Summary
Elastin benzeri polipeptitler, yeniden birleştirici protein arıtma için ilaç teslim çeşitli uygulamalar ile uyarıcı yanıt biyo-polimerler vardır. Bu protokol, kromatografi için basit bir alternatif olarak bunların düşük kritik çözelti, sıcaklık faz geçiş davranışları kullanılarak Escherichia coli'den elastin gibi polipeptidler ve bunların peptid veya protein füzyonlarının saflaştırılmasına ve karakterizasyonunu tarif etmektedir.
Abstract
Elastin gibi polipeptididnin karakteristik geçiş sıcaklığı aşağıdaki gibi çözülebilir unimers mevcut ve bunların geçiş sıcaklığının üstünde mikron çaplı koaservatların içine toplayarak, bir düşük kritik çözelti sıcaklığı faz geçiş davranışı gösteren tekrarlayan biopolimerler vardır. Genetik düzeyde elastin gibi polipeptidlerin tasarımı termal özelliklerini belirleyen kendi dizisi ve uzunluğu, kesin kontrolüne izin verir. Elastin gibi polipeptidler biosensörleme, doku mühendisliği ve ELP geçiş sıcaklık ve biopolimer mimari ilgi belirli bir uygulama için ayarlanmış olabilir ilaç dağıtımı da dahil olmak üzere çeşitli uygulamalarda kullanılmaktadır. Ayrıca, elastin gibi polipeptidlerin düşük kritik çözelti sıcaklığı faz geçiş davranışları, termal tepki, kendi saflaştınlmasma olanak tanıyan ve bunların seçici koaservasyon çözündürülmesi olanak sağlayacak şekilde hem çözünür ve çözünmez kirleticinin kaldırmas Escherichia coli içinde ifade, aşağıdaki. Bu yaklaşım, elastin gibi polipeptidler, tek başına ya da genetik olarak elastin gibi polipeptit etiketleri eklenir rekombinan peptitler veya proteinler kromatografi olmadan saflaştırılabilir peptid ya da protein füzyonları için bir saflaştırma aracı olarak saflaştırılması için de kullanılabilir. Bu protokol, elastin gibi polipeptidler ve bunların peptid veya protein füzyonlarının saflaştırılmasına açıklar ve saf elastin gibi polipeptid ürünleri termal davranışını değerlendirmek için temel karakterizasyon teknikleri açıklanır.
Introduction
Elastin benzeri polipeptitler (ELPS) X, konuk tortu, prolin dışında herhangi bir amino asittir, yinelenen pentapeptit VPGXG oluşan biyo-polimerler vardır. ELPS sergi düşük kritik çözelti sıcaklığı (LCST) faz geçiş davranışları, homojen bir ELP çözelti genel olarak literatürde ELP 1'deki ters geçiş sıcaklığı (T t) olarak adlandırılan kendi LCST'nin, ısıtmadan sonra iki faza ayrı olacak şekilde yerleştirilir. Bu iki faz, bir çok seyreltik ELP globule fazı ve bir ELP zengin fazın tortu oluşur. ELP zengin bir tortu, daha sonra birleşme mikron boyutlu parçacıklar haline ELP zincirlerinin toplama durumunda, kısa bir zaman ölçeği üzerinde oluşturulmuştur. Bu davranış, birkaç santigrat derecelik bir aralığı üzerinde oluşur ve homojen bir solüsyon T t altındaki bir sıcaklığa döndükten sonra elde edilmektedir, tipik olarak tersine çevrilebilir.
ELPS tipik haliyle ileri geri Escherichia coli (E. coli) sentezlenirbir ekspresyon plazmidi içerisine bağlanmıştır bir yapay gen m. Bu plazmid, bundan sonra, bir E: dönüştürülmüştür Protein ekspresyonu için uygun olan coli hücre hattı. Biz, sadece E. ELPS büyük bir çeşitlilik ekspresyonu için T7-lac pET vektör sistemini kullanmıştır E. coli, maya 2-4, mantar 5 ve bitkiler 6-8 Diğer sentezleme sistemleri, diğer araştırmacılar tarafından kullanılmıştır, ancak. Yaklaşımlar bir dizi genetik özyinelemeli yönlü ligasyonu (RDL) 9, plazmid rekonstrüksiyonu (PRE-RDL) 10 tarafından özyinelemeli yönlü ligasyon dahil, tekrarlayan ELP genleri oluşturmak için var, ve uzatma yuvarlanan çember amplifikasyonu (OERCA) 11 örtüşüyor. Genetik düzeyde ELPS mühendisi yeteneği daha fonksiyonel ile eklenebilir mimarileri çeşitli (örneğin, Monobloklar, ikili bloklar, triblokları, vb) ile ELPS oluşturmak için rekombinant DNA teknikleri kullanmak için fırsat tanıyorpeptidler ve proteinler. Genetik seviyede kontrol aynı zamanda her bir ELP tek dağılımlı mükemmel bir biyopolimer ürünleri temin ederek, kesin uzunluğu ve genetik plasmid şablonu tarafından dikte bileşimi ile ifade edilir sağlar.
Her bir ELP termal özellikleri örneğin molekül ağırlığı (MW) ve sırayla, yanı sıra, çözelti içindeki konsantrasyonu ve bu tuzları gibi diğer cosolutes varlığında da dahil olmak üzere dış faktörler olarak biopolimer için içsel parametrelere bağlıdır. ELP 12 ve misafir tortu, bileşimin uzunluğu 1, 13, 14, hidrofobik misafir artıkları ve uzun zincir uzunlukları daha düşük T t s neden T t, kontrol etmek için kullanılabilir ELP tasarımında iki ortogonal parametreleri ise hidrofiliktir Konuk artıkları ve daha kısa zincir uzunlukları daha fazla T t s neden olur. ELP konsantrasyonu ters T t, gr çözümlerine ilgiliyiyen ELP konsantrasyonu düşük T t s 12 var. Tuzların türü ve konsantrasyonu da tuzların etkisi Hofmeister dizi 15 aşağıdaki ELP T t etkileyebilir. Kosmotropic anyonlar (Cl - ve Hofmeister serisi yüksek) ELP T t düşürmek ve artan tuz konsantrasyonu bu etkiyi artırır. Bu iç ve dış parametrelerinin bir ELP bir belirli bir uygulama için gerekli olan bir hedef sıcaklık aralığında termik davranışı elde etmek için ayarlanmış olabilir.
