Introduction
De menselijke stembanden, samengesteld uit een epitheellaag, de lamina propria (LP) en de vocalis spier, is een gespecialiseerde zacht weefsel dat de luchtstroom uit de longen in akoestische golven voor verantwoorde productie zet. 1 stemplooien regelmatig oscilleren tijdens normaal phonation, vertonen stammen tot 30% op fundamentele frequenties variërend 100-300 Hz. 2 Volwassen stemplooien LP is een gradiënt structuur bestaande uit een oppervlakkige (SLP), tussenproduct (ILP) en diep (DLP) laag. Verdere indeling groepen het epitheel en de SLP als het slijmvlies laag, en combineert de ILP en DLP in de vocale ligament. 3 De SLP laag bevat voornamelijk een amorfe matrix met spaarzaam verspreid collagene vezels, terwijl het ligament is verrijkt met volwassen collageen en elastine vezels om voldoende stevigheid te bieden. 4 De structuur en de mechanica van pasgeboren stemplooien aanzienlijk afwijkt van de volwassen tegenhangers. Hoewel mechanismes reguleren stemplooi ontwikkeling en rijping zijn nog niet volledig begrepen, experimenteel bewijs heeft gewezen op de bepalende rol van-vocalization afgeleide mechanische belasting.
Verschillende medische aandoeningen, waaronder spraak-misbruik, infecties, irriterende stoffen en chirurgische ingrepen, kan de stemplooien beschadigen. Stemplooi aandoeningen invloed schatting 3-9% van de Amerikaanse bevolking. Huidige behandelmethoden voor de stemplooien aandoeningen zijn beperkt 5 en een op basis van stamcellen tissue engineering aanpak heeft ontpopt als een veelbelovende strategie voor het herstel van de stemplooien functie. Mesenchymale stamcellen (MSC's) zijn een geschikt alternatief voor de primaire stemplooien fibroblasten voor stemplooien tissue engineering. 6-9 Stamcel lot specificatie en daaropvolgende weefselontwikkeling worden gemedieerd door specifieke niche zij verblijven, waarvan de mechanische staat is een cruciale factor. 10 Mechanische krachten zijn essentieel regulatoren van weefsel morfogenese eennd homeostase, in het bijzonder voor weefsels die routinematig worden onderworpen aan belasting. 11 Vanuit tissue engineering perspectief is aangetoond dat blootstelling aan fysiologisch relevante mechanische stimulatie bevordert stamcel differentiatie en weefsel-specifieke matrix remodeling. 12-15
Weefselkweek bioreactoren zijn ontworpen om simuleren de gewenste fysiologische omgeving voor cel of weefselgroei in vitro. Voor stemplooien weefselengineering is het vooral van belang om de mechanische omgeving van de phonating stemplooien opnieuw. Een ideale stemplooi bioreactor moet daadwerkelijk te leveren vibrerende signalen tot cultuur cellen, waardoor facile controle over de frequentie, amplitude en de duur van de trillingen. Titze en collega's bedachten een stemplooi bioreactor (T1 bioreactor) 16 dat statisch rekken combineert met een hoge frequentie (20-200 Hz) oscillaties aan de cellulaire productie van matrix eiwitten stimuleren. UsinG Dit bioreactor, Webb en collega 17 onderzocht de effecten van 10 dagen, 100 Hz trillingen aan dermale fibroblasten gekweekt in een hyaluronzuur (HA)-gebaseerde hydrogel. Constructen blootgesteld aan trillingen vertoonde een verhoogde expressie van HA-synthase 2 (HAS2), decorine, fibromodulin en matrix metalloproteinase-1 (MMP1), ten opzichte van de statische controles. De stimulerende effecten bleken tijdsafhankelijk zijn. Meer recent, onze groep 18 verzamelde een stemplooi bioreactor (J1 bioreactor) met behulp van een eindversterker, een functie generator, een gesloten luidspreker en een omtrek verankerd siliconen membraan dat de oscillerende lucht overdraagt aan de bijgevoegde cellen. Neonatale voorhuid fibroblasten gekweekt in de bioreactor J1 werden onderworpen aan 1 uur van trillingen op 60, 110 of 300 Hz, met een in-plane stam tot 0,05%. De qPCR resultaten suggereerden dat de expressie van bepaalde genen ECM matig werd veranderd in reactie op de verschillende trillingsfrequentiesen amplitudes.
