerer at selv samle ind sfæriske miceller) opnås ved dynamisk lysspredning (DLS):
- Forbered en ELP løsning i den ønskede buffer og prøven gennem et filter med en 20-450 nm porestørrelse. BEMÆRK: Valget af filter porestørrelse vil afhænge af tilstedeværelse, størrelse og stabilitet af eventuelle ELP forsamlinger i opløsning. Den mindste gennemførlige porestørrelse foretrækkes at fjerne forurenende stoffer, såsomstøv, at forringe kvaliteten af DLS målinger. En større porestørrelse bør anvendes, når en betydelig modstand opleves, når de passerer en ELP løsning gennem mindre filter pore størrelser.
- Måle hydrodynamiske radius (R H) over et område af temperaturer, der svarer til et område af interesse identificeret i turbiditet profil. BEMÆRK: ELP unimers har typisk en R H <10 nm, nanopartikel forsamlinger har en R H ~ 20-100 nm, og aggregater har en R H> 500 nm. Hver stigning i F H bør svare til en stigning i OD ved 350 nm målt ved UV-Vis spektrofotometri som en funktion af temperaturen, som er proportional med størrelsen af partiklen.
Representative Results
Her beskriver vi repræsentative resultater for oprensning og karakterisering af en ELP homopolymer og en ELP diblokcopolymer. Efter 24 timers udtryk i E. coli cellerne opsamlet ved centrifugering og lyseret ved sonikering. Typisk en subtil ændring i farve forekommer efter lydbehandling bekræfter tilstrækkelig cellelyse (figur 1A). Efter tilsætningen af PEI, er genomiske komponenter og celleaffald ved centrifugering, der adskiller en stor pellet af uopløselige urenheder fra den opløselige ELP i supernatanten (figur 1B). ELP oprenses yderligere ved omvendt overgang cykling (ITC), som udnytter LCST adfærd at adskille ELP både opløselige og uopløselige stoffer (figur 2) 28. Faseovergangen af ELP udløses ved tilsætning af varme og / eller salt. Centrifugeringsbetingelserne resulterer i dannelsen af en pellet i bunden af røret, der består af ELP ennd nogle uopløselige urenheder (figur 1C). Dette trin-kaldt et varmt spin-udsmid opløselige forureninger i supernatanten, mens ELP pellet bevares og resuspenderes i kold buffer. Det resolubiliserede ELP centrifugeret igen ved 4 ° C. Dette trin-kaldt en kold spin-udsmid pillen af uopløselige urenheder mens supernatanten indeholdende opløselige ELP bevares. Gentagelse af cyklus af skiftevis varmt og koldt spin øger renheden af ELP, men på bekostning af svagt faldende udbytte som resterende ELP tabt under hver ITC runde centrifugerør og pipettespidser.
Succesfuld oprensning af ELPS og peptid-eller protein ELP fusioner bekræftes ved SDS-PAGE. Små portioner taget hele rensningsprocessen demonstrere gradvise rensning af ELP fra E. coli lysat. ELP overudtrykkes i rå E. coli lysat og forureninger falde with successive runder af ITC (figur 3). Renset ELP vises som et enkelt bånd nær den forudsagte teoretiske MW.
ELP T t er præget af temperatur-programmerede turbidimetri. Den uklarhed profil som et ELP homopolymer udviser en enkelt kraftig stigning i OD ved 350 nm (ca. 2,0 enheder over baseline efter en ELP koncentration på 25 uM) (figur 4A). Køling turbiditet scanninger bekræfter reversible natur af ELP overgang som OD vender tilbage til udgangspunktet, når temperaturen sænkes under T t (figur 4B). ELP diblokcopolymerer udviser en mere kompleks turbiditet profil sammenlignet med homopolymer ELPS. OD typisk først stiger til 0,1-0,5 enheder over baseline, hvorefter OD stiger kraftigt til 2,0 enheder over baseline (figur 5A). DLS målinger giver information om ændringen i F H med hensyn til temperatur, co rroborating de oplysninger fra de uklarhed profil (figur 5B).