ELPS bir uyarıcı yanıt veren davranış biosensörleme 16, 17, 18 doku mühendisliği ve ilaç salınımı 19, 20 dahil olmak üzere, çeşitli uygulama aralığı için yararlıdır. ELPS genetik düzeyde peptidler ya da proteinler ile kaynaşmış, ayrıca, yeniden birleştirici ELP moral saflaştırılması için ucuz bir toplu bir yöntem sağlamak için basit bir saflaştırma etiketi olarak görev yapabilirHiçbir kromatografisi 21 gerektirir gelgitler ya da proteinler. Saflaştırma işleminin modifikasyonu ELP kaynaşmış peptid veya proteinin aktivitesi muhafaza edilmesini sağlar. Peptid ya da protein füzyonları ELP ELP etiket 22, 23 ya da seçenek olarak, serbest peptid veya protein gerekli olduğunda, bir proteaz tanıma alanı, peptit veya protein ve ELP arasına sokulabilir yararlı olan uygulamalar için arıtılabilir. ELP etiketinin uzaklaştırılması, daha sonra serbest proteaz veya ikinci hedef peptit veya ikinci ELP etiketi ve proteaz ELP füzyon ayırabilen ELP saflaştırma bir son tur olarak işleme ek kolaylığı sağlayan bir proteaz ELP füzyon ile sindirme ile elde edilebilir tek bir aşamada 24, 25 protein. Aşağıdaki protokol termal özellikleri vasıtasıyla ELPS ve peptit ya da protein ELP füzyonları için saflaştırma prosedürü ve karakterize edilmesi için temel teknikleri açıklanırELP ürün termal tepki.
Protocol
1.. ELP Anlatım
- Bir DMSO hisse senedi veya E. agar koloni steril Müthiş Broth medya 3 ml inoküle T7-lac promotörünün kontrolü altında, istenen ELP kodlayan plazmid içeren protein ekspresyonu için uygun coli. Uygun antibiyotik eklemek ve sürekli 200 rpm'de çalkalanarak 37 ° C'de, gece boyunca (O / N) de inkübe edilir.
- 4-L bir şişe içinde Terrific Broth ortam steril 1 L O / N kültürün 1 ml ilave edilir. Uygun antibiyotik eklemek ve sürekli 200 rpm'de çalkalanarak, 24 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Not: Kültür 24 saat boyunca kuluçkaya yatırılmıştır halinde T7-lac promotör ile görülen "sızıntılı" taban ifade ELPS çok yüksek seviyede ifade edilmesi için yeterlidir. Kültürün optik yoğunluğu 0,6 ulaştığında, protein sentezleme daha 0.2-1 mM izopropil-p-D-tiyogalaktozid (IPTG) eklenmesiyle endüklenir burada Ancak, daha geleneksel bir yaklaşım kullanılabilir. 2,000 x g de 15 dakika süre ile 4 ° C'de bir 1-L santrifüj şişesi ve santrifüj 4-L şişesi kültür aktarın.
- Süpernatant atın. NOT: kültür fazla 1 L yetiştirilir onlar topağa kültürünün diğer bir litre eklenmesi ve adım 1.3 tekrarlanarak yoğunlaştırılabilir. Kültür kadar 2 L tek bir hücre peleti olarak yoğunlaştırılabilir.
- 50 ml konik tüp hücre süspansiyonu ve 45 ml transfer ulaşmak için fosfat tamponlu tuzlu su (PBS), su, ya da diğer arzu edilen tampon içinde pelletini.
2 ELP Arıtma:. Ön Adımlar ve Ters Geçiş Bisiklet Birinci Turu
- Buz üzerinde örnek tutarken, 10 'açık', saniye ve 85 W bir çıkış gücünde 20 saniye "kapalı" döngüleri 9 dakikalık bir toplam için yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücre pelletini sonikasyon. Kısaca Numune buz üzerinde soğutulur ve daha sonra bir kez daha en az 9 döngü tekrar izin verir. NOT: ELP çok düşük T t olması bekleniyorsa t yukarıdaki çözümün ısınmayı önlemek için 40 saniye kadar artırılabilir.
- Alt santrifüj tüpüne yuvarlak bir 50 ml lizat aktarın.
- Kültürün her bir litresi için,% 10 2 ml (w / v), polietilenimin (PEI) ekleyin ve karıştırın için sallayın. Not: PEI negatif yüklü genetik kirletici yoğunlaştırılmasıyla yardımcı olan, pozitif yüklü bir polimerdir. PEI da yoğunlaşmasına ve ELP ürün kaldırmak olabilir ELP negatif yüklü ise bu adımı yapmayın.
- 16000 x g ile 10 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüj.
- Alt santrifüj tüpü yuvarlak temiz bir 50 ml süpernatant aktarın ve pelet atın.
- İsteğe bağlı adım "out Bake": denatüre protein kirlilikleri ve daha sonra ELP tamamen çözündürülmüş kadar 4 ° C ya da buza transferi için 10 dakika boyunca 60 ° C 'de örnek inkübe edin. Santrifüj 16.000 x g de 10 dakika süre ile 4 ° C 'de örnek. Bir cl süpernatant aktarınyuvarlak ean 50 ml alt santrifüj tüpü ve pelet atın. NOT: Bir peptid veya protein ELP kaynaşmıştır ve yüksek ısı durumda denatüre bekleniyor eğer bu adımı yapmayın. Bu ELP geçiş ısı geri dönüşümsüz veya kaynaşık yarımının aktivitesini yok edebilir neden olabilir.