Deze bioreactor ontwerpen, terwijl intrigerende, hebben een aantal beperkingen. Bijvoorbeeld, de T1 systeem vereist een groot aantal aansluitingen en bars mechanische koppeling, waardoor het maximale haalbare frequenties. Bovendien kunnen cellen worden blootgesteld aan ongewenste mechanische agitatie en vocht verstoring die de interpretatie van gegevens bemoeilijken. De J1 bioreactor, daarentegen, vertoont relatief weinig energie conversie-efficiëntie en is niet gebruiksvriendelijk. Bovendien trillingen los vaak het cel-beladen constructen van de onderliggende silicone membraan. De J2 stemplooien bioreactor hier vermeld, ontworpen op basis van hetzelfde principe als J1 uitvoering is geoptimaliseerd voor consistentie en reproduceerbaarheid. De-phonation nabootsen trillingen worden aerodynamisch opgewekt in individueel ingerichte kamers trillingen waar MSC-bevolkte vezelachtige poly (ε-caprolacton) (PCL) steigers zijn effectively beveiligd. Laser Doppler vibratiemeting (LDV) kan de gebruiker de vibratie profiel van het membraan / steiger montage verifiëren. In onze demonstratie worden MSCs blootgesteld aan 200 Hz sinusvormige trillingen met 1-h-1-on-HR-uit (OF) patroon voor een totaal van 12 uur per dag gedurende 7 dagen. Cellulaire reacties op de opgelegde trillingen signalen worden systematisch onderzocht. Over het algemeen, de J2 stemplooi biedt de meest gebruiksvriendelijke functies, waardoor dynamische celkweek studies te worden uitgevoerd in een high throughput en reproduceerbare manier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bioreactor Montage 1. (Video 1)
- Maak een aluminium mal (circulaire sterven + spacer pin) met vooraf bepaalde innerlijke en uiterlijke dimensies (figuur 1).
- Met behulp van de mal uit stap 1.1, fabriceren een siliconen membraan (diameter: 42 mm, dikte: 1,5 mm, figuur 1) met een stevig verankerde huls (diameter: 12 mm, dikte ~ 0.25 mm, gevormd door de spacer pin in figuur 1) in het midden met behulp van een commercieel verkrijgbare siliconen elastomeer kit.
- Maak een paar acrylblokken (Figuur 2 (4, 5)) met een ronde opening (diameter: 24 mm) in het midden, graveren de top (1,8 cm dik) en bodem (0,9 cm dik) blokken met bijpassende ribbels en groeven . 10
- Sandwich de siliconen membraan tussen de gepaarde acrylblokken. Zeker de montage met vier schroeven op de hoeken met behulp van een micro koppel schroevendraaier ingesteld op een constante kracht (35 cN · m). Als resultaat werd een waterdichte, 24 mm breed en 18 mm diep trillingen kamer wordt gemaakt (figuur 2C).
- Monteer een 3 "extended range mini-woofer (figuur 2D, 8 Ω/20 W) onder de trillingen kamer door een andere set van schroeven op de hoeken aan de onderkant acryl blok. Op dit punt wordt een individuele vibratiemodule geassembleerd.
- Repliceren zeven extra trillingen modules. Bevestig vier van hen aan een van twee vaste aluminium staven (40 cm x 10 cm x 2,5 cm) door het plaatsen van de spreker basen gelijkmatig ronde gaten (diameter 7 cm, dikte: 2 cm) gesneden in de staven. Stabiliseren elke luidspreker door het invoegen van een schroef door de zijkant van de aluminium staaf in elk rond gat.
- Afzonderlijk regelen de luidsprekers door een spreker selector. Verbinding afzonderlijke luidsprekers aan de selector door het aanbrengen van draden aan de positieve en negatieve ingangen van de luidspreker lichaam dan de overeenkomstige uitgangen van de selector. De luidspreker selector laat het signaal van tHij functie generator, na het passeren van een eindversterker, om alle acht luidsprekers te bereiken in een keer (figuur 2E).
- Plaats de twee kamers arrays kerkeuze en bijbehorende elektronica in een anti-vochtigheid behuizing. Huis het gehele samenstel in een commerciële celkweek incubator.
- Voed de belangrijkste kabels (door middel van een medische kwaliteit PVC-buis) de eindversterker en luidspreker selector verbinding via het filter aan de achterkant van de incubator.
2. Steiger fabricage en karakterisering
- Los PCL pellets in chloroform bij een concentratie van 15 gew%. Laad de oplossing in een 10 ml spuit afgedekt met een 21 G stompe naald.
- Vergrendelen de spuit op een programmeerbare spuit pomp aan en zet het debiet bij 1 ml / uur.
- Plaats de aluminium-folie bedekt collector tegenover de naald horizontaal, met een naald-naar-verzamelaar afstand van ~ 18 cm.
- Klem de positieve alligator clip naar het midden van de naald, en de grond krokodillenklem aan de aluminium collector en stel de spanning op de hoogspanningsvoeding bij 15 kV. LET OP: hoogspanning, houd afstand van de naald.
- Opeenvolgend zet de spuit pomp en voeding; snel te reinigen / verwijderen van de resterende polymeer oplossing rond de punt van de naald met een droge papieren handdoek voordat stabiele vezels jets en Taylor kegel 19 worden gevormd.
- De vezels ophopen op de Al collector tot een dikte van ~ 250-300 micrometer (~ 7 uur onder de huidige spinomstandigheden). Bewaar de verkregen steigers in een vacuüm exsiccator gedurende 1-2 dagen om resten oplosmiddel te verwijderen.
- Beeld de steigers, sputteren met goud bekleed, met behulp van een Scanning Electron Microscope vaste vezel morfologie vertonen. 10
Bioreactor Montage en karakterisering 3.