Figur 1.. Indledende ELP rensning. Efter 24 timer af udtryk, E. coli-celler opsamlet ved centrifugering og resuspenderet i PBS. er A) Celler lyseres ved lydbehandling, som ledsages af en subtil ændring i farve, således at lysatet mørkere efter sonikering. B) Efter tilsætning af PEI at kondensere DNA kontaminanter lysatet er centrifugeret, og en stor pellet af uopløseligt affald separeres fra opløseligt ELP i supernatanten. C) ELP overgang induceres med tilsætning af varme og / eller salt og centri danner en gennemskinnelig ELP pellet.ank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Inverse overgang cykling. ELP oprenses ved hjælp af sin LCST opførsel fra både opløselige og uopløselige urenheder. Startende med ELP-rige lysat (1) ELP overgangen induceres med tilsætning af varme og / eller salt og ELP adskilles ved centrifugering (varm centrifugering) (2). ELP pellet bevares (3a), mens supernatanten, der indeholder opløselige forureninger kasseres (3b). ELP resuspenderes i kold buffer (4) og igen centrifugeret ved 4 ° C (kold centrifugering) (5). Pelleten indeholdende uopløselige kontaminanter kasseres (6a), mens supernatanten indeholdende opløselige ELP bibeholdt (6b). Cycles af skiftevis varmt og koldt spin gentages, indtil den ønskede renhedsgrad er nået, som bestemt medSDS-PAGE. Klik her for at se en større version af dette tal.
Fig. 3. SDS-PAGE-analyse af ELP rensning produkter. Vellykket oprensning af en ELP bekræftes ved SDS-PAGE. Overudtrykt ELP er tydeligt i den rå E. coli lysat efter lydbehandling (2). Efter tilsætningen af PEI og centrifugering opløselige ELP vid udstrækning bibeholdes i supernatanten (3), selv om nogle ELP er tabt i den kasserede pellet af uopløselige stoffer (4). Supernatant efter den første varme tur indeholder betydelige niveauer af opløselige stoffer (5). Supernatant efter den første kolde centrifugering viser god separation af ELP fra uopløselige kontaminanter (6). Yderligere cykler af varme (7) og cgamle spin (8) fjerne resterende opløselige og uopløselige urenheder indtil henholdsvis endelige hot (9) og koldt spin-(10) supernatanter udvise uvedkommende forurenende bånd, bekræfter tilfredsstillende renhed ELP produkt. Denne ELP homopolymer med en sekvens af SKGPG-(VGVPG) 80-Y, har en forventet molekylvægt på 33.37 kDa. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4.. Karakterisering af ELP homopolymer af temperatur-programmerede turbidimetri. ELP T t bestemmes ved at overvåge OD ved 350 nm samtidig øge temperaturen med en hastighed på 1 ° C / min. A) ELP homopolymerer udviser en enkelt kraftig stigning i OD at defines deres T t ved en given koncentration. B) reversibilitet ELP overgang verificeres ved at overvåge OD ved 350 nm af en 25 μ M opløsning, mens faldende temperatur, hvor reversibilitet bekræftes af tilbagelevering af OD til baseline. Denne ELP homopolymer har sekvensen SKGPG-(VGVPG) 80-Y. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5.. Karakterisering af ELP diblokcopolymer ved temperatur-programmerede turbidimetri og dynamisk lysspredning. ELPS der gennemgår nano-skala self-assembly, såsom ELP diblokcopolymerer at selv samle ind sfæriske miceller, udviser mere komplekse turbiditet profiler.
Discussion
ELPS tilbyder en billig og kromatografi-fri midler til rensning ved udnyttelse af deres stimulus-responderende fase adfærd. Denne fremgangsmåde drager fordel af LCST adfærd ELPS og peptid-eller protein ELP fusioner til at fjerne både opløselige og uopløselige urenheder efter ekspression af genetisk indkodede ELPS i E. coli. Denne lette oprensning kan anvendes til fremstilling af ELPS til en lang række applikationer, eller kan udnyttes til oprensning af rekombinante peptider eller proteiner, hvor ELP kan virke som en rensning tag, der kan fjernes med post-rensning forarbejdning.
ELP rensning involverer indledende skridt til at lysere E. coli og fjerne genomisk og uopløselige cellerester fra den rå kultur-lysat (figur 1), efterfulgt af fjernelse af resterende opløselige og uopløselige urenheder ved ITC (figur 2). Centrifugering efter udløsning ELP overgang ved tilsætningtion af varme eller saltet udskilles ELP fra opløselige stoffer i supernatanten i et trin betegnes en varm spin. Efter resolubilizing ELP opløsningen centrifugeret igen ved en temperatur under T t for at fjerne uopløselige kontaminant pellet i et trin kaldes en kold spin. Skiftende varme og kolde spin forbedrer renheden af ELP opløsning med hver cyklus, på en lille pris at give. Oprensningsudbytter variere efter ELP T t, længde og fusionerede peptider eller proteiner. Typisk er denne protokol giver 100 mg renset ELP per liter E. coli kultur, men udbyttet kan nå op til 500 mg / L. Den endelige renhed ELP produkt bekræftes ved SDS-PAGE (figur 3). MW af det oprensede ELP skal matche tæt sammen med den teoretiske MW kodes af ELP genet. Men nogle ELPS vandrer ved SDS-PAGE med en tilsyneladende MW på op til 20% højere end den forventede MW 9 27. Mere præcis analyse af ELPMW kan opnås ved MALDI-TOF-MS, som også kan give yderligere oplysninger om renheden af ELP produkt sammen med retvinklede analytiske teknikker såsom high-performance væskekromatografi (HPLC).