- Kristal NaCl ilave (değil 3 M aşan) ile ELP geçişi Induce. Seçenek olarak ise, (değil 0.3 M geçmeyen) bir sodyum sitrat daha fazla T t lar ya da düşük verimli olması ELPS için kullanılabilir. NOT: Tuz çözündükten sonra çözelti çözeltiden ELP faz ayrımını işaret bulanık dönmelidir. Yüksek T t s ile çok hidrofilik ELPS ELP geçişin bu ön indüksiyonunda ELP faz separasyonunu indüklemek için, tuz ilavesi ile bir arada, bir dereceye kadar ısıtma gerektirebilir.
- 16.000 xg (sıcak spin) 10 dakika oda sicakliginda (RT) santrifüj. NOT: Bir ELP pelet b gerekire, boyutu ELP salgılanma verimine bağlıdır görülmektedir. Bu ELP pellet ilk opak görünebilir, ancak soğutma sonra saydam görünür ve kahverengi renkte olabilir. Arıtma gelirleri ve pislikleri gibi ELP pelet daha renksiz olacak.
- Süpernatant atılır ve pelet istenilen tamponun 1-5 ml ekleyin. Pipetleme pelletini veya 4 ° C'de döndürmek için tüp ayarlama Not: tampon gerekli olan hacim ELP topak boyutuna bağlı olacak ve böylece tampon yeterli miktarda ELP pelet yeniden çözündürülmesi için izin vermek için ilave edilmelidir ELP ifade, verim. Kirletici proteinleri ile disülfıd etkileşimleri ortadan kaldırmak için, pH 7, 10 mM Tris (2-karboksietil) fosfin hidroklorür (TCEP-HCl), su ile arıtma yüksek sistein içeriği yarar ELPS. Ayarlanmış bir pH arıtma yüksek ücret içeriği parası ile ELPS onların yükünü nötralize ve taşırıcı azaltmak içinkirletici proteinlerle ctrostatic etkileşimleri.
- Temiz 1.5 ml mikrosantrifüj tüplerine 1 ml alikotlar içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş ELP çözüm aktarın.
- 16000 x g'de (soğuk sıkma), 10 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüj. Çözünmeyen maddelerden küçük bir pelet dikkat edilmelidir.
- Temiz bir tüpe aktarın ve süpernatant pelet atın.
. 3. ELP Arıtma: Ters Geçiş Cycling sonraki turlar
- Isı ve / ya da NaCl ilavesi ile ELP geçiş neden. Numuneler T t üstünde bir sıcaklıkta 15 dakika boyunca bir ısı bloğu ya da bir su banyosu içinde inkübe edilebilir. Bununla birlikte, ELP (ısı kullanımını engelleyen) bir proteine kaynaştırılmış ya da ELP tek başına ısı ile ulaşılamayan yüksek bir T t, NaCI, 5 M çözelti varsa uyarılması için damla damla ilave edilebilir ise ELP geçiş. Not: Çözelti, çözeltiden ELP faz ayrımını işaret bulanık dönmelidir.
- , Süpernatant atılır istenilen tamponun 500-750 ul ekleyin ve pipetleme pelet tekrar süspansiyon ya da 4 ° C 'de döndürmek için tüp ayarlama
- 16000 x g'de (soğuk sıkma), 10 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüj. Çözünmeyen maddelerden küçük bir pelet dikkat edilmelidir.
- Temiz bir tüpe aktarın ve süpernatant pelet atın.
- Hiçbir kirletici pelet adım 3.4 sırasında gözlenen kadar tekrarlayın 3,1-3,5 adımları.
4. Post-arıtma İşleme (isteğe bağlı)
- Eğer arzu edilirse, saflaştırılmış ELP çözeltisinden fazla tuzu çıkarmak için uygun bir tampon maddesine karşı diyalize örnek. Not: liyofilize edilecek ELPS olmalıdır4 ° C'de 2 GKD OO / N karşı diyaliz
- Arzu edildiği takdirde, önce, O / N liyofilize için 30 dakika boyunca -80 ° C 'de bir solüsyonun dondurulması ile uzun süreli depolama için liyofilize edilir ELP Not: Liyofilizasyon ekteki proteinlerle ELPS için kullanılmamalıdır.
- Eğer arzu edilirse, ELP etiketi kaldırarak bir peptid ya da protein ELP füzyon serbest peptid veya proteinin geri kazanılması:
- (Proteaz tedarikçi tarafından tavsiye edildiği gibi) biyotinlenmiş proteaz ile ya da genetik olarak peptit veya protein ve ELP arasında tasarlanmış proteaz sitesine karşılık gelen bir proteaz ELP füzyonu ile peptid ya da protein ELP füzyon Digest.
- Mevcut ise, (proteaz tedarikçi tarafından tavsiye edildiği gibi) streptavidin ile modifiye edilmiş boncuklar kullanılarak biyotinile proteazı çıkarın.
- 5 M NaCl çözeltisinin damla damla eklenmesiyle ayrılır ELP ve / veya proteaz ELP füzyon geçiş Induce.
- 16000 x g ile 10 dakika boyunca oda sıcaklığında santrifüjleyin. NOT: Bir ELP pelet dikkat edilmelidir.
- Süpernatant toplayın ve ELP pelet atın. Arzu edilen bir tampon maddesine karşı süpernatantı Dialyze veya saf peptit veya protein çözeltisinden yüksek tuz konsantrasyonu çıkarmak için bir tampon değişimi gerçekleştirmek için bir santrifüj filtre kullanmak.
- Sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile ELP etiketi serbest peptid veya proteinin tam bölünme teyit edin.
5. karakterizasyonu:. SDS-PAGE
- 2-merkaptoetanol ihtiva eden numune tampon maddesi 10 ul su içerisinde seyreltilmiş 10 ul ELP karıştırılarak SDS-PAGE için ELP numune hazırlayın. Not: ELP 40 ug genellikle ELP ürünün boyutu ve saflığı değerlendirmek için yeterlidir.
