Introduction
Человеческий голосовой складки, состоит из эпителиального слоя, собственная пластинка (LP) и Vocalis мышц, является специализированным мягких тканей, который преобразует поток воздуха из легких в акустических волн для звукоизвлечения. 1 голосовых складок регулярно колебаться при нормальной фонации, экспонирование штаммы до 30% на основных частотах в диапазоне от 100-300 Гц. 2 взрослых голосовой складки LP градиент структура состоит из поверхностного (SLP), промежуточный (ILP) и глубокий слой (DLP). Дальнейшие классификации групп эпителия и SLP как слизистой слоя, и сочетает в себе НРП и DLP в вокальной связки. 3 SLP слой содержит первую очередь аморфную матрицу с редко разбросанных коллагеновых волокон, в то время как связки обогащается зрелой волокон коллагена и эластина обеспечить достаточную прочность. 4 Структура и механика новорожденных голосовых складок значительно отличаться от своих зрелых коллег. Хотя механизмс регулирующими вокальный развитие раза и созревание еще не до конца понял, экспериментальные доказательства указывали на определяющих ролей вокализации, полученных механическим воздействиям.
Несколько медицинские условия, в том числе злоупотребления голоса, инфекций, химических раздражителей и хирургических процедур, может привести к повреждению голосовых связок. Вокальные расстройства раза повлиять оценкам 3-9% населения США. Современные методы лечения голосовых расстройств сгиба ограничены 5 и на основе клеток тканевой инженерии подход стволовых стала перспективной стратегии для восстановления голосовой функции раза. Мезенхимальные стволовые клетки (МСК), являются подходящей альтернативой первичных голосовых фибробластов сгиба для голосовой складки тканевой инженерии. 6-9 судьба стволовых клеток спецификация и развитие последующее ткани опосредованы конкретной нише они проживают в, из которых механическое состояние является жизненно важным фактором. 10 Механические силы являются важнейшими регуляторами тканевого морфогенеза ай гомеостаз, особенно для тканей, которые обычно подвергнутых Загрузка. 11 из ткани инженерной точки зрения, было показано, что воздействие физиологически соответствующие механические стимуляции способствует дифференциации клеток и тканей конкретной матрицы ремоделирование стволовых. 12-15
Культуры ткани биореакторы предназначены для имитации нужного физиологического среды для клеток или тканей роста в пробирке. Для голосовой складки тканевой инженерии, это особенно важно для воссоздания механическую среду из phonating голосовых складок. Идеальный вокал биореактор раз должны эффективно доставлять вибрационные сигналы, чтобы культуры клеток, позволяя поспешное контроль над частоты, амплитуды и длительности колебаний. Titze и его коллеги разработали вокальный биореактор раза (T1 биореактора) 16, который сочетает статического растяжения с высокой частотой (20-200 Гц) колебаний, чтобы стимулировать клеточное производство матричных протеинов. Усинг этот биореактор, Уэбб и его коллеги 17 изучали эффекты 10-дневных, 100-Гц колебаний на фибробластов кожи, культивируемых в гиалуроновой кислоты (HA) на основе гидрогеля. Конструкции подвергается вибрации выставлены повышенной экспрессии HA-2-синтазы (HAS2), Decorin, Фибромодулин и матриксной металлопротеиназы-1 (MMP1), относительно статических элементов управления. Стимулирующие эффекты оказались зависит от времени. Совсем недавно, наша группа 18 собрал вокальную биореактор раза (J1 биореактора) с использованием усилителя мощности, генератор функцию, закрытый громкий динамик и окружности-якорь силиконовую мембрану, которая передает колебательное воздух на прилагаемые клеток. Неонатальной крайней плоти фибробласты культивируемых в биореакторе J1 были подвергнуты 1 ч вибрации в 60, 110 или 300 Гц, с в плоскости деформации до 0,05%. Результаты КПЦР предположили, что экспрессия некоторых генов ECM был умеренно изменены в ответ на различных частотах колебательныхи амплитуды.
Эти биореакторы конструкции, в то время интригует, есть несколько ограничений. Например, система T1 требуется большое количество разъемов и баров для механического соединения, что ограничивает максимальные частоты достижимы. Кроме того, клетки могут быть подвергнуты нежелательному механического перемешивания и жидкости возмущения, что усложняет интерпретацию данных. J1 биореактор, с другой стороны, показывает относительно низкую эффективность преобразования энергии и не удобно. Кроме того, вибрация часто отделяет клеточные нагруженные конструкции из базового силиконовая мембрана. J2 голосовой складки биореактор сообщили здесь, разработаны на основе той же принципу, что и версии J1, оптимизирован для последовательности и воспроизводимости. Вибрации фонации имитирующие генерируются аэродинамически в индивидуально подобранной камер вибрационных где MSC населенных волокнистый поли (ε-капролактон) (PCL) леса являются effectivелы обеспечено. Лазерная доплеровская виброметрия (LDV) позволяет пользователю проверить вибрационный профиль мембрана / эшафот сборки. В нашей демонстрации, МСК подвергаются 200-Гц синусоидальной вибрации с (всего) модель 1-ч-на-1-ч-офф в общей сложности 12 час в день в течение 7 дней. Сотовые ответы на введенных вибрационных сигналов исследованы систематически. В целом, вокал раза J2 обеспечивает наиболее удобные функции, позволяя динамическое клеточных культур исследования, которые будут проводиться в высокой пропускной способности и воспроизводимым способом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Биореактор Ассамблея (видео 1)
- Сделать алюминиевую форму (кольцевую головку + прокладка контактный) с заранее определенными внутренними и внешними размерами (рис. 1).