- Punch een cilindrische schijf (diameter: 8 mm) met vier armen (lengte: 2mm) van de as-spun PCL mat (Figuur 2A) door eerst een 12 mm biopsie punch aan de buitendiameter van de schijf afgesneden. Maak dan gebruik van een tweede, 8 mm biopsie punch tot vier 2 mm lang inkepingen gelijkmatig verdeeld, over de ronde mes te scoren waar de armen te snijden te maken. Na het maken van de 8 mm punch, gebruik een scalpel om de randen van de armen naar buiten snijden. Plaats de steiger in de groef van de siliconen membraan via de verlengde armen (Video 1). Vlak de ingevoegde steiger door zachtjes te drukken op het oppervlak met behulp van platte pincet.
- Bevestig een klein stukje van de dunne Al folie (8 mm x 2 mm, orthogonale vorm, Figuur 2B) aan de PCL schavot te laserreflectie helpen.
- Bevestig de geassembleerde siliconen membraan / PCL steiger (zoals beschreven in stap 1.4) in de vibratie kamer. Voeg 1,5 ml water in de kamer om de PCL schavot hydrateren voor trillingen.
- Met behulp van de functie generator, introduceren trillingen tekenALS (bijv. 200 Hz sinusgolven met een piek-piekspanning, Vpp, 0,1 V) aan de gesandwiched acryl kamer. Gebruik een voltmeter om de spanning op elke luidspreker ingang nauwkeurig te meten. Let op: de Vpp van de functie generator zal verschillen van de uiteindelijke spanning geleverd aan de luidspreker.
- Monteer de single-point LDV en bevestig de sensor fiber-optische laser om een pan-tilt hoofd statief. Richt de sensorkop zodat deze wijst loodrecht op het tafelblad. Sluit de LDV sensor hoofd naar de data-acquisitie module via coax-kabel vervolgens de module aan de laptop via USB.
- De laserbundel loodrecht op verschillende vooraf bepaalde punten op de siliconen membraan (Figuur 2B en figuur 3).
- Met behulp van de data-acquisitie software, neem dan de mid-membraan verplaatsing. Klik op "Verwerving Instellingen" in het menu "Opties"; verander dan de meting modus "FFT221;. Klik vervolgens op de "continue meting" in de hoofdwerkbalk en klik vervolgens op de piek die zich vormt bij de gekozen frequentie (Figuur 6D) om verplaatsing te nemen.
- Plot de normale mid-membraan verplaatsing (w0) als functie van de relatieve positie op het substraat. De bouw van een 3D kleurenkaart van het oppervlak trillingen profiel met behulp van Origin 8.5 data-analyse software.
4. Vibrerende Cell Culture
- Subcultuur humaan beenmerg afgeleide MSC's in T150 weefselkweekflessen bij een initiële seeding dichtheid van 4000-5000 cellen / cm 2 in MSC onderhoud media.
- Na 7-8 dagen van celkweek (tot ~ 85% confluentie), trypsinize de cellen met een cel dissociatie reagens zoals Accutase, tellen met behulp van een hemocytometer, centrifuge (440 g gedurende 5 min), en resuspendeer de cel pellet in verse MSC onderhoud medium bij een concentratie van 4,5 x 10 6 cellen / ml.
- Dompel de PCL scaffold in 70% ethanol O / N. Nadat het oplosmiddel is verdampt, bloot beide zijden van de steiger aan UV-licht (254 nm) kiemdodende gedurende 5-8 minuten.
- Week de PCL steiger in een 20 ug / ml fibronectine-oplossing bij 37 ° C gedurende 1 uur. Plaats de met fibronectine gecoate steiger in de siliconen membraan. Monteer de bioreactor zoals beschreven in stap 1.
- Verdeel 40 pi van de celsuspensie gelijkmatig over de beveiligde PCL schavot. Laat de cellen hechten gedurende 1-1,5 uur voor toevoegen van een extra 1,5 ml vers medium om de trilling kamer.
- Cultuur het MSC-beladen PCL steiger statisch voor 3 dagen en vernieuw de media na afloop van de statische cultuur.
- Opleggen geselecteerde trillingen regimes om de cellulaire constructen. Opmerking: Als voorbeeld worden cellen onderworpen aan een 1-uur-on-1-hr-off (OF) trillingen op 200 Hz met aw van 0 ~ 40 urn voor 12 uur per dag gedurende 7 dagen. Constructen onderworpen aan trillingen stimulaties zijn aangewezen als Vib monsters en die culturode statisch in identieke trillingen kamers dienen als statische controles (Stat).
5. Biologische Evaluaties
- Verzamel 200 pi celkweekmedium van elke kamer om de dag (dag 1, 3, 5 en 7) en bundelen de aliquots van hetzelfde monster samen (800 pi elk).
- Kwantificeer de cellulaire matrix metalloproteinase-1 (MMP1) en HA met een MMP1 ELISA Development kit en een hyaluronan competitieve ELISA kit, respectievelijk volgens procedure van de fabrikant. Ondertussen assay de productie van oplosbare elastine precursor volgens de eerder beschreven ELISA-procedure. 8
- Na voltooiing van de laatste trilling cyclus op dag 7, snel te verwijderen van de cellulaire constructen van de trillingen kamers met behulp van scherpe pincet en kort spoel ze met koud fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, 4 ° C).