- 2 dakika boyunca 100 ° C'de inkübe edin ve numune daha sonra, uygun boyutlu protein merdiven ile birlikte bir poliakrilamid jel üzerine yerleştirin.
- Renk verici madde jelin (yaklaşık 45 dakika) alt yaklaşana kadar 180 V jel çalıştırın.
- Lekesallanan ise, 5 dakika boyunca bir 0.5 M CuCl 2 solüsyonu ile jel. NOT: Bazı ELP dizileri, bu boya ile etkileşmeyen gibi ELPS tipik haliyle, Coomassie Parlak Mavi leke ile görünür değildir. Coomassie Brilliant Blue arginin kalıntıları ile esas olarak etkileşim ve temel kalıntılar-histidin ve lisin ve aromatik artıkların-triptofan, tirozin, fenilalanin ve 26 ile zayıf bir şekilde etkileşime girer. Böylece ELPS ve peptit ya da protein füzyonları ELP primer sekans Bu özel artıklar yeterli bir dizi içerir, sadece Coomassie Parlak Mavisi ile boyanmış olabilir.
- ELP bandın MW ELP geninden ve herhangi bir yabancı kirletici grupları mevcut olduğu beklenen teorik MW tekabül emin olun. NOT: Bazı ELPS kendi beklenen MW 9, 27 den% 20'ye kadar daha yüksek bir MW'da göç.
6. Özellik belirlemesi:. Matris destekli lazer desorpsiyon /iyonizasyon Time-of-Flight kütle spektrometresi (MALDI-TOF-MS)
- Yaklaşık 25 uM bir ELP konsantrasyon elde etmek için% 0.1 trifluoroasetik asit içeren% 50 sulu asetonitril bir ELP çözelti hazırlayın. Not: ELP, saflaştırma işleminden sonra, H2O karşı diyaliz gerekir böylece bu çözelti, tuz arındırılmış olması gerekir.
- % 0.1 trifloroasetik asit içeren% 50 sulu asetonitril içinde doymuş sinapinik asit, bir matris çözeltisi hazırlayın.
- Yaklaşık olarak 2.5 pmol / ul bir ELP konsantrasyon elde etmek için matris solüsyon 9 ul ELP çözeltinin 1 ul ekleyin. Not: Bu karışım, bundan başka, MALDI-TOF sinyal optimize etmek matris solüsyon ile seyreltilebilir.
- Mevduat 1-2 metal MALDI tabağa ELP-matris karışımı ul ve nokta tamamen kurumasını bekleyin.
- ELP oranı (m / z) şarj ve ölçülen MW anlaması için kütlesini belirlemek için MALDI-TOF ile 5-10 spektrumları elde.
7. Characterization: Sıcaklık programlı Turbidimetri ve Dinamik ışık saçılımı
- Sıcaklık programlı türbidimetrisi ile ELP ait T t belirleyin:
- Istenilen tampon ELP çözümler (5-100 uM örn.,) bir seyreltme serisi hazırlanır.
- Sıcaklık kontrollü bir UV-Vis spektrofotometre kullanılarak, 1 ° C / dk 'lık bir ısıtma hızında sıcaklıkları (örneğin, 20-80 ° C), bir aralığı üzerinde 350 nm'de optik yoğunluk (OD) ölçün. NOT: OD hiçbir artış görülürse T t enstrümanın üst sıcaklık sınırını aşabilir. Belirgin T t NaCI eklenerek azaltılabilir. 1 M NaCl ile başlayın ve ELP geçiş ölçülebilir bir sıcaklık aralığı içinde tespit edilene kadar 0.5 M adımlarla artar.
- 1 ° C / dk bir soğutma oranında sıcaklığın aynı aralığında OD azalmayı ölçerek ELP geçişin geri döndürülme oranı kontrol edin.
- Homo ve T t belirleyinPolimer ELP bulanıklık profili bükülme noktasının belirlenmesi ile (OD sıcaklığa göre çizilmiştir.) NOT: Bu sıcaklık kolayca türevinin maksimum karşılık gelen sıcaklık T olarak T gibi tanımlanmıştır OD eğrisinin türevinden tanımlanabilir. Daha karmaşık ELP mimarileri daha karmaşık bulanıklık profillerini görüntüler ve bölüm 7.2 'de anlatıldığı gibi detaylı analiz edilmelidir.
- Daha karmaşık bir termal özellikleri (küresel miseller halinde kendi kendine birleşebilen ör ELP ikili blok kopolimerleri) göstermek ELPS ilave vasıflandırmanın dinamik ışık saçılımı (DLS) ile elde edilir:
- Istenilen tampon içinde bir ELP çözelti hazırlayın ve 20-450 nm gözenek boyutuna sahip bir filtre boyunca örnek geçmektedir. NOT: filtre gözenek boyutunun seçimi çözelti içinde herhangi bir ELP düzeneklerinin varlığı, boyutu ve kararlılık bağlıdır. En küçük uygun filtre gözenek boyutu gibi kirletici maddeleri ortadan kaldırmak için tercih edilir,DLS ölçümleri kalitesini azaltmadığını toz. Küçük filtre gözenek boyutları arasında bir ELP çözüm geçerken önemli bir direnç yaşadığı zaman daha büyük bir filtre gözenek boyutu kullanılmalıdır.
- Bulanıklık profili tespit ilgi bölgeye karşılık gelen bir sıcaklık aralığı üzerinde hidrodinamik yarıçapı (R H) ölçün. NOT: ELP unimers genellikle R, H <10 nm, nanoparçacık meclisleri bir R, H ~ 20-100 nm var, ve agrega bir R H var> 500 nm var. R, H, her bir artış, parçacığın büyüklüğü ile orantılı olan sıcaklığın bir fonksiyonu olarak UV-Vis spektrofotometre ile ölçülmüştür 350 nm'de OD bir artışa karşılık gelmelidir.
