Konstruktion og karakterisering af en roman Vocal Fold bioreaktor

Introduction

Den menneskelige vocal fold, sammensat af et epithellag, lamina propria (LP) og vocalis muskel, er en specialiseret blødt væv, der konverterer luftstrømmen fra lungerne i akustiske bølger af lyd produktion. ^En Vocal folder svinge regelmæssigt under normal phonation, udstiller stammer på op til 30% ved grundlæggende frekvenser, der spænder fra 100 til 300 Hz. ² Voksen vocal fold LP er en gradient struktur består af en overfladisk (SLP), et mellemprodukt (ILP), og en dyb (DLP) lag. Yderligere klassificering grupper epitel og SLP som slimhinden lag, og kombinerer ILP og DLP i den vokale ledbånd. ³ SLP lag indeholder primært en amorf matrix med tyndt spredte kollagene fibre, mens ledbånd er beriget med moden kollagen og elastin fibre at give tilstrækkelig styrke. ^4. Strukturen og mekanik nyfødte vokal folder varierer betydeligt fra deres modne kolleger. Selvom mekanismens regulerer vokal fold udvikling og modning er endnu ikke fuldt forstået, eksperimentelle bevismateriale har peget på de afgørende roller vocalization-afledt mekanisk stress.

Adskillige medicinske tilstande, herunder tale misbrug, infektioner, kemiske irritanter og kirurgiske procedurer, kan beskadige vocal fold. Vocal fold lidelser påvirker en anslået 3-9% af den amerikanske befolkning. Nuværende metoder til behandling af vokal fold lidelser er begrænset ⁵ og en stamcelle-baserede tissue engineering tilgang har vist sig som en lovende strategi for at genoprette vocal fold funktion. Mesenkymale stamceller (MSC) er et velegnet alternativ til de primære vocal fold fibroblaster til vocal fold tissue engineering. ^6-9 Stamceller skæbne specifikation og efterfølgende udvikling væv medieret af specifikke niche de bor i, hvoraf den mekaniske tilstand er en afgørende faktor. ¹⁰ Mekaniske kræfter er vigtige regulatorer af vævsmorfogenese ennd homeostase, især for væv, der rutinemæssigt udsættes for belastning. ¹¹ Fra en tissue engineering perspektiv, er det blevet påvist, at eksponering for fysiologisk relevante mekaniske stimuleringer fremmer stamceller differentiering og vævsspecifik matrix remodellering. ^12-15

Vævskultur bioreaktorer er beregnet til at simulere den ønskede fysiologiske miljø for celle-eller vævsvækst in vitro. For vocal fold tissue engineering, er det især vigtigt at genskabe den mekaniske miljø i phonating vokal folder. En ideel vocal fold bioreaktor skal effektivt levere vibrerende stikord til kultur celler, hvilket giver facile kontrol over frekvens, amplitude og varighed af vibrationer. Titze og kolleger udtænkt en vokal fold bioreaktor (T1 bioreaktor) ^16, der kombinerer statisk strækning med høj frekvens (20-200 Hz) svingninger at stimulere cellulær produktion af matrix proteiner. Using denne bioreaktor, Webb og kolleger ¹⁷ undersøgte effekten af 10-dages, 100 Hz vibrationer på dermalfibroblaster dyrket i en hyaluronsyre (HA)-baserede hydrogel. Konstruktioner, der udsættes for vibrationer udviste en forhøjet udtryk for HA synthase-2 (HAS2) decorin, fibromodulin og matrixmetalloproteinase-1 (MMP1) i forhold til de statiske kontrol. De stimulerende effekter blev fundet at være tidsafhængig. For nylig, vores gruppe ¹⁸ samlet en vocal fold bioreaktor (J1 bioreaktor) ved hjælp af en effektforstærker, en funktion generator, en lukket højttaler og et periferisk forankret silikone membran, der overfører den oscillerende luft til de vedhæftede celler. Neonatale forhudsfibroblaster dyrket i J1 bioreaktoren blev udsat for 1 time af vibration ved 60, 110 eller 300 Hz, med en in-plane stamme af op til 0,05%. QPCR Resultaterne antydede, at ekspression af nogle ECM gener moderat blev ændret som reaktion på de forskellige vibrations frekvenserog amplituder.