- Voor de live / dead kleuring, incubeer de constructen met propidiumjodide (1:2000 in PBS) enSyto-13 (1:1000 in PBS) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Afbeelding de gekleurde constructies met een multifoton confocale microscoop.
- Afzonderlijk, snap-vries de PBS-gespoeld mobiele constructies op droog ijs en pak de totale cellulaire RNA na een eerder gemelde protocol voor gen-analyse. 9
- Controleer de hoeveelheid en de kwaliteit van het gewonnen RNA met behulp van een UV-Vis spectrofotometer. RNA monsters met A260/A280 en A260/A230 verhoudingen van 1,8-2,2 wordt gebruikt voor daaropvolgende qPCR analyse.
- Reverse transcriptie van het RNA (500 ng / monster) in cDNA met behulp van een commercieel verkrijgbare reverse transcriptie kit.
- Voer de PCR reactie op een real-time sequence detectiesysteem met een algemeen verkrijgbare PCR master mix volgens de eerder beschreven procedure. 8
- Analyseer de qPCR resultaten met behulp van commerciële qPCR data-analyse software. Om de betrouwbaarheid van de gegevensanalyse waarborgen, worden meerdere referentie genen (YWHAZ, TBP, PPIA) toegepast als interne controles, en de variantie van specifieke primer efficiëntieverbeteringen in aanmerking wordt genomen. 8
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De PCL steigers vervaardigd door electrospinning bevatten micron poriën en interstitiële willekeurig verknoopte vezels met een gemiddelde diameter van 4,7 urn (figuur 4A). Bij een hogere vergroting, nanoschaal groeven en poriën zijn zichtbaar op individuele vezels (Figuur 4B). Coating van de steigers met fibronectine verbetert hydrofilie en vergemakkelijkt de initiële cel adhesie / verspreiding op het PCL steiger (ongepubliceerd observatie).
Sinusvormige golfvormen met de gewenste frequentie (f, 100-300 Hz) en spanning (Vpp: 0-,125 V) worden ingevoerd om de luidspreker onder elke trilling kamer, en de lucht opgesloten tussen de onderkant van de siliconen membraan en de papieren conus van een mini-woofer wordt gedreven in trilling. De lucht oscillatie wordt aan de steiger PCL met of zonder cellen. LDV wordt gebruikt om de trillingen kenmerken van de steiger te analyseren in een gegeven f en Vpp,rekening houdend met de brekingsindex van water (1.33). 20 Figuur 5 toont de normale verplaatsing (w0) in het midden van de PCL steiger als functie van Vpp en f. De trillingsfrequenties gekozen fundamentele menselijke spreken frequenties geven. 21 Er is een lineair verband tussen w 0 en Vpp in het traject van 0-0,125 V voor alle geteste frequenties. Bij een gegeven Vpp, w0 afneemt als f stijgt 100 tot 300 Hz.
Een specifieke trilling voorwaarde (f = 200 Hz, Vpp = 0,1 V) wordt geselecteerd voor verdere analyse. Het snelheidsprofiel als functie van de tijd (figuur 6A) toont dat het sinusvormig signaal ingevoerd naar de luidspreker wordt opgevangen door de PCL steiger met high fidelity. Het centrum van de PCL steiger oscilleert lengterichting met een maximum snelheid van 52 mm / sec, maximumversnelling 66 m / s 2 (~ 6,7 g) en eennormale verplaatsing van ~ 40 urn. De harmonische signalen 100, 300, 400 en 500 Hz ten minste een orde van grootte lager dan die bij de fundamentele frequentie (200 Hz). Indien de Vpp waarde te hoog (0,15 V), verschillende harmonische pieken van vergelijkbare intensiteit van de fundamentele frequentie worden gedetecteerd (Figuur 7). De trilprofiel over de steiger wordt gecreëerd door monitoring van de normale verplaatsing van een totaal van 73 representatieve punten op de radiale richting van de PCL oppervlak (figuur 3). De 3D kleurenkaart (figuur 8) toont aan dat de waargenomen op het oppervlak van het membraan trillingen axisymmetrische opzichte van het centrum en de rust positie. De normale verplaatsing blijkt monotoon dalen van het midden naar de rand waar het membraan is bevestigd.
MSC's gekweekt op PCL steigers worden gekweekt onder geselecteerde trillingen voorwaarden. Cellen onderworpen aan een 7-daY van stimulatie handhaven vergelijkbare levensvatbaarheid en proliferatie eigenschappen als statische (Afbeelding 9), bevestigd dat de vezelachtige steigers waren cytocompatible en trillingen toegepaste gaf geen verlies van levensvatbaarheid. Cellulaire reacties op vibratory stimulaties onderzocht op mRNA niveaus wat betreft de expressie van essentiële stemplooien ECM eiwitten zoals elastine (ELN), hyaluronan synthase-1 (HAS1), COL3A1 en MMP1 (figuur 10). De OF trilling leidt tot een 2,3-voudige toename in expressie ELN op dag 7 ten opzichte van de statische controles. De vibrerende stimulaties ook toegenomen COL3A1 expressie matig. Het is opmerkelijk dat de expressie van belangrijke ECM remodeling enzymen, HAS1 en MMP1, aanzienlijk versterkt door de trillingssignalen. Met name de dynamische behandeling resulteerde in een drievoudige toename van ~ 1.7 en ~ 16.3 voor HAS1 en MMP1 Uitdrukking (beide p <0,05), respectievelijk over hun statische controles op dag 7. Kortom, het inductieve effect van de trillingen aan HAS1 en MMP1 werd verhoogd van dag 3 tot dag 7.