Representative Results
Burada bir ELP homopolimeri ve bir ELP iki bloklu kopolimerin saflaştırılması ve karakterizasyonu için temsili sonuçlar açıklanmaktadır. E. koli içinde ifade 24 saat sonra E. coli, hücreler santrifüj ile toplanır ve sonikasyon ile parçalanır. Tipik olarak, renkli küçük bir değişiklik yeterli hücre lizizine (Şekil 1A) teyit sonication sonra ortaya çıkar. PEI ilave edildikten sonra, genomik parça ve hücresel artıkların, üstte yüzen madde içindeki çözünür ELP (Şekil 1 B) çözünmeyen kirletici maddelerin büyük bir pelet ayrılması, santrifüj ile toplanır. ELP daha fazla çözünür ve çözünmez hem kirletici (Şekil 2) 28 ELP ayırmak için LCST davranışı kullanan ters geçiş döngüsü (ITC) ile saflaştırılmıştır. ELP faz geçiş ısı ve / veya tuz ilavesi ile tetiklenir. ELP a oluşur tüpün altındaki bir topak oluşumu ile santrifüj sonucund, bazı çözünmeyen kirletici (Şekil 1C). ELP pellet muhafaza ve soğuk tampon maddesi içinde tekrar süspanse edilir iken bu süpernatan sıcak spin-atar çözünür kirleticiler adım olarak adlandırılır. Çözündürülmüş ELP 4 ° C'de tekrar santrifüje tabi tutulur Çözünür ELP içeren süpernatan muhafaza edilirken bu soğuk spin-attığı çözünmeyen kirliliklerin topak adım olarak adlandırılır. Sıcak ve soğuk spin alternatif döngüsünü tekrarı ELP saflığını artırır ancak artık ELP santrifüj tüplerine ve pipet uçları her ITC tur sırasında kaybolur gibi hafif, verim azaltılması pahasına.
ELPS ve peptit ya da protein füzyonları ELP başarılı saflaştırılması, SDS-PAGE ile teyit edilir. Saflaştırma işlemi boyunca alınan küçük alikoları E'den ELP progresif saflaştırılmasını göstermektedir coli lizatı. ELP ham E de fazla ortaya konmaktadır coli lizat ve kirletici zekâ azaltmakITC (Şekil 3) h arda mermi. Saflaştırılmış ELP tahmin edilen teorik MW yakınındaki tek bir bant olarak ortaya çıkar.
ELP T t sıcaklık programlı bir bulanıklık ile karakterize edilir. Bir ELP homopolimer bulanıklık profili (yaklaşık olarak 2,0 birim 25 uM arasında bir ELP konsantrasyonu için taban ile elde edilmiş) 350 nm 'de OD tek bir keskin bir artış (Şekil 4A) gösterir. OD sıcaklık T t (Şekil 4B) altına düştüğü zaman başlangıç değerine geri döner soğutma bulanıklık taramaları ELP geçişin tersine çevrilebilir doğasını doğrulamaktadır. ELPS homopolimerin kıyasla ELP İkili blok kopolimerler, daha karmaşık bir bulanıklık profil sergiler. OD, tipik olarak ilk önce taban üzerinde 0.1-0.5 birimlerine artar, daha sonra taban üzerinde 2,0 adet sert OD artar (Şekil 5A). DLS ölçümleri sıcaklık, co ile ilgili olarak R, H değişiklik hakkında bilgi sağlamak bilgi rroborating bulanıklık profili (Şekil 5B) kazandı.
Şekil 1. Ön arıtma ELP. Ifade E: 24 saat sonra E. coli hücreleri, santrifüj ile toplandı ve PBS içinde tekrar süspanse edilir. A) Hücreler lizat DNA kirletici maddelerin yoğunlaşmasına PEI ilave edildikten sonra sonikasyon. B) sonra koyulaşır şekilde, lizat olduğu renkli ince bir değişiklik eşlik sonifikasyon ile lize edilmiştir santrifüjlenmiş ve çözünmeyen enkaz büyük bir topak ELP geçiş ısı ve / veya tuz ve santrifüj formları saydam bir ELP topak ilavesi ile indüklenir süpernatan. ° C) içinde çözünür ELP ayrılır.ank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Şekil 2,. Ters geçiş bisiklet. ELP çözünür ve çözünür olmayan hem de kirletici onun LCST davranışı vasıtasıyla saflaştırılır. (1) ELP geçiş ısı ve / veya tuzu ve ELP ilavesi ile başlatılır ELP zengin lizat santrifüj ile başlayarak (sıcak bir dönüş) ile ayrılır (2). Çözünür Kirli maddeler içeren süpernatan atılır ise ELP topak (3a) muhafaza edilir (3b). ELP soğuk tampon maddesi (4) içinde yeniden süspansiyona alınmış ve 4 ° C'de (soğuk sıkma) tekrar santrifüj edilir (5). Çözünür ELP içeren süpernatan muhafaza edilirken çözünmeyen kirlilikleri ihtiva eden topak (6a) atılır (6b). Ile tespit edildiği üzere, istenen saflık, ulaşana kadar sıcak ve soğuk spin alternatif döngüleri tekrarlanırSDS-PAGE. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
ELP arıtma ürünleri Şekil 3,. SDS-PAGE analizi. Bir ELP başarılı saflaştırılması, SDS-PAGE ile teyit edilir. Aşırı ifade ELP ham E belirgindir Sonikasyon sonrasında coli lisat (2). Bazı ELP çözünmeyen kirliliklerin pelet atılır kaybolur rağmen PEI eklenerek ve santrifüj edildikten sonra, çözünür ELP büyük ölçüde, süpernatan (3) içinde tutulur (4). Birinci sıcak bir dönüş aşağıdaki Süpernatant çözülebilir kir önemli seviyelerde bulunmakta (5). Ilk soğuk bir dönüş aşağıdaki Üst faz, çözünmeyen kirliliklerden ELP iyi ayrılmasını göstermektedir (6). Sıcak (7) ve c ilave döngüleriEski son sıcak (9) ve soğuk sıkma (10) yüzer hiçbir yabancı kirletici madde bantları gösteren kadar (8) ELP ürünün saflığını teyit tatmin edici, sırasıyla, bir artık çözünür ve çözünmeyen kirlilikleri uzaklaştırmak döner. SKGPG-(VGVPG) bir dizi ile bu ELP homopolimer, 80-Y, 33.37 kDa beklenen bir molekül ağırlığına sahiptir. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Şekil 4,. Sıcaklık programlı bir bulanıklık derecesi ELP homopolimer karakterizasyonu. ELP T t 1 ° C / dak. A) ELP homopolimerleri sergi bir oranda tek bir keskin bir artış sıcaklığı artırarak 350 nm'de OD izleyerek saptanır OD ki defines belirli bir konsantrasyonu. B, T t) ELP geçişin tersine dönebilir tersinim bazal OD dönüşü ile teyit edilir, sıcaklık, düşürürken bir 25 μ M çözeltisinin 350 nm'de OD izlenmesi ile doğrulanır. Bu ADP homopolimer dizisini SKGPG-(VGVPG) 80-Y vardır. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Sıcaklık programlı bir bulanıklık ve dinamik ışık dağılımı ile ELP iki bloklu kopolimer Şekil 5. Karakterizasyonu. Tür küresel miseller halinde kendi kendine birleşebilen ELP diblok kopolimerler, sergi daha kompleks bulanıklık profiller olarak nano ölçekli kendini montaj tabi ELPS.