Disse bioreaktor motiver mens spændende, har flere begrænsninger. For eksempel T1-systemet kræver et stort antal stik og barer til mekanisk kobling, begrænse den maksimale frekvenser opnåelige. Desuden kan celler udsættes for uønsket mekanisk omrøring og væske perturbation komplicerer fortolkning af dataene. Den J1 bioreaktor, på den anden side udviser relativt lav energi konvertering effektivitet og er ikke brugervenligt. Desuden vibrationer ofte løsnes de celle-holdige konstruktioner fra den underliggende siliconemembran. J2 vocal fold bioreaktor rapporteret her, designet baseret på samme princip som J1 version er optimeret til konsistens og reproducerbarhed. De phonation efterligner vibrationer genereres aerodynamisk i individuelt monteret vibrationer kamre hvor MSC-befolkede fiberholdigt poly (ε-caprolacton) (PCL) stilladser er virkningsfuldely sikret. Laser Doppler Vibrometry (LDV) giver brugeren mulighed for at kontrollere den vibrerende profil membranen / stillads forsamling. I vores demonstration MSC'er udsat for 200 Hz sinusformede svingninger med en 1-timers-on-1-h-off (OF) mønstret for i alt 12 timer dagligt i 7 dage. Cellulære reaktioner på de pålagte vibrerende tidskoder undersøges systematisk. Samlet set J2 vocal fold giver den mest brugervenlige funktioner, der giver dynamisk cellekultur undersøgelser, der gennemføres i et high throughput og reproducerbar måde.

Protocol

1.. Bioreaktor Assembly (Video 1)

1. Lav en aluminiumsform (cirkulær matrice + spacer pin) med forudbestemte indre og ydre dimensioner (fig. 1).
2. Brug af mug fra trin 1.1, fabrikere en silikone membran (diameter: 42 mm, tykkelse: 1,5 mm, figur 1) med en indgroet muffe (diameter: 12 mm, tykkelse ~ 0.25 mm, formet af spacer pin i figur 1) midten ved hjælp af en kommercielt tilgængelig siliconeelastomer kit.
3. Lav et par af akryl blokke (figur 2 (4, 5)) med en cirkulær åbning (diameter: 24 mm) i midten, gravere toppen (1,8 cm tyk) og bund (0,9 cm tyk) blokke med matchende rygge og riller . ^10.
4. Sandwich siliconemembran mellem de parrede akryl blokke. Fastgør forsamling med fire hjørne skruer ved hjælp af en mikro moment skruetrækker indstilles til en konstant kraft (35 cN · m). Som et resultat, en vandtæt, 24 mm bred og 18 mm dyb vibration kammer er skabt (Figur 2C).
5. Monter en 3 ^"udvidet sortiment mini-woofer (figur 2D, 8 Ω/20 W) under vibration kammer gennem et andet sæt hjørne skruer på bunden akryl blok. På dette tidspunkt, er en individuel vibration modul samles.
6. Gentagne yderligere syv vibrationer moduler. Anbringe fire af dem til en af ​​to stationære aluminiumsstænger (40 cm x 10 cm x 2,5 cm) ved at placere højttaler baser i jævnt fordelte cirkulære huller (diameter: 7 cm, tykkelse: 2 cm) skæres i stænger. Stabilisere hver højttaler ved at indsætte en skrue gennem siden af ​​aluminium bar i hvert cirkulært hul.
7. Individuelt styre højttalerne ved en højttaler selector. Slut individuelle højttalere til vælgeren ved at knytte tråde til de positive og negative indgange på højttaleren krop derefter til de tilsvarende udgange på vælgeren. Højttaleren vælgeren tillader signalet fra tHan funktion generator, efter at have passeret gennem en effektforstærker, at nå alle otte højttalere på én gang (Figur 2E).
8. Anbring de to kammer arrays, højttaler selector og tilhørende elektronik i en anti-fugt kabinet. Hus hele forsamlingen i en kommerciel cellekultur inkubator.
9. Feed hovedkabler (via en medicinsk kvalitet PVC-rør), der forbinder effektforstærker og højttaler selector gennem filterenheden på bagsiden af ​​inkubatoren.