- Используя формы, начиная с шага 1.1, сфабриковать силиконовая мембрана (диаметр: 42 мм, толщина: 1,5 мм, рисунок 1) с укоренившейся рукава (диаметр: 12 мм, толщина ~ 0,25 мм, сформированной разделительного штифта на рисунке 1) в средний использованием коммерчески доступного набора силиконовый эластомер.
- Сделайте пару акриловых блоков (рис. 2 (4, 5)) с круглым отверстием (диаметр: 24 мм) в середине, выгравировать на вершину (толщиной 1,8 см) и нижний (толщиной 0,9 см) блоки с соответствующими гребни и впадины 10.
- Бутерброд силиконовую мембрану между парными акриловых блоков. Закрепить с четырьмя угловыми винтами с помощью микро отвертку крутящего момента, установленный на постоянной силы (35 сН · м). В результате водонепроницаемый, 24 мм в ширину и 18 мм в глубину вибрации камеры создается (рис. 2С).
- Смонтировать "расширенный диапазон мини-сабвуфер 3 (рис. 2D, 8 Ω/20 W) под камеру вибрации через другой набор угловых винтов на нижней акриловой блока. В этот момент, индивидуальный модуль вибрации в собранном виде.
- Репликация семь дополнительных модулей вибрации. Прикрепите четыре из них к одному из двух стационарных алюминиевых шин (40 см х 10 см х 2,5 см), поместив основания колонок в равномерно расположенных круглых отверстий (диаметр 7 см, толщина 2 см) нарезать баров. Стабилизация каждую колонку путем вставки винта через сторону алюминиевой панели в каждом круговом отверстии.
- Индивидуально контролировать громкоговорители селектором динамика. Подключение отдельных колонок для селектора путем присоединения провода к положительной и отрицательной входов на корпусе акустической затем к соответствующим выходам на селекторе. Селектор динамик позволяет сигнал от тон функциональный генератор, после прохождения через усилитель мощности, чтобы достичь все восемь динамиков сразу (рис. 2Е).
- Поместите две камеры массивы, селектор громкоговорителей и электронику в корпус анти-влажности. Дом весь узел в коммерческом инкубаторе для клеточных культур.
- Поток основные кабели (через трубки из ПВХ медицинского назначения), соединяющий усилитель мощности и селектор громкоговорителей через узел фильтра на задней части инкубатора.
2. Леса Изготовление и характеристика
- Растворить PCL гранул в хлороформе при концентрации 15% мас. Загрузить раствора в 10 мл шприц колпачком с 21 г тупым концом иглы.
- Блокировка шприц на программируемой шприцевой насос и регулировка подачи со скоростью 1 мл / час.
- Поместите фольги, покрытой коллектор алюминия напротив иглы по горизонтали, с иглой кончик к коллектору расстоянии ~ 18 см.
- Зажмите положительный АЛАЙаллигатор клип к середине иглы, и первом крокодил к алюминиевому коллектора, затем установите напряжение на высоковольтного источника питания на 15 кВ. ВНИМАНИЕ: высокое напряжение, держать дистанцию от иглы.
- Последовательно включите шприцевой насос и блок питания; быстро чистым / удаления остаточного раствора полимера вокруг кончика иглы с помощью сухой бумажной салфеткой перед струй стабильной волокна и Тейлор конус 19 формируются.
- Разрешить волокна накапливаться на Al коллектора до толщины ~ 250-300 мкм (~ 7 час в текущих условиях прядильных). Сохраните этот строительные леса в вакуумном эксикаторе в течение 1-2 дней, чтобы удалить остатки растворителя.
- Изображение каркасы, напылением золотом, с помощью сканирующего электронного микроскопа, чтобы показать последовательное морфологии волокна. 10
3. Биореактор Ассамблея и характеристика
- Удар цилиндрический диск (диаметр 8 мм) с четырьмя руками (длина: 2мм) из формовани мата PCL (рис. 2А) по первым использованием 12 мм биопсии диаметр удар сократить внешний диаметр диска. Тогда используйте второй, 8 мм биопсии удар, чтобы сделать четыре 2 мм длиной выемки равномерно расположенных вокруг круглого лезвия забить, где руки должны быть сокращены. После забив с 8 мм удар, использовать лезвие скальпеля, чтобы сократить края руках наружу. Вставьте эшафот в паз силиконовой мембраны через вытянутыми руками (видео 1). Свести вставленный эшафот, слегка нажав на поверхность с помощью плоскую пинцет.