Discussion
ELPS onların uyarıcı-duyarlı faz davranış sömürü yoluyla saflaştırma ucuz ve kromatografi-ücretsiz araç sunuyoruz. Bu yaklaşım, E genetik olarak kodlanmış ELPS ekspresyonu sonrasında çözünen ve çözünmeyen kirlilikleri ortadan kaldırmak için ELPS ve peptit ya da protein ELP füzyonlar LCST davranış yararlanır coli. Bu saflaştırma kolaylığı çeşitli uygulamalar için ELPS üretmek için kullanılabilir, ya da ELP saflaştırma sonrası işleme ile uzaklaştırılabilir bir saflaştırma etiketi olarak hareket edebilir olan rekombinant peptidlerin veya proteinlerin saflaştırılması için kullanılabilir.
ELP arıtma E. lize etmek için ön adımları içerir coli ve ITC tarafından artık çözünür ve çözünmez kontaminantların çıkarılması (Şekil 2) ve ardından ham kültür lisatı (Şekil 1), genomik ve çözünmez hücre kalıntıları uzaklaştırılmıştır. Santrifugasyonun addi tarafından ELP geçiş tetikleme sonraısı veya tuz tion adım sıcak bir dönüş olarak adlandırılan olarak, süpernatan içinde çözünür kirlerden ELP ayırır. ELP resolubilizing sonra çözelti, çözünmeyen kirletici madde topak kaldırmak için T t altındaki bir sıcaklıkta tekrar santrifüj edilir bir aşamada soğuk bir dönüş adlandırılır. Sıcak ve soğuk spin Alternatif elde etmek üzere küçük bir maliyetle, her bir döngü ile ELP çözeltinin saflığını artırır. Arıtma verimleri ELP T t, uzunluk ve kaynaşık peptidler ya da proteinler bağlı olarak değişir. Tipik olarak, bu protokol E. litresi başına arıtıldı ELP 100 mg elde edilir coli kültür, ancak verim 500 mg / L'ye kadar ulaşabilir ELP ürünün nihai saflığı, SDS-PAGE (Şekil 3) ile teyit edilir. Saflaştırılmış ELP ait MW ELP geni tarafından kodlanan teorik MW ile yakın uyumlu olmalıdır. Bununla birlikte, bazı ELPS tahmini MW 9, 27 'den% 20'ye kadar daha yüksek bir MW'da SDS-PAGE içinde göç ederler. ELP daha hassas analiziMW, aynı zamanda, yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) gibi ortogonal analitik teknikleri ile birlikte ELP ürünün saflığı hakkında ek bilgi sağlayabilir MALDI-TOF-MS ile elde edilebilir.
Saflaştırma işleminden sonra, ELP T t sıcaklık programlı bir bulanıklık ölçülür. Sıcaklık artar Bu teknik, bir ELP çözeltisinin OD izler. Bu ELP amaçlanan uygulamaya uygun bir konsantrasyon dizi karakterize etmek için tavsiye edilir, böylece T t konsantrasyonu bağlıdır. ELP bulanıklık profil Unimer mikron çaplı agrega ELP geçişe karşılık gelen tek bir keskin bir artış (Şekil 4A) sergiler Homopolimerler. T t tam sıcaklığı ile ilgili olarak OD birinci türevinin maksimum olarak belirlenen bulanıklık profilindeki bükülme noktasına karşılık gelen sıcaklık olarak tanımlanır. ReversibilitesiELP faz geçiş sıcaklığı, T, t (Şekil 4B) altına indirilir gibi bazal OD bir azalma ile teyit edilir. Sıcaklık rampaları artan ve azalan ile bulanıklık profili nedeniyle ELP koaservatların ve ELP çözündürülmesi değişken Histerisizin yerleşme büyüklük ve kinetik farklı olacaktır. Peptid ya da protein füzyonları ELP benzer ELP kaynaşmış peptid veya protein T t etkiler, bu şekilde, bu LCST davranışı sergiler. Protein için ELP geçiş proteinin erime sıcaklığının altında tersine çevrilebilir füzyonlar. Sıcaklık programlı bir türbidimetre örneğin diferansiyel taramalı kalorimetri (DSC) gibi ELP ürünler, alternatif tekniklerin, ilk ısı karakterizasyon için mükemmel bir yöntem olmasına rağmen, aynı zamanda ELP T t ölçmek için kullanılabilir.