Efter oprensning er ELP T t målt ved temperaturprogrammeret turbidimetri. Denne teknik overvåger OD af en ELP opløsning, mens temperaturen øges. T t er koncentrationsafhængig, så det er tilrådeligt at karakterisere en koncentration serie er relevant for den tilsigtede anvendelse af ELP. For ELP Homopolymerer turbiditeten profil udviser en enkelt, skarp stigning, der svarer til ELP overgangen fra Unimer til mikron-skala aggregater (figur 4A). T t er defineret som den temperatur, der svarer til vendepunktet i turbiditet profil bestemmes nøjagtigt som maksimum af den første afledede af OD med hensyn til temperatur. ReversibilitetELP faseovergang bekræftes ved et fald i OD til baseline som temperaturen sænkes under T t (figur 4B). Den uklarhed profil med stigende og faldende temperatur ramper vil variere i størrelse og kinetik grund til bilæggelse af ELP koacervater og variabel hysterese ELP resolubilization. Peptid-eller protein ELP fusioner ligeledes udviser LCST adfærd på denne måde, hvor peptidet eller proteinet er fusioneret til ELP påvirker T t. For protein ELP fusionerer overgangen er reversibel under smeltetemperaturen af proteinet. Mens temperaturprogrammeret turbidimetri er en fremragende metode til indledende termiske karakterisering af ELP produkter, alternative teknikker, såsom differentiel scanningskalorimetri (DSC), kan også anvendes til at måle ELP T t.
ELPS med mere komplekse arkitekturer udviser mere komplicerede termiske adfærd, der kan også være kendetegnet ved temperatur-prograMMED turbidimetri. ELP diblokcopolymerer, for eksempel, udviser en karakteristisk turbiditet profil, der svarer til deres temperatur-udløst selvsamling til sfæriske miceller på deres kritiske micellization temperatur. For sådanne ELP diblokcopolymerer OD typisk først stiger 0,1-0,5 enheder over baseline, der angiver overgangen fra unimers til miceller, hvorefter en kraftig stigning i OD (op til 2,0 enheder over baseline) ved en højere temperatur indikerer dannelsen af micron-skala aggregater (figur 5A). Yderligere information om temperatur-udløst selvsamlede ELP strukturer opnås med DLS, en teknik, der måler R H ELP samlinger i opløsning. Ændringer i R H enig tæt sammen med ændringer i OD målt med turbidimetri (figur 5B). ELP unimers typisk udviser en R H <10 nm, mens nanopartikel forsamlinger udviser en R H ~ 20-100 nm og aggregater udviser en R H 17, 23, 29.
På grund af justerbarhed af ELP termiske egenskaber, er en vifte af T t s opnået ved forskellige ELP designs. Det er vigtigt at huske på, at den iboende T t vil påvirke optimering af oprensningsprotokollen for hver ELP, hvor ekstremt lav eller høj T t s vil kræve mest modifikation til denne standard protokol. ELPS med ekstremt høje temperaturer overgang kan være uegnet til rensning med denne fremgangsmåde. Hvis udformningen af nye ELPS og peptid eller protein ELP fusioner kan kompromittere den termiske reaktion ELP kan en simpel histidinmærke medtages alternative oprensning ved immobiliseret metal-affinitetskromatografi. Derudoveregenskaber ELP sekvens kan kræve ændring af denne protokol, hvis gæsten rest er opladet. Manipulation af pH kan anvendes som en metode til at ændre den samlede afgift af ELP i et forsøg på at eliminere elektrostatiske interaktioner med kontaminanter 17. Desuden er denne protokol er passende for den særlige omstændighed, af ELP fusioner med peptider og proteiner, når der træffes passende foranstaltninger for at sikre, rensningsprocessen ikke forstyrrer aktiviteten af den fusionerede delen. Noter hele protokollen om sådanne ændringer tjener til at lede rensning af ELPS, der kan præsentere disse udfordringer med hensyn til t t, opladning, eller fusion bekymringer.