- Прикрепите небольшой кусочек тонкой алюминиевой фольгой (8 мм х 2 мм, ортогональной формы, рис. 2б) на эшафот PCL, чтобы помочь лазерный отражение.
- Закрепите собранный силиконовая мембрана / PCL эшафот (как указано в шаге 1.4) в камере вибрации. Добавить 1,5 мл воды в камере для того, чтобы гидратации каркас PCL до вибрации.
- Используя функцию генератора, ввести вибрации знаклов (например, 200 Гц синусоидальные волны с напряжением от пика до пика, пик-пик, 0,1 V) к зажатой акриловой камеры. С помощью вольтметра точно измерить напряжение на каждом входе громкоговорителя. Примечание: считывание Vpp от генератора функции будет отличаться от возможного напряжения подаваемого в динамик.
- Соберите в одной точке LDV и закрепите оптоволоконный лазерный датчик голову к наклонно-поворотное устройство штатив. Угол головку датчика так, чтобы он направлен перпендикулярно к поверхности стола. Подключите головку датчика LDV к модулю сбора данных по коаксиальному кабелю то модуль к ноутбуку через USB.
- Фокусировки лазерного луча перпендикулярно на различных заданных точках на силиконовой мембраной (рис. 2В и рис. 3).
- Использование программного обеспечения сбора данных, записывать смещение середины мембраны. Нажмите кнопку "Настройки приобретение» в меню «Параметры»; затем изменить режим измерения для "БПФ221;. Затем нажмите кнопку "Непрерывное измерение" в главной панели инструментов нажмите кнопку пик, который формирует на выбранной частоте (рис. 6D) для записи перемещений.
- Участок нормального среднего мембраны смещение (W 0) в зависимости от относительного положения через подложку. Построить 3D палитру профиля поверхности вибрационного помощью Origin программного обеспечения для анализа 8.5 данных.
4. Вибрационный Культура клеток
- Мозга, полученных МСК субкультуре человеческой кости в T150 колбу с тканевой культурой в начальной плотности посева 4000-5000 клеток / см 2 в MSC обслуживания средств массовой информации.
- После 7-8 дней культивирования клеток (до ~ 85% слияния), Trypsinize клеток с клеточной диссоциации реагента, такого как Accutase, подсчет с помощью гемоцитометра, центрифуги (440 х г в течение 5 мин), и повторно приостанавливать осадок клеток в свежий MSC обслуживание СМИ в концентрации 4,5 × 10 6 клеток / мл.
- Погрузите scaffo PCLсть в 70% этанола O / N. После выпаривания растворителя подвергать обе стороны помост к бактерицидной УФ-света (254 нм) в течение 5-8 мин.
- Замочите на эшафот PCL в 20 мкг / мл фибронектина раствора при 37 ° С в течение 1 часа. Вставьте фибронектина покрытием эшафот в силиконовой мембраны. Соберите биореактор о чем подробно говорится в пункте 1.
- Распределить 40 мкл клеточной суспензии равномерно на обеспеченного PCL эшафот. Разрешить клетки приложить для 1-1,5 часа перед добавлением еще 1,5 мл свежей среды в камеру вибрации.
- Культура MSC-Ладена PCL эшафот статически течение 3 дней и обновить средства массовой информации после завершения статической культуры.
- Наложите выбранные режимы вибрации для сотовых конструкций. Примечание: В качестве примера, клетки подвергаются 1-ч-на-1-ч-офф (всего) вибрации при 200 Гц с AW 0 из ~ 40 мкм в течение 12 часов в день на срок до 7 дней. Конструкции подвергаются вибрационных раздражений обозначены в качестве образцов Vib и тех Cultuкрасный статически в одинаковых камер вибрации служат статические элементы управления (Stat).
5. Биологические Оценки
- Сбор 200 мкл культуральной среды клеток из каждой камеры через день (день 1, 3, 5 и 7) и объединить аликвот из того же образца вместе (800 мкл каждого).
- Количественная сотовой производство матрицы металлопротеиназы-1 (ММР1) и ГК с использованием набора MMP1 ИФА развития и гиалуронана конкурентное комплект ELISA, соответственно, после процедуры производителей. Между тем, анализ производства растворимого предшественника эластина после ранее описанной методике ELISA. 8
- По завершении последнего цикла вибрации на 7-й день, быстро удалить клеточные конструкции от вибрации камеры с помощью пинцета и острые кратко промыть холодной фосфатным буферным раствором (PBS, 4 ° С).
- Для живой / мертвый окрашивания, инкубировать конструкции с пропидийиодидом (1:2000 в PBS) иСыто-13 (1:1000 в PBS) одновременно в течение 5 мин при комнатной температуре. Изображение окрашенные конструкции с многофотонный конфокальной микроскопии.