De qPCR resultaten verder te onderbouwen, is de cellulaire productie van HA, oplosbaar elastine en MMP1 gekwantificeerd door ELISA op het translationele niveau (Figuur 11). De dynamisch gekweekte cellen produceren 4,2 ± 0,1 ug / mg (per droge steiger gewicht) oplosbaar elastine na 7 dagen van trillingen, terwijl de statische controles alleen ophopen 2,7 ± 0,2 ug / mg) elastine. Gemiddeld 7 dagen trillingen resulteren in 2.2-en 4.7-voudige toename van HA en MMP1 secretie ten opzichte van de corresponderende statische controles.
Video 1: Een 3D-simulatie toont de montage van een J2 bioreactor. De video werd gemaakt door Autodesk 3ds Max Design (Met dank aan Congfei Xie).
"Fo: keep-together.within-page =" altijd ">
. Figuur 1 Foto ter illustratie van de dimensie van de Al mal gebruikt voor het fabriceren van de siliconen membraan met verschanste mouw Ø:. Diameter, d: dikte / diepte, h:. Hoogte Klik hier voor een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
.. Figuur 2 Stroomdiagram die de bioreactor samenstel (A) Een foto van een vier-vormige arm PCL steiger, (B) een foto die de PCL steiger vastgezet in de vibratie kamer en vibrometer laser gericht op de bodem van de kamer; ( C) Een dwarsdoorsnedeal het licht van de trilling kamer. 1: PCL steiger (rood); 2: silicone membraan (cyaan); 3: Al stationaire bar; 4: top acrylblokje; 5: onderste acrylblokje; 6: mini-woofer, (D) zijaanzicht van de vibratiemodule, (E) een foto die het gehele samenstel. Dit cijfer is gewijzigd van Tong et al.. 10 Copyright 2013, Mary Ann Liebert, Inc Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Illustratie van radiaal gemarkeerd siliconen membraan voor single point LDV metingen. Is dit cijfer aangepast is Tong et al.. 10 Copyright 2013, Mary Ann Liebert, Inc
Figuur 4. SEM beelden van PCL steigers bij verschillende vergrotingen. (A) 600X, (B) 7000 X. Dit cijfer is gewijzigd van Tong et al.. 10 Copyright 2013, Mary Ann Liebert, Inc Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5. Het normale verplaatsing in het midden van het rolmembraan (w0) als functie van de toegepaste frequentie (100, 200 en 300 Hz) en de stuurspanning (Vpp = 0-0,125 V). Dit cijfer gewijzigd van Tong et al.. 10 Copyright 2013, Ma ry Ann Liebert, Inc
Figuur 6. Trillingsbeweging gedetecteerd bij het midden van de siliconen membraan met f = 200 Hz en Vpp = 0,1 V (A) Velocity profiel als functie van de tijd. (B) Velocity profiel als functie van de frequentie. (C) Versnelling als functie van de frequentie. (D) normale verplaatsing (w0) als functie van de frequentie. Dit cijfer is gewijzigd van Tong et al.. 10. Copyright 2013, Mary Ann Liebert, Inc Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
/ 51594fig7highres.jpg "/>
Figuur 7. Normaal verplaatsing gedetecteerd bij het midden van het membraan (w0) als functie van de frequentie wanneer een 200 Hz sinusgolf wordt ingevoerd om de mini-woofer op Vpp = 0,15 V.