Ayrıca sıcaklık-progra ile karakterize edilebilir daha karmaşık mimarileri sergi daha karmaşık termal davranışları ile ELPSmmEd türbidimetri. ELP ikili blok kopolimerleri, örneğin, kritik miselizasyon sıcaklıkta küresel miseller içine ısı ile tetiklenen kendini montaj tekabül eden bir karakteristik bulanıklık profil sergiler. Bu tür ELP ikili blok kopolimerleri için OD tipik olarak önce daha yüksek bir sıcaklıkta bir tahlil içinde bir artış (en fazla 2.0 birim taban üzerinde) mikron ölçekli oluşumunu gösterir sonra miseller için unimers geçişi gösteren taban seviyelerin üzerinde 0.1-0.5 birimleri artar agrega (Şekil 5A). Sıcaklık tetiklenen kendini monte ELP yapılar hakkında ayrıntılı bilgiye DLS, çözelti içinde ELP düzeneklerinin R, H ölçen bir teknik ile elde edilmektedir. R, H değişiklikler bulanıklık (Şekil 5B) ile ölçülen OD değişikliklerle yakın kabul. Nanoparçacık derlemeleri bir R H sergileyen bir R, H ~ 20-100 nm ve agrega sergilerken ELP unimers tipik bir R, H <10 nm sergilerler 17, 23, 29 tarafından elde edilebilir.
Due ELP termal özelliklerin ayarlanabilirliği ile, T t s, bir dizi çeşitli ELP tasarımları ile elde edilir. Bu doğal T t aşırı düşük ya da yüksek T t ler bu standart protokole en değişiklik gerektiren her bir ELP için arıtma protokol optimizasyonu etkileyecektir akılda tutmak önemlidir. Son derece yüksek geçiş sıcaklıklarına sahip ELPS bu yaklaşım ile saflaştırılması için uygun olabilir. ELPS ve yeni peptid veya protein ELP füzyonlar tasarım ELP termik yanıtı tehlikeye atabilir ise, basit bir histidin etiketi hareketsiz metal afinite kromatografisi ile saflaştırılması için alternatif dahil edilebilir. Ek olarak,Konuk kalıntı şarj olup olmadığını ELP dizisinin özellikleri Bu protokolün değiştirilmesini gerektirebilir. Tampon pH manipülasyonu kirletici 17, elektrostatik etkileşimleri ortadan kaldırmak için bir çaba ELP genel yükü değiştirmek için bir yöntem olarak da kullanılabilir. Ayrıca, bu protokol, peptitler ve uygun tedbirler saflaştırma işlemi kaynaşık parçasının aktivitesini perturb etmez sağlamak için tedbirler alınmaktadır proteinlerle ELP füzyonlar özel bir durum için uygundur. Bu gibi değişikliklerle ilgili protokol boyunca Notlar T t, ücret, ya da füzyon endişeleri ile ilgili bu zorlukların ortaya çıkabilir ELPS arıtılmasını yönlendirmek için hizmet vermektedir.
Bunların LCST davranış ile ELPS saflaştırılması E olarak ifade edilen ELPS çoğunluğu ve peptit ya da protein füzyonları ELP arındırmak için basit ve kromatografi içermeyen bir yaklaşım sunar coli. Burada özetlenen protokol arıtma o izinen f biyoloji laboratuvarlarında ortak olan ekipmanları kullanarak, tek bir gün içinde ELPS. ELPS ve füzyonlarından saflaştırma kolaylığı, umarız, malzeme bilimi, biyoteknoloji ve tıp alanında yeni uygulamalar için ELP tasarımları giderek artan çeşitliliği teşvik edecektir.
Disclosures
Yazarlar ifşa etmek hiçbir rakip mali çıkarları var.
Acknowledgments
Bu çalışma NSF Research Triangle MRSEC (DMR-1121107) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pET-24a(+) pET-25b(+) |
Novagen | 69749-3 69753-3 |
T7-lac expression vectors with resistance to kanamycin (pET-24) or ampicillin (pET-25). |
| Ultra BL21 (DE3) competent cells | Edge BioSystems | 45363 | Competent E. coli for recombinant protein expression. |
| Terrific Broth (TB) Dry Powder Growth Media | MO BIO Laboratories | 12105 | Media is reconstituted in DI H2O and autoclaved before use. |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactoside (IPTG) | Gold Biotechnology | I2481C | IPTG is reconstituted in DI H2O, sterile filtered, and added to cultures to induce enhanced expression. |
| Phosphate buffered saline (PBS) tablet | Calbiochem | 524650 | These PBS tablets, when dissolved in 1 L of DI H2O, yield a 10 mM phosphate buffer with 140 mM NaCl, and 3 mM KCl with a pH of 7.4 at 25 °C. |
| Polyethyleneimine (PEI) Solution (~50% w/v) | MP Biomedicals | 195444 | PEI is prepared as a 10% (w/v) solution in deionized H2O. |
| Nalgene Oak Ridge high-speed centrifuge tubes, 50 ml | Thermo Scientific | 3138-0050 | These round-bottom tubes withstand high-speed centrifugation of 30-50 ml. |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP-HCl) | Thermo Scientific | 20491 | A stock solution of TCEP-HCl is prepared at 100 mM in DI H2O and adjusted to pH 7.0. For ELPs with a high cysteine content the stock solution of this reducing agent is added to the ELP pellet to reach 10 mM in H2O. |
| Ready Gel Tris-HCl gel, 4-20% linear gradient polyacrylamide gel, 10 well, 30 μl | Bio-Rad Laboratories | 161-1105 | These linear gradient gels offer good visualization of ELPs with a range of MWs. |
| Cupric chloride dihydrate (CuCl2·2H2O) | Fisher Scientific | C454-500 | A filtered 0.5 M solution is prepared for negative staining of Tris-HCl polyacrylamide gels. |
| Anotop 10 syringe filter: 0.02 μm 0.1 μm 0.2 μm |
Whatman | 6809-1002 6809-1012 6809-1022 |
These 10-mm diameter syringe filters allow preparation of small volumes for DLS measurements. |
| Millex-HV filter: 0.45 μm |
EMD Millipore | SLHVX13NK | These 13-mm diameter syringe filters allow preparation of small volumes of solutions with large nanoparticle assemblies for DLS measurements. |
References
- Urry, D. W. Physical Chemistry of Biological Free Energy Transduction As Demonstrated by Elastic Protein-Based Polymers. J. Phys. Chem. B. 101, 11007-11028 (1997).