- Отдельно оснастки заморозить PBS-промыть сотовой конструкции на сухом льду и извлекать общее клеточной РНК следующий сообщалось ранее протокола для анализа генов. 9
- Проверьте количество и качество добытого РНК с помощью UV-VIS спектрофотометр. Образцы РНК с А260/А280 и A260/A230 отношений 1,8-2,2 используются для последующего анализа КПЦР.
- Обратный транскрибировать РНК (500 нг / образец) в кДНК с использованием коммерчески доступного обратный набор транскрипции.
- Выполните ПЦР в реальном масштабе времени системы обнаружения последовательность помощью имеющегося в продаже ПЦР мастер смеси после ранее подробно процедуры. 8
- Проанализируйте результаты КПЦР с помощью программного обеспечения коммерческой анализа данных КПЦР. Чтобы обеспечить надежность анализа данных, множество опорных генов (YWHAZ, ТВР, PPIA) используются в качестве междунарernal контроля, а дисперсия конкретных эффективности праймеров учитывается. 8
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В PCL каркасы, изготовленные электроформования содержать микронных размеров пор и интерстициальные случайно перепутанные волокна со средним диаметром 4,7 мкм (фиг.4А). На более высоком увеличении, наноразмерные канавки и поры открыты на отдельных волокон (рис. 4б). Покрытие из лесов с фибронектина улучшает гидрофильность и облегчает начальную адгезию клеток / распространения на эшафоте PCL (неопубликованные наблюдения).
Синусоидальных сигналов с требуемой частоты (F, 100-300 Гц) и напряжения (Vpp: 0-0.125 V) знакомятся с динамиком под каждой вибрации камеры, и воздух, заключенной между нижней части силиконовой мембраной и бумаги конуса мини-сабвуфер приводится в колебание. Колебание воздух поступает в строительных лесов PCL с или без клеток. LDV используется для анализа вибрационных характеристик на эшафот в данный ф и Vpp,учетом показателя преломления воды (1,33). 20 Рисунок 5 показывает нормальное смещение (W 0) в центре подмостей PCL в зависимости от Vpp и е. Частоты вибрации выбираются так, чтобы отразить основные частоты человека выступлений. 21 Существует линейная зависимость между ж 0 и Vpp в диапазоне 0-0.125 V для всех частот испытания. При данной Vpp, W 0 уменьшается с е увеличивается от 100 до 300 Гц.
Конкретный состояние вибрации (F = 200 Гц, Vpp = 0,1 В) выбран для дальнейшего анализа. Профиль скорости в зависимости от времени (фиг.6А) показывает, что синусоидальный сигнал вводится на громкоговоритель захватывается PCL строительные леса, с высокой точностью. В центре PCL строительных лесов колеблется в продольном направлении с пиковой скоростью 52 мм / сек, максимальное ускорение 66 м / 2 (~ 6,7 г) инормальное перемещение ~ 40 мкм. Гармонические сигналы на 100, 300, 400 и 500 Гц, по крайней мере на порядок ниже, чем на основной частоте (200 Гц). Тем не менее, если значение Vpp слишком высока (0,15 В), несколько гармонических пики сопоставимой интенсивности на основной частоте обнаруживаются (рис. 7). Профиль вибрации через эшафот создается путем мониторинга нормальный сдвиг в общей сложности от 73 репрезентативных точках на радиальных направлениях поверхности PCL (рис. 3). 3D карта цветов (рис. 8) показывает, что вибрация обнаружены на поверхности мембраны осесимметричной относительно центра и его отдыхая позиции. Нормальное перемещение оказывается монотонно уменьшаются от центра к краю, где мембрана закрепляется.
МСК культивировали на PCL каркасов культивируют в выбранных условий вибрации. Клетки, подвергшиеся 7-дау стимуляции поддерживать подобные жизнеспособность и пролиферацию свойствами, что и статических элементов управления (рис. 9), подтверждая, что волокнистые леса были cytocompatible и вибрация применяется не привело к потере жизнеспособности. Сотовые ответы на вибрационных раздражений рассматриваются на уровне мРНК в плане выражения основных вокальных раза ECM белков, таких как эластин (ELN), гиалуроновая кислота синтазы-1 (HAS1), COL3A1 и MMP1 (рис. 10). Вибрации приводит к увеличению в 2,3 раза в выражении ЭЛН на 7-й день, по отношению к статических элементов управления. Вибрационного раздражения также увеличилось COL3A1 выражение умеренно. Следует отметить, что выражение основных ECM ремоделирования ферментов, has1 и ММР1, значительно увеличена сигналов вибрации. В частности, динамический лечение привело к кратному увеличению ~ 1.7 и ~ 16,3 для has1 и ММР1 Выражение (оба р <0,05), соответственно, на их статических элементов управления на 7 день. В целом, индуктивный эффект колебаний на has1 и ММР1 была увеличена от 3-й день до 7 дн.