Figuur 8. 3D colormap geconstrueerd door oppervlak gridding via het normale verplaatsing gegevens verzameld van alle locaties aangegeven op de PCL schavot. Is dit cijfer aangepast is Tong et al.. 10 Copyright 2013, Mary Ann Liebert, Inc
Figuur 9. Cel levensvatbaarheid, gevisualiseerd door live / dead kleuring, na 7 dagen van trillingen. Dit cijfer is aangepast Tong et al.. 10 Copyright 2013, Mary Ann Liebert, Inc Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 10. Cellulaire reacties op de trillende stimulaties wat betreft de expressie van stemplooien relevante ECM genen. De relatieve genexpressie (fold change) genormaliseerd op de respectieve statische controles op dag 3 en dag 7 (gestippelde basislijn). **: Significant verschil (p <0,05) tussen dag 3 en 7: significant veranderd (p <0,05) ten opzichte van de basislijn. Gegevens vertegenwoordigt gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM, n = 4). Tweezijdige student t-test wordt gebruikt voor statistische analyse, met p <0,05 wordt als significant di beschouwdfference (zelfde als hieronder). Dit cijfer is gewijzigd van Tong et al.. 10 Copyright 2013, Mary Ann Liebert, Inc
Figuur 11. Biochemische kwantificeren van HA (A), oplosbaar ELN (B) en MMP1 (C) door MSC's gekweekt op de PCL steiger onder Stat en Vib voorwaarden voor 7 dagen. Bedrag van ECM moleculen per droge steiger gewicht (mg) wordt weergegeven als gemiddelde ± SEM, n = 4 van de representatieve proef:. significant verbeterd (p <0,05) vergeleken met de controles Stat. Dit cijfer is gewijzigd van Tong et al.. 10 Copyright 2013, Mary Ann Liebert, Inc
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Succesvolle engineering van functionele stemplooi weefsels in vitro vereist de recreatie van een stemplooi-achtige micro-omgeving om het gedrag van multipotente cellen bemiddelen. Het is algemeen aanvaard dat weefsel of orgaan weerspiegelen de functies die zij moeten uitvoeren. 22 Voor stemplooien weefsels, de hoogfrequente trillingen die tijdens fonatie voorgesteld belangrijk weefsel rijping zijn. In onze studie worden PCL scaffolds gebruikt om een ligament-achtige structurele ondersteuning terwijl de stemplooien bioreactor is ontworpen om fysiologisch relevante mechanische signalen in te voeren om de gekweekte MSC's. De hier beschreven (J2) bioreactor creëert trillingen elektromagnetisch via individuele sprekers en brengt de energie aërodynamisch de gekweekte cellen. In vergelijking met onze vorige ontwerp, 18 het huidige systeem beweegt de bron van vibratie stimulatie direct onder elk monster goed, waardoor fora efficiëntere omzetting van energie. Hierdoor aanzienlijk meer normale verplaatsing en een hogere versnelling wordt bereikt met het huidige systeem. Het modulaire ontwerp minimaliseert ook systeem variaties en mechanische storing in de verschillende vibratie kamers.
Ons ontwerp is gebaseerd op een siliconen membraan naar de trillingssignalen leveren. Het is daarom belangrijk om de membraan integriteit en homogeniteit te handhaven. Nadat de precursor oplossing in de aluminium matrijs gegoten, is het wenselijk om de vloeistof te verwijderen door er een glasplaatje over het matrijsoppervlak. Consistente membranen zonder ingesloten luchtbellen worden geproduceerd door verlaging uithardingstemperatuur terwijl het verhogen uithardingstijd. Bovendien kan een 70% ethanoloplossing worden gebruikt om tijdelijk zwellen de membraan aan de aluminium interface eenvoudig verwijderen van de siliconen toe. Om de cellulaire constructen voor 3D-dynamische cultuur, een centraal geplaatste dunne groef tegemoet is gegoten in de siliconen membraan, zodat de PCL steigers perifeer kan worden verankerd in de vibratie kamer. De geometrie van de groef is instelbaar; waardoor de vorm van de cellulaire construct kan derhalve worden afgestemd op de geometrie van natieve stemplooien beter nabootsen. 23 Indien de PCL steiger niet stevig vastgezet in de siliconen membraan, de LDV signalen gedetecteerd bij de PCL en aan het buitenste gebied van de siliconen membraan niet volledig overlappen. Bij het monteren van de bioreactor, is het essentieel dat alle componenten zijn bevestigd en vastgezet in dezelfde mate om ongewenste bewegingen te vermijden en minimaliseren kamer naar kamer variaties.
Om het nut van de bioreactor te valideren, worden MSCs gekweekt op PCL steigers en onderworpen aan periodieke (OF) trillingen gedurende 7 dagen. De trillingen over een periode van enkele uren per dag worden ingezet om de sprekende voorwaarden van zware stem gebruikers reproduceren, bijvoorbeeld professioneel zingen ers en leerkrachten. 23 In tegenstelling tot eerder gemeld stemplooi bioreactoren, ons veroorzaken geen nadelig effect of fysiologische trauma aan de cellen.
De 200-Hz trillingen blijken te reguleren om cellulaire belangrijke ECM componenten. Elastine is een belangrijk structureel eiwit dat wordt gevonden door de stemplooien LP, en zorgt voor veerkracht en elasticiteit. 24 Interstitiële amorfe componenten, zoals HA, bijdragen aan het handhaven van de juiste weefsel visco-elasticiteit en de preventie van littekenvorming. 25,26 MSC onderworpen aan de 7-daagse behandeling produceren een aanzienlijk hoger bedrag van elastine dan het statisch gekweekte tegenhangers. Biosynthese van HA is ook gevoelig voor trillingen, zoals bevestigd door qPCR resultaten in HAS1 en ELISA-resultaten in HA. Deze bevindingen suggereren dat de vibrerende stimulatie ingeschakeld door de bioreactor is bevorderlijk voor de productie van anti-littekens moleculen.