Oprensningen af ELPS ved hjælp af deres LCST adfærd viser en enkel og kromatografi-fri fremgangsmåde til at oprense de fleste af ELPS og peptid-eller protein ELP fusioner udtrykkes i E. coli. Protokollen opsummeret her tillader rensning of ELPS i en enkelt dag ved hjælp af udstyr, der er fælles for de fleste biologiske laboratorier. Den lette rensning af ELPS og deres fusioner vil, håber vi, tilskynde til en stadigt voksende mangfoldighed i ELP designs til nye applikationer i materialevidenskab, bioteknologi og medicin.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NSF Research Triangle MRSEC (DMR-1.121.107).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pET-24a(+) pET-25b(+) |
Novagen | 69749-3 69753-3 |
T7-lac expression vectors with resistance to kanamycin (pET-24) or ampicillin (pET-25). |
| Ultra BL21 (DE3) competent cells | Edge BioSystems | 45363 | Competent E. coli for recombinant protein expression. |
| Terrific Broth (TB) Dry Powder Growth Media | MO BIO Laboratories | 12105 | Media is reconstituted in DI H2O and autoclaved before use. |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactoside (IPTG) | Gold Biotechnology | I2481C | IPTG is reconstituted in DI H2O, sterile filtered, and added to cultures to induce enhanced expression. |
| Phosphate buffered saline (PBS) tablet | Calbiochem | 524650 | These PBS tablets, when dissolved in 1 L of DI H2O, yield a 10 mM phosphate buffer with 140 mM NaCl, and 3 mM KCl with a pH of 7.4 at 25 °C. |
| Polyethyleneimine (PEI) Solution (~50% w/v) | MP Biomedicals | 195444 | PEI is prepared as a 10% (w/v) solution in deionized H2O. |
| Nalgene Oak Ridge high-speed centrifuge tubes, 50 ml | Thermo Scientific | 3138-0050 | These round-bottom tubes withstand high-speed centrifugation of 30-50 ml. |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP-HCl) | Thermo Scientific | 20491 | A stock solution of TCEP-HCl is prepared at 100 mM in DI H2O and adjusted to pH 7.0. For ELPs with a high cysteine content the stock solution of this reducing agent is added to the ELP pellet to reach 10 mM in H2O. |
| Ready Gel Tris-HCl gel, 4-20% linear gradient polyacrylamide gel, 10 well, 30 μl | Bio-Rad Laboratories | 161-1105 | These linear gradient gels offer good visualization of ELPs with a range of MWs. |
| Cupric chloride dihydrate (CuCl2·2H2O) | Fisher Scientific | C454-500 | A filtered 0.5 M solution is prepared for negative staining of Tris-HCl polyacrylamide gels. |
| Anotop 10 syringe filter: 0.02 μm 0.1 μm 0.2 μm |
Whatman | 6809-1002 6809-1012 6809-1022 |
These 10-mm diameter syringe filters allow preparation of small volumes for DLS measurements. |
| Millex-HV filter: 0.45 μm |
EMD Millipore | SLHVX13NK | These 13-mm diameter syringe filters allow preparation of small volumes of solutions with large nanoparticle assemblies for DLS measurements. |
References
- Urry, D. W. Physical Chemistry of Biological Free Energy Transduction As Demonstrated by Elastic Protein-Based Polymers. J. Phys. Chem. B. 101, 11007-11028 (1997).
- Sallach, R. E., Conticello, V. P., Chaikof, E. L. Expression of a recombinant elastin-like protein in pichia pastoris. Biotechnology progress. 25, 1810-1818 (2009).
- Schipperus, R., Teeuwen, R. L., Werten, M. W., Eggink, G., de Wolf, F. A. Secreted production of an elastin-like polypeptide by Pichia pastoris. Appl Microbiol Biotechnol. 85, 293-301 (2009).
- Schipperus, R., Eggink, G., de Wolf, F. A. Secretion of elastin-like polypeptides with different transition temperatures by Pichia pastoris. Biotechnology progress. 28, 242-247 (2012).
- Herzog, R. W., Singh, N. K., Urry, D. W., Daniell, H. Expression of a synthetic protein-based polymer (elastomer) gene in Aspergillus nidulans. Appl Microbiol Biotechnol. 47, 368-372 (1997).
- Conley, A. J., Joensuu, J. J., Jevnikar, A. M., Menassa, R., Brandle, J. E. Optimization of elastin-like polypeptide fusions for expression and purification of recombinant proteins in plants. Biotechnology and bioengineering. 103, 562-573 (2009).