Для дальнейшего обоснования результаты КПЦР, сотовый производство HA, растворимого эластина и ММР1 можно измерить с помощью ELISA на уровне трансляции (рис. 11). Динамически культивируемые клетки производят 4,2 ± 0,1 мкг / мг (за сухой массы лесов) растворимого эластина после 7 дней колебаний, в то время как статические элементы управления только накапливаются 2,7 ± 0,2 мкг / мг) эластина. В среднем, 7-дневный колебаний привести к 2.2-и увеличение 4,7-кратным в ГК и ММР1 секреции, относительно соответствующих статических элементов управления.
Видео 1: 3D моделирование, показывающий сборку J2 биореакторе. Видео было создано Autodesk 3ds Max Design (любезность Congfei Се).
"FO: держать-together.within-страницу =" всегда ">
. Рисунок 1 фотография, иллюстрирующая измерение формы Аль используемого для изготовления силиконовой мембраны с укоренившейся рукав Ø:. Диаметр, г: толщина / глубина, ч:. Высота Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
.. Рисунок 2 показана блок-схема биореактора в сборе (A) фотография из четырех рычагов формы PCL строительных лесов; (B) фотографию, показывающую каркас, прикрепленный PCL в камере вибрации и виброметра лазера сосредоточено на дне камеры; ( С) сечениедр. вид камеры вибрации. 1: PCL леса (красный); 2: силиконовая мембрана (голубой); 3: Аль стационарный бар; 4: верхняя акрил блок; 5: нижняя акрил блок; 6: мини-сабвуфер, (D) вид сбоку модуля вибрации; (Е) фотографию, показывающую всю сборку. Эта цифра была изменена с Тонг и др.. 10 Copyright 2013, Mary Ann Liebert, Inc Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Иллюстрация радиально отмечены силиконовой мембраны для измерений LDV одной точке. Эта цифра была изменена с Тонг и др.. 10 Copyright 2013, Mary Ann Liebert, Inc
Рисунок 4. СЭМ изображения PCL лесов при разных увеличениях. (A) 600X, (B) 7000 X. Эта цифра была изменена с Тонг и др.. 10 Copyright 2013, Mary Ann Liebert, Inc Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. Нормальное перемещение в центре силиконовой мембраной (W 0) в зависимости от приложенного частоты (100, 200 и 300 Гц) и напряжения возбуждения (Vpp = 0-0.125 V). Эта цифра была изменена от Тонг и др.. 10 Copyright 2013, MA ры Энн Liebert, Inc
Рисунок 6. Вибрационные характеристики, обнаруженные в центре силиконовой мембраной с F = 200 Гц и профильной Vpp = 0.1 В. (A) скорость как функцию времени. (B) Профиль скорости в зависимости от частоты. (C) Ускорение в зависимости от частоты. (D) Нормальное водоизмещение (W 0) как функцию частоты. Эта цифра была изменена с Тонг и др.. 10. Copyright 2013, Mary Ann Liebert, Inc Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
/ 51594fig7highres.jpg "/>
На рисунке 7. Нормальный Смещение, обнаруженное в центре мембраны (W 0) в зависимости от частоты при 200 Гц, синусоидальная волна вводится в мини-НЧ при Vpp = 0,15 В.
Рисунок 8. 3D палитру построен поверхности Gridding использованием данных нормального перемещения, собранные из всех местах отмечены на эшафоте PCL. Эта цифра была изменена с Тонг и др.. 10 Copyright 2013, Mary Ann Liebert, Inc
Рисунок 9. Жизнеспособность клеток, визуализируется живой / мертвый окрашивания, после 7 дней колебаний. Эта цифра была изменена с Тонг ет др.. 10 Copyright 2013, Mary Ann Liebert, Inc Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 10. Сотовые ответов на вибрационных стимуляции точки зрения выражения голосовой складки актуальны, генов ECM. Выражение относительно гена (Сменить) нормирована на соответствующих статических элементов управления на 3-й день и 7-й день (пунктирная базового). **: Значимое различие (р <0,05) между 3-й день и 7, #: значительно изменились (р <0,05) по сравнению с базовым уровнем. Данные представляют среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM, п = 4). Т-тест двухсторонний студента используется для статистического анализа, с р <0,05 рассматривается как значительно диfference (то же ниже). Эта цифра была изменена с Тонг и соавт. 10 Copyright 2013, Mary Ann Liebert, Inc
Рисунок 11. Биохимические количественное определение ГК (A), растворимый НОА (B) и MMP1 (C) получают путем МСК культивируемых на помост под PCL Stat и Vib условиях в течение 7 дней. Общее количество молекул ECM в сухой массе лесов (мг) представляется как среднее ± SEM, п = 4 из представительского суда #:. значительно (р <0,05) по сравнению с контрольной Stat. Эта цифра была изменена с Тонг и соавт. 10 Copyright 2013, Mary Ann Liebert, Inc
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Успешное проектирование функциональных вокальных тканей сгиба в пробирке требуется воссоздание вокального раза, как микросреды стать посредником за поведением мультипотентными клеток. Принято считать, что ткани или органа структуры отражают функции, которые они должны выполнять. 22 Для вокальных тканей сгиба, высокие частоты вибрации, возникающие во время фонации предлагается иметь важное значение для ткани созревания. В нашем исследовании PCL каркасы используются, чтобы обеспечить структурную поддержку связок, как в то время как вокала биореактор раз предназначен для представления физиологически соответствующие механические сигналы в культивированных МСК. Биореактор описано здесь (J2) создает вибрацию электромагнитно через отдельные громкоговорители и передает энергию к аэродинамически культивируемых клеток. По сравнению с нашей предыдущей конструкции, 18 нынешняя система перемещает источник колебательной стимуляции непосредственно под каждого образца также, позволяя FOра более эффективное преобразование энергии. В результате значительно больше, нормальное перемещение и выше ускорение достигаются с помощью существующей системы. Модульная конструкция также минимизирует колебания системы и механической возмущение в различных камерах вибрации.