jove_content "> Balanced ECM omzet afhankelijk is van gelijktijdige matrix depositie en degradatie. 27 Type III collageen is de belangrijkste reticulaire collageen vezels in stemplooien, waardoor het weefsel met dragende eigenschappen. 28 De 7-daagse trillingen hierin toegepast verbeteren van de genexpressie van COL3A1, maar op een magnitude veel lager dan die van elastine. Daarom is de toegepaste trillingen reguleren om cellulaire machinerie betrokken bij de synthese van collageen III en elastine. Interessant MMP1, een van de belangrijkste MMPs betrokken zijn bij matrixafbraak en weefsel remodellering 27 , is zeer gevoelig voor de vibrerende cues. Deze resultaten komen goed overeen met eerdere rapporten op trillingsgeïnduceerde MMP1 upregulation door cellen gevangen in een HA-matrix. 29 Kortom, de vibrerende stimulaties gegenereerd door de stemplooien bioreactor diep bemiddelen MSC functies door het bevorderen van de homeostase van stemplooi-achtige matrices.Overalle, de roman stemplooi bioreactor hier gepresenteerd is modulair en gebruikersvriendelijk, waardoor dynamische celkweek op een reproduceerbare wijze worden uitgevoerd. Echter, een aantal beperkingen bestaan in het huidige ontwerp. Ten eerste, de trillingsamplitude, hoewel een verbetering van de J1 versie, klein in vergelijking met de stemplooien weefsel. Ten tweede, is onze bioreactor niet simuleren de bilaterale botsing van stemplooien tijdens de normale phonation. Ten derde, is onze vezelig PCL steiger geen afspiegeling van het weefsel anisotropie. Toekomstige werkzaamheden is gewijd aan het verbeteren van het ontwerp om beter na te bootsen de inheemse phonation voorwaarden. Ondertussen zal een optimale regimes voor 3D dynamische cultuur worden verkend voor de succesvolle functionele stemplooi assemblage in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen concurrerende financiële belangen bestaan.
Acknowledgments
Wij danken dr. Jeffrey Caplan voor zijn opleiding en advies op confocale beeldvorming. We danken ook de Keck Electron Microscopy Lab en Dr Chaoying Ni voor SEM hulp. Dit werk wordt gefinancierd door de National Institutes of Health (NIDCD, R01DC008965 en R01DC011377). ABZ erkent NSF Integrative Graduate Education & Research Traineeship programma voor financiering (IGERT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicone elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 184 | Cure the membrane at 100 °C for 2 hr |
| PCL | Sigma Aldrich | 440744-500G | Mn ~80 kDa, dissolve O/N |
| Chloroform | Sigma Aldrich | C7559-5VL | |
| Human bone marrow-derived MSCs | Lonza | PT-2501 | Received with passage 2 |
| MSC maintenance media | Lonza | PT-3001 | 10% FBS in basal media supplemented with L-glutamine, gentamicin and amphotericin |
| Accutase cell dissociation reagent | Life Technologies | A11105-01 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500ML | |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F2006-1MG | |
| MMP1 DuoSet ELISA kit | R&D systems | DY901 | |
| HA ELISA kit | Echelon Biosciences | K-1200 | |
| PBS | Life Technologies | 14190-136 | |
| Propidium iodide | Life Technologies | P1304MP | |
| Syto-13 | Life Technologies | S7575 | |
| QuantiTect reverse transcription kit | Qiagen | 205311 | |
| SYBR Green PCR master mix | Life Technologies | 4309155 | |
| Replacement speaker | DAYTON audio (via Parts Express) |
DS90-8 | Paper cone, full range (80-13,000 Hz), 85 dB |
| Ergo Micro torque screwdriver | Mountz | # 020377 | Torque range: 20-120 cN·m |
| Stereo speaker selector | RadioShack | 40-244 | Maximum power handling 50 W |
| Function generator | Agilent | 33220A | Frequency range 1 µHz-20 MHz |
| Power amplifier | PYLE audio | PylePro PT2400 | Frequency response: 10 Hz-50 kHz, two speaker channels |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher | Steri-Cult 3307 | |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| High voltage power supply | Spellman | CZE 1000R | Output voltage: 0-30 kV |
| Scanning electron microscope | JEOL-USA | JSM-7400F | |
| Desk gold sputter coater | Denton Vacuum | DSK00V-0013 | |
| Doppler laser vibrometer | Polytec | PDV-100 | Non-contact velocity measurement (0-22 kHz) |
| PCR sequence detection system | Applied Biosystems | ABI7300 | |
| Multiphoton confocal microscope | Zeiss | Zeiss 510Meta NLO | |
| UV-VIS Spectrophotometer | NanoDrop Products via Thermo Scientific |
ND-2000 | |
| VibSoft Data Acquisition Software | Polytec | Acquisition bandwidth up to 40 MHz | |
| Origin 8.5 data analysis software | OriginLab | ||
| qbasePlus qPCR data analysis software | Biogazelle | V2.3 | |
| Aluminium alloy | McMaster-Carr | Alloy 6061 | |
| Acrylic blocks | McMaster-Carr | ||
| Polycarbonate anti-humidity chamber | McMaster-Carr | Impact-Resistant Polycarbonate | |
| screws | McMaster-Carr | ||
| Electronic cable/wire | |||
| Medical grade PVC tubing | US Plastic Corp. | Tygon S-50-HL | Clear, biocompatible |
| 10 ml Syringe | Becton Dickinson | 309604 | |
| 21 G Blunt ended needle | Small Parts | NE-213PL-25 | 1-1/2" length |
| Alligator clip adapters | RadioShack | 270-354 | Fully insulated |
| 8 mm Biopsy punch | Sklar Surgical Instruments | 96-1152 | Sterile, disposable |
| 12 mm Biopsy punch | Acuderm (via Fisher Scientific) | NC9998681 | |
| Tissue culture flasks | Corning | Cell culture treated |
References
- Titze, I. R.