- Conrad, U., et al. ELPylated anti-human TNF therapeutic single-domain antibodies for prevention of lethal septic shock. Plant biotechnology journal. 9, 22-31 (2011).
- Kaldis, A., et al. High-level production of human interleukin-10 fusions in tobacco cell suspension cultures. Plant biotechnology journal. 11, 535-545 (2013).
- Meyer, D. E., Chilkoti, A. Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system. Biomacromolecules. 3, 357-367 (2002).
- McDaniel, J. R., Mackay, J. A., Quiroz, F. G., Chilkoti, A. Recursive directional ligation by plasmid reconstruction allows rapid and seamless cloning of oligomeric genes. Biomacromolecules. 11, 944-952 (2010).
- Amiram, M., Quiroz, F. G., Callahan, D. J., Chilkoti, A. A highly parallel method for synthesizing DNA repeats enables the discovery of 'smart' protein polymers. Nat Mater. 10, 141-148 (2011).
- Meyer, D. E., Chilkoti, A. Quantification of the effects of chain length and concentration on the thermal behavior of elastin-like polypeptides. Biomacromolecules. 5, 846-851 (2004).
- Urry, D. W., et al. Temperature of Polypeptide Inverse Temperature Transition Depends on Mean Residue Hydrophobicity. Journal of the American Chemical Society. 113, 4346-4348 (1991).
- Urry, D. W. The change in Gibbs free energy for hydrophobic association - Derivation and evaluation by means of inverse temperature transitions. Chem Phys Lett. 399, 177-183 (2004).
- Cho, Y., et al. Effects of Hofmeister anions on the phase transition temperature of elastin-like polypeptides. The journal of physical chemistry. B. 112, 13765-13771 (2008).
- Kim, B., Chilkoti, A. Allosteric actuation of inverse phase transition of a stimulus-responsive fusion polypeptide by ligand binding. J Am Chem Soc. 130, 17867-17873 (2008).
- Hassouneh, W., Nunalee, M. L., Shelton, M. C., Chilkoti, A. Calcium binding peptide motifs from calmodulin confer divalent ion selectivity to elastin-like polypeptides. Biomacromolecules. 14, 2347-2353 (2013).
- Nettles, D. L., Chilkoti, A., Setton, L. A. Applications of elastin-like polypeptides in tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 62, 1479-1485 (2010).
- MacEwan, S. R., Chilkoti, A. Elastin-like polypeptides: biomedical applications of tunable biopolymers. Biopolymers. 94, 60-77 (2010).
- McDaniel, J. R., Callahan, D. J., Chilkoti, A. Drug delivery to solid tumors by elastin-like polypeptides. Adv Drug Deliv Rev. 62, 1456-1467 (2010).
- Hassouneh, W., Christensen, T., Chilkoti, A. Elastin-like polypeptides as a purification tag for recombinant proteins. Curr Protoc Protein Sci. , (2010).
- Shamji, M. F., et al. Development and characterization of a fusion protein between thermally responsive elastin-like polypeptide and interleukin-1 receptor antagonist: sustained release of a local antiinflammatory therapeutic. Arthritis Rheum. 56, 3650-3661 (2007).
- Hassouneh, W., et al. Unexpected multivalent display of proteins by temperature triggered self-assembly of elastin-like polypeptide block copolymers. Biomacromolecules. 13, 1598-1605 (2012).
- Lan, D. M., et al. An improved nonchromatographic method for the purification of recombinant proteins using elastin-like polypeptide-tagged proteases. Analytical Biochemistry. 415, 200-202 (2011).
- Bellucci, J. J., Amiram, M., Bhattacharyya, J., McCafferty, D., Chilkoti, A. Three-in-one chromatography-free purification, tag removal, and site-specific modification of recombinant fusion proteins using sortase A and elastin-like polypeptides. Angewandte Chemie. 52, 3703-3708 (2013).
- Compton, S. J., Jones, C. G. Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay. Anal Biochem. 151, 369-374 (1985).
- McPherson, D. T., Xu, J., Urry, D. W. Product purification by reversible phase transition following Escherichia coli expression of genes encoding up to 251 repeats of the elastomeric pentapeptide GVGVP. Protein expression and purification. 7, 51-57 (1996).
- Meyer, D. E., Chilkoti, A. Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides. Nat Biotechnol. 17, 1112-1115 (1999).
- McDaniel, J. R., et al. Self-assembly of thermally responsive nanoparticles of a genetically encoded peptide polymer by drug conjugation. Angewandte Chemie. 52, 1683-1687 (2013).