Наш дизайн опирается на силиконовой мембраны для доставки сигналов вибрации. Поэтому очень важно, чтобы сохранить целостность мембраны и однородность. После того, как раствор предшественника выливают в алюминиевую форму, желательно, чтобы удалить избыток жидкости путем перетаскивания предметное стекло по всей поверхности формы. Последовательные мембраны без каких-либо захваченных пузырьков воздуха, может быть получено путем снижения температуры отверждения при увеличении времени отверждения. Кроме того, 70%-ный раствор этанола можно использовать для временного набухать мембраны на границе алюминия, чтобы позволить легкое удаление отвержденного силикона. Чтобы разместить клеточные конструкции для 3D динамической культуры, центрально расположенный тонкой канавки яы формуют в силиконовой мембраной, таким образом, чтобы PCL каркасы могут быть периферии закрепленной в камере вибрации. Геометрия канавки можно регулировать; Таким образом, форма сотовой конструкции может быть настроен соответствующим образом, чтобы лучше имитировать геометрию нативных голосовых связок. 23 Если леса PCL не плотно закреплены в силиконовой мембраной, то LDV сигналы, обнаруженные в PCL и на внешней области на силикона Мембрана не будут пересекаться отлично. При сборке биореактор, очень важно, чтобы все компоненты затягивают и плотно в той же степени, чтобы избежать нежелательных движений и свести к минимуму камеру к изменениям камеры.
Для проверки полезность биореактора, МСК культивируют на PCL лесов и подвергаются прерывистый (OF) колебаний в течение 7 дней. Колебаний более в течение нескольких часов в день работают, чтобы воспроизвести говорящих условия активных пользователей голосовых, например, профессиональный петь ERS и учителей. 23 В отличие от ранее представленных вокальных биореакторах сгиба, наш не вызывают вредного воздействия или физиологического травму клеток.
Вибрации 200-Гц оказываются дифференциально регулируют клеточный производство важных компонентов ECM. Эластин является одним из важнейших структурный белок, который встречается по всей голосовой складки LP, и придает упругость и эластичность. 24 Промежуточные аморфные компоненты, такие как ГК, способствовать поддержанию надлежащего вязкоупругости ткани и предотвращения образования рубцов. 25,26 МСК подвергаться к 7-день лечения производят значительно большее количество эластина, чем статически культивированных коллегами. HA биосинтез также чувствителен к колебаниям, что подтверждается результатами КПЦР на has1 и ELISA результатов по ГК. Эти данные позволяют предположить, что колебательная стимуляция включена по биореактора способствует производству анти-рубцов молекул.
jove_content "> Сбалансированный оборот ECM полагается по совместительству осаждения и деградации матрицы. 27 Тип III коллаген является основным ретикулярная коллагеновых волокон найти в голосовых складок, обеспечивая ткани со свойствами несущих. 28 7-дневного колебания, применяемые в настоящем документе повышения экспрессии генов из COL3A1, но в гораздо меньшей величины, чем у эластина. Таким образом, прикладные вибрации дифференциально регулировать клеточные механизмы, участвующих в синтезе коллагена III и эластина. Интересно, MMP1, одним из основных ММР, вовлеченных в деградацию матрикса и ремоделировании ткани 27 , очень чувствительна к вибрационных сигналов. Эти результаты хорошо согласуются с предыдущими докладами на вибрационной ММР1 повышающей клетками захваченных в матрице HA. 29 В целом, вибрационные раздражения, генерируемые вокального биореакторе раза глубоко посредником функции MSC путем содействия гомеостаза из вокальные раз-как матрицы.Надвсе, роман голосовой складки биореактор, представленные здесь, модульной и удобным для пользователей, позволяя динамическое культуры клеток должны быть выполнены воспроизводимым способом. Тем не менее, существуют некоторые ограничения в текущем дизайне. Во-первых, амплитуда колебаний, хотя и улучшилось от версии J1, все еще малы по сравнению с голосовой складки ткани. Во-вторых, наш биореактор не имитировать двусторонний столкновение голосовых складок при нормальной фонации. В-третьих, наша волокнистый каркас PCL не отражает ткани анизотропию. Будущая работа направлена на улучшение дизайна, чтобы лучше имитировать родные условия фонации. Между тем, оптимальные режимы для 3D динамичной культуры будут изучены для успешного функционального вокальной сборки раза в пробирке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Не существует конкурирующие между собой финансовые интересы.