- Sallach, R. E., Conticello, V. P., Chaikof, E. L. Expression of a recombinant elastin-like protein in pichia pastoris. Biotechnology progress. 25, 1810-1818 (2009).
- Schipperus, R., Teeuwen, R. L., Werten, M. W., Eggink, G., de Wolf, F. A. Secreted production of an elastin-like polypeptide by Pichia pastoris. Appl Microbiol Biotechnol. 85, 293-301 (2009).
- Schipperus, R., Eggink, G., de Wolf, F. A. Secretion of elastin-like polypeptides with different transition temperatures by Pichia pastoris. Biotechnology progress. 28, 242-247 (2012).
- Herzog, R. W., Singh, N. K., Urry, D. W., Daniell, H. Expression of a synthetic protein-based polymer (elastomer) gene in Aspergillus nidulans. Appl Microbiol Biotechnol. 47, 368-372 (1997).
- Conley, A. J., Joensuu, J. J., Jevnikar, A. M., Menassa, R., Brandle, J. E. Optimization of elastin-like polypeptide fusions for expression and purification of recombinant proteins in plants. Biotechnology and bioengineering. 103, 562-573 (2009).
- Conrad, U., et al. ELPylated anti-human TNF therapeutic single-domain antibodies for prevention of lethal septic shock. Plant biotechnology journal. 9, 22-31 (2011).
- Kaldis, A., et al. High-level production of human interleukin-10 fusions in tobacco cell suspension cultures. Plant biotechnology journal. 11, 535-545 (2013).
- Meyer, D. E., Chilkoti, A. Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system. Biomacromolecules. 3, 357-367 (2002).
- McDaniel, J. R., Mackay, J. A., Quiroz, F. G., Chilkoti, A. Recursive directional ligation by plasmid reconstruction allows rapid and seamless cloning of oligomeric genes. Biomacromolecules. 11, 944-952 (2010).
- Amiram, M., Quiroz, F. G., Callahan, D. J., Chilkoti, A. A highly parallel method for synthesizing DNA repeats enables the discovery of 'smart' protein polymers. Nat Mater. 10, 141-148 (2011).
- Meyer, D. E., Chilkoti, A. Quantification of the effects of chain length and concentration on the thermal behavior of elastin-like polypeptides. Biomacromolecules. 5, 846-851 (2004).
- Urry, D. W., et al. Temperature of Polypeptide Inverse Temperature Transition Depends on Mean Residue Hydrophobicity. Journal of the American Chemical Society. 113, 4346-4348 (1991).
- Urry, D. W. The change in Gibbs free energy for hydrophobic association - Derivation and evaluation by means of inverse temperature transitions. Chem Phys Lett. 399, 177-183 (2004).
- Cho, Y., et al. Effects of Hofmeister anions on the phase transition temperature of elastin-like polypeptides. The journal of physical chemistry. B. 112, 13765-13771 (2008).
- Kim, B., Chilkoti, A. Allosteric actuation of inverse phase transition of a stimulus-responsive fusion polypeptide by ligand binding. J Am Chem Soc. 130, 17867-17873 (2008).
- Hassouneh, W., Nunalee, M. L., Shelton, M. C., Chilkoti, A. Calcium binding peptide motifs from calmodulin confer divalent ion selectivity to elastin-like polypeptides. Biomacromolecules. 14, 2347-2353 (2013).
- Nettles, D. L., Chilkoti, A., Setton, L. A. Applications of elastin-like polypeptides in tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 62, 1479-1485 (2010).
- MacEwan, S. R., Chilkoti, A. Elastin-like polypeptides: biomedical applications of tunable biopolymers. Biopolymers. 94, 60-77 (2010).
- McDaniel, J. R., Callahan, D. J., Chilkoti, A. Drug delivery to solid tumors by elastin-like polypeptides. Adv Drug Deliv Rev. 62, 1456-1467 (2010).
- Hassouneh, W., Christensen, T., Chilkoti, A. Elastin-like polypeptides as a purification tag for recombinant proteins. Curr Protoc Protein Sci. , (2010).
- Shamji, M. F., et al. Development and characterization of a fusion protein between thermally responsive elastin-like polypeptide and interleukin-1 receptor antagonist: sustained release of a local antiinflammatory therapeutic. Arthritis Rheum. 56, 3650-3661 (2007).
- Hassouneh, W., et al. Unexpected multivalent display of proteins by temperature triggered self-assembly of elastin-like polypeptide block copolymers. Biomacromolecules. 13, 1598-1605 (2012).
- Lan, D. M., et al. An improved nonchromatographic method for the purification of recombinant proteins using elastin-like polypeptide-tagged proteases. Analytical Biochemistry. 415, 200-202 (2011).
- Bellucci, J. J., Amiram, M., Bhattacharyya, J., McCafferty, D., Chilkoti, A. Three-in-one chromatography-free purification, tag removal, and site-specific modification of recombinant fusion proteins using sortase A and elastin-like polypeptides. Angewandte Chemie. 52, 3703-3708 (2013).
- Compton, S. J., Jones, C. G. Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay. Anal Biochem. 151, 369-374 (1985).
- McPherson, D. T., Xu, J., Urry, D. W. Product purification by reversible phase transition following Escherichia coli expression of genes encoding up to 251 repeats of the elastomeric pentapeptide GVGVP. Protein expression and purification. 7, 51-57 (1996).
- Meyer, D. E., Chilkoti, A. Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides. Nat Biotechnol. 17, 1112-1115 (1999).
- McDaniel, J. R., et al. Self-assembly of thermally responsive nanoparticles of a genetically encoded peptide polymer by drug conjugation. Angewandte Chemie. 52, 1683-1687 (2013).