- Titze, I. R. On the Relation Between Subglottal Pressure and Fundamental-Frequency in Phonation. J. Acoust. Soc. Am. 85, 901-906 (1989).
- Gray, S. D.
- Thibeault, S. L., Gray, S. D., Bless, D. M., Chan, R. W., Ford, C. N. Histologic and rheologic characterization of vocal fold scarring. J. Voice. 16, 96-104 (2002).
- Hansen, J. K., Thibeault, S. L. Current understanding and review of the literature: Vocal fold scarring. J. Voice. 20, 110-120 (2006).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284, 143-147 (1999).
- Hanson, S. E., et al. Characterization of Mesenchymal Stem Cells From Human Vocal Fold Fibroblasts. Laryngoscope. 120, 546-551 (2010).
- Tong, Z., Duncan, R. L., Jia, X. Modulating the behaviors of mesenchymal stem cells via the combination of high-frequency vibratory stimulations and fibrous scaffolds. Tissue Eng. Part A. 19, 1862-1878 (2013).
- Tong, Z., Sant, S., Khademhosseini, A., Jia, X. Controlling the Fibroblastic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells Via the Combination of Fibrous Scaffolds and Connective Tissue Growth Factor. Tissue Eng. Part A. 17, 2773-2785 (2011).
- Jones, D. L., Wagers, A. J. No place like home: anatomy and function of the stem cell niche. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, DOI. 11-21 (1038).
- Wang, J. H., Thampatty, B. P. Mechanobiology of Adult and Stem Cells. Int. Rev. of Cell Mol. Biol. 271, 301-346 (2008).
- Doroski, D. M., Levenston, M. E., Temenoff, J. S. Cyclic tensile culture promotes fibroblastic differentiation of marrow stromal cells encapsulated in poly (ethylene glycol)-based hydrogels. Tissue Eng. Part A. 16, 3457-3466 (2010).
- Kim, B. S., Nikolovski, J., Bonadio, J., Mooney, D. J. Cyclic mechanical strain regulates the development of engineered smooth muscle tissue. Nat. Biotechnol. 17, 979-983 (1999).
- Webb, K., et al. Cyclic strain increases fibroblast proliferation, matrix accumulation, and elastic modulus of fibroblast-seeded polyurethane constructs. J. Biomech. 39, 1136-1144 (2006).
- Kim, Y. J., Sah, R. L. Y., Grodzinsky, A. J., Plaas, A. H. K., Sandy, J. D. Mechanical Regulation of Cartilage Biosynthetic Behavior - Physical Stimuli. Arch. Biochem. Biophys. 311, 1-12 (1994).
- Titze, I. R., et al. Design and validation of a bioreactor for engineering vocal fold tissues under combined tensile and vibrational stresses. J. Biomech. 37, 1521-1529 (2004).
- Kutty, J. K., Webb, K. Vibration stimulates vocal mucosa-like matrix expression by hydrogel-encapsulated fibroblasts. J. Tissue Eng. Regen. Med. 4, 62-72 (2010).
- Farran, A. J. E., et al. Design and Characterization of a Dynamic Vibrational Culture System. J. Tissue Eng. Regen. Med. , (2011).
- Reneker, D. H., Yarin, A. L. Electrospinning jets and polymer nanofibers. Polymer. 49, 2387-2425 (2008).
- Wang, Y., Theobald, P., Tyrer, J., Lepper, P. The application of scanning vibrometer in mapping ultrasound fields. J. Phys.: Conf. Ser. 1, 167-173 (2004).
- Brown, W. S., Morris, R. J., Hollien, H., Howell, E. Speaking Fundamental-Frequency Characteristics as a Function of Age and Professional. J. Voice. 5, 310-315 (1991).
- Ingber, D. E. Cellular mechanotransduction: putting all the pieces together again. Faseb J. 20, 811-827 (2006).
- Titze, I. R., et al. Design and validation of a bioreactor for engineering vocal fold tissues under combined tensile and vibrational stresses. J. Biomech. 37, 1521-1529 (2004).
- Moore, J., Thibeault, S. Insights Into the Role of Elastin in Vocal Fold Health and Disease. J. Voice. 26, 269-275 (2012).
- Thibeault, S. L., Bless, D. M., Gray, S. D. Interstitial protein alterations in rabbit vocal fold with scar. J. Voice. 17, 377-383 (2003).
- Branski, R. C., Verdolini, K., Sandulache, V., Rosen, C. A., Hebda, P. A. Vocal fold wound healing: A review for clinicians. J. Voice. 20, 432-442 (2006).
- Clark, I. A., Swingler, T. E., Sampieri, C. L., Edwards, D. R. The regulation of matrix metalloproteinases and their inhibitors. Int. J. Biochem. Cell B. 40, 1362-1378 (2008).
- Silver, F. H., Horvath, I., Foran, D. J. Viscoelasticity of the vessel wall: The role of collagen and elastic fibers. Crit. Rev. Biomed. Eng. 29, 279-301 (2001).
- Kutty, J. K., Webb, K. Tissue Engineering Therapies for the Vocal Fold Lamina Propria. Tissue Eng. Part B: Rev. 15, 249-262 (2009).