Acknowledgments
Мы благодарим доктора Джеффри Каплан за его обучение и консультации по конфокальной микроскопии. Мы также благодарим Keck электронной микроскопии Lab и доктора Chaoying Ni для SEM помощи. Эта работа финансируется Национальными Институтами Здоровья (NIDCD, R01DC008965 и R01DC011377). АБЗ признает NSF интегративной последипломного образования & Research Тренинги программы (IGERT) для финансирования.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicone elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 184 | Cure the membrane at 100 °C for 2 hr |
| PCL | Sigma Aldrich | 440744-500G | Mn ~80 kDa, dissolve O/N |
| Chloroform | Sigma Aldrich | C7559-5VL | |
| Human bone marrow-derived MSCs | Lonza | PT-2501 | Received with passage 2 |
| MSC maintenance media | Lonza | PT-3001 | 10% FBS in basal media supplemented with L-glutamine, gentamicin and amphotericin |
| Accutase cell dissociation reagent | Life Technologies | A11105-01 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500ML | |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F2006-1MG | |
| MMP1 DuoSet ELISA kit | R&D systems | DY901 | |
| HA ELISA kit | Echelon Biosciences | K-1200 | |
| PBS | Life Technologies | 14190-136 | |
| Propidium iodide | Life Technologies | P1304MP | |
| Syto-13 | Life Technologies | S7575 | |
| QuantiTect reverse transcription kit | Qiagen | 205311 | |
| SYBR Green PCR master mix | Life Technologies | 4309155 | |
| Replacement speaker | DAYTON audio (via Parts Express) |
DS90-8 | Paper cone, full range (80-13,000 Hz), 85 dB |
| Ergo Micro torque screwdriver | Mountz | # 020377 | Torque range: 20-120 cN·m |
| Stereo speaker selector | RadioShack | 40-244 | Maximum power handling 50 W |
| Function generator | Agilent | 33220A | Frequency range 1 µHz-20 MHz |
| Power amplifier | PYLE audio | PylePro PT2400 | Frequency response: 10 Hz-50 kHz, two speaker channels |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher | Steri-Cult 3307 | |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| High voltage power supply | Spellman | CZE 1000R | Output voltage: 0-30 kV |
| Scanning electron microscope | JEOL-USA | JSM-7400F | |
| Desk gold sputter coater | Denton Vacuum | DSK00V-0013 | |
| Doppler laser vibrometer | Polytec | PDV-100 | Non-contact velocity measurement (0-22 kHz) |
| PCR sequence detection system | Applied Biosystems | ABI7300 | |
| Multiphoton confocal microscope | Zeiss | Zeiss 510Meta NLO | |
| UV-VIS Spectrophotometer | NanoDrop Products via Thermo Scientific |
ND-2000 | |
| VibSoft Data Acquisition Software | Polytec | Acquisition bandwidth up to 40 MHz | |
| Origin 8.5 data analysis software | OriginLab | ||
| qbasePlus qPCR data analysis software | Biogazelle | V2.3 | |
| Aluminium alloy | McMaster-Carr | Alloy 6061 | |
| Acrylic blocks | McMaster-Carr | ||
| Polycarbonate anti-humidity chamber | McMaster-Carr | Impact-Resistant Polycarbonate | |
| screws | McMaster-Carr | ||
| Electronic cable/wire | |||
| Medical grade PVC tubing | US Plastic Corp. | Tygon S-50-HL | Clear, biocompatible |
| 10 ml Syringe | Becton Dickinson | 309604 | |
| 21 G Blunt ended needle | Small Parts | NE-213PL-25 | 1-1/2" length |
| Alligator clip adapters | RadioShack | 270-354 | Fully insulated |
| 8 mm Biopsy punch | Sklar Surgical Instruments | 96-1152 | Sterile, disposable |
| 12 mm Biopsy punch | Acuderm (via Fisher Scientific) | NC9998681 | |
| Tissue culture flasks | Corning | Cell culture treated |
References
- Titze, I. R.
- Titze, I. R. On the Relation Between Subglottal Pressure and Fundamental-Frequency in Phonation. J. Acoust. Soc. Am. 85, 901-906 (1989).
- Gray, S. D.
- Thibeault, S. L., Gray, S. D., Bless, D. M., Chan, R. W., Ford, C. N. Histologic and rheologic characterization of vocal fold scarring. J. Voice. 16, 96-104 (2002).
- Hansen, J. K., Thibeault, S. L. Current understanding and review of the literature: Vocal fold scarring. J. Voice. 20, 110-120 (2006).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284, 143-147 (1999).
- Hanson, S. E., et al. Characterization of Mesenchymal Stem Cells From Human Vocal Fold Fibroblasts. Laryngoscope. 120, 546-551 (2010).
- Tong, Z., Duncan, R. L., Jia, X. Modulating the behaviors of mesenchymal stem cells via the combination of high-frequency vibratory stimulations and fibrous scaffolds. Tissue Eng. Part A. 19, 1862-1878 (2013).
- Tong, Z., Sant, S., Khademhosseini, A., Jia, X. Controlling the Fibroblastic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells Via the Combination of Fibrous Scaffolds and Connective Tissue Growth Factor. Tissue Eng. Part A. 17, 2773-2785 (2011).
- Jones, D. L., Wagers, A. J. No place like home: anatomy and function of the stem cell niche. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, DOI. 11-21 (1038).
- Wang, J. H., Thampatty, B. P. Mechanobiology of Adult and Stem Cells. Int. Rev. of Cell Mol. Biol. 271, 301-346 (2008).
- Doroski, D. M., Levenston, M. E., Temenoff, J. S. Cyclic tensile culture promotes fibroblastic differentiation of marrow stromal cells encapsulated in poly (ethylene glycol)-based hydrogels. Tissue Eng. Part A. 16, 3457-3466 (2010).
- Kim, B. S., Nikolovski, J., Bonadio, J., Mooney, D. J. Cyclic mechanical strain regulates the development of engineered smooth muscle tissue. Nat. Biotechnol. 17, 979-983 (1999).
- Webb, K., et al. Cyclic strain increases fibroblast proliferation, matrix accumulation, and elastic modulus of fibroblast-seeded polyurethane constructs. J. Biomech. 39, 1136-1144 (2006).
- Kim, Y. J., Sah, R. L. Y., Grodzinsky, A. J., Plaas, A. H. K., Sandy, J. D. Mechanical Regulation of Cartilage Biosynthetic Behavior - Physical Stimuli. Arch. Biochem. Biophys. 311, 1-12 (1994).
- Titze, I. R., et al. Design and validation of a bioreactor for engineering vocal fold tissues under combined tensile and vibrational stresses. J. Biomech. 37, 1521-1529 (2004).
- Kutty, J. K., Webb, K. Vibration stimulates vocal mucosa-like matrix expression by hydrogel-encapsulated fibroblasts. J. Tissue Eng. Regen. Med. 4, 62-72 (2010).
- Farran, A. J. E., et al. Design and Characterization of a Dynamic Vibrational Culture System. J. Tissue Eng. Regen. Med. , (2011).
- Reneker, D. H., Yarin, A. L. Electrospinning jets and polymer nanofibers. Polymer. 49, 2387-2425 (2008).
- Wang, Y., Theobald, P., Tyrer, J., Lepper, P. The application of scanning vibrometer in mapping ultrasound fields. J. Phys.: Conf. Ser. 1, 167-173 (2004).
- Brown, W. S., Morris, R. J., Hollien, H., Howell, E. Speaking Fundamental-Frequency Characteristics as a Function of Age and Professional. J. Voice. 5, 310-315 (1991).
- Ingber, D. E. Cellular mechanotransduction: putting all the pieces together again. Faseb J. 20, 811-827 (2006).
- Titze, I. R., et al. Design and validation of a bioreactor for engineering vocal fold tissues under combined tensile and vibrational stresses. J. Biomech. 37, 1521-1529 (2004).
- Moore, J., Thibeault, S. Insights Into the Role of Elastin in Vocal Fold Health and Disease. J. Voice. 26, 269-275 (2012).
- Thibeault, S. L., Bless, D. M., Gray, S. D. Interstitial protein alterations in rabbit vocal fold with scar. J. Voice. 17, 377-383 (2003).
- Branski, R. C., Verdolini, K., Sandulache, V., Rosen, C. A., Hebda, P. A. Vocal fold wound healing: A review for clinicians. J. Voice. 20, 432-442 (2006).
- Clark, I. A., Swingler, T. E., Sampieri, C. L., Edwards, D. R. The regulation of matrix metalloproteinases and their inhibitors. Int. J. Biochem. Cell B. 40, 1362-1378 (2008).
- Silver, F. H., Horvath, I., Foran, D. J. Viscoelasticity of the vessel wall: The role of collagen and elastic fibers. Crit. Rev. Biomed. Eng. 29, 279-301 (2001).
- Kutty, J. K., Webb, K. Tissue Engineering Therapies for the Vocal Fold Lamina Propria. Tissue Eng. Part B: Rev. 15, 249-262 (2009).