2.. Scaffold fremstilling og karakterisering

1. Opløs PCL pellets i chloroform ved en koncentration på 15 vægt%. Indlæse opløsning i en 10 ml sprøjte udjævnet med en 21 G stump nål.
2. Lås sprøjten på en programmerbar sprøjtepumpe og indstille strømningshastigheden ved 1 ml / time.
3. Placer aluminium folieklap solfanger tværs fra nålen vandret med en nål spids-til-collector afstand på ~ 18 cm.
4. Klem den positive alligator klip til midten af ​​nålen, og jorden krokodillenæb til aluminium opkøber, derefter indstille spændingen på den høje spænding strømforsyning på 15 kV. ADVARSEL: høj spænding, holde afstand fra nålen.
5. Sekventielt tænde sprøjten pumpe og strømforsyning; hurtigt ren / fjerne den resterende polymer løsning omkring spidsen af nålen med en tør papirserviet, inden stabil fiber jetfly og Taylor kegle ¹⁹ er dannet.
6. Fibrene skal akkumuleres på Al kollektor til en tykkelse på ~ 250-300 um (~ 7 timer under de nuværende spindebetingelser). Opbevar de resulterende stilladser i vakuum i 1-2 dage for at fjerne enhver resterende opløsningsmiddel.
7. Billede stilladserne, katodecoatet med guld, ved hjælp af et Scanning Electron Microscope at vise konsekvent fibermorfologi. ^10.

3.. Bioreaktor Assembly og karakterisering

1. Punch en cylindrisk skive (diameter: 8 mm) med fire arme (længde: 2mm) ud af spundne PCL måtten (figur 2A) ved først under anvendelse af en 12 mm diameter biopsitang at skære den ydre diameter af disken. Brug derefter en anden, 8 mm biopsi punch til lave fire 2 mm lange hak jævnt fordelt rundt rundklingen at score hvor armene skal skæres. Efter scoring med 8 mm punch, bruge en skalpel til at skære kanterne af armene udad. Sæt stilladset i rillen af siliconemembran via udstrakte arme (Video 1). Flatten den indsatte stillads ved forsigtigt at trykke overfladen med flathead pincet.
2. Vedhæft et lille stykke tyndt Al folie (8 mm x 2 mm, retvinklede form, figur 2B) til PCL stillads at hjælpe laser refleksion.
3. Fastgør den samlede siliconemembran / PCL stillads (som beskrevet i trin 1.4) i vibration kammer. Tilføj 1,5 ml vand i kammeret for at hydrere PCL stilladset før vibrationer.
4. Ved hjælp af funktionen generator, indfører vibrationer tegnals (fx 200 Hz sinusformede bølger med spids-til-spids spænding, Vpp, 0,1 V) til klemt acryl kammer. Brug et voltmeter til at præcist at måle spændingen på hver højttaler input. Bemærk: Vpp udlæsning fra funktionen generator vil afvige fra den endelige spænding leveret til højttaleren.
5. Saml single-point LDV og sikre fiberoptiske lasersensor hoved til en pan-tilt hoved stativ. Vinkel sensorhovedet, så det peger vinkelret på bordpladen. Slut LDV sensor hovedet til datafangst modul via koaksialkabel hvorefter modulet til den bærbare computer via USB.
6. Fokusere laserstrålen vinkelret på forskellige forudbestemte punkter på siliconemembran (figur 2B og figur 3).
7. Ved hjælp af datafangst software, registrerer midten membran forskydning den. Klik på "erhvervelse Settings" fra "Options"-menuen; derefter ændre målingen til "FFT221. Næste, klik på "kontinuerlig måling" i hovedværktøjslinjen og klik derefter på den top, der danner på den valgte frekvens (6D) for at optage forskydning.
8. Plot normale midten membran forskydning (w ₀₎ som en funktion af den relative placering på tværs af substratet. Konstruere en 3D colormap af overfladen vibrerende profil ved hjælp Origin 8.5 dataanalyse software.

4.. Vibrationstromle Cellekultur

1. Subkultur humane knoglemarvsceller MSC'er i T150-vævskulturkolber med en initial podningsdensitet på 4000-5000 celler / cm ² i MSC vedligeholdelse medier.
2. Efter 7-8 dage cellekultur (til ~ 85% konfluens) Trypsinisér cellerne med en celle dissociation reagens, såsom Accutase, tæller ved hjælp af et hæmocytometer, centrifugeres (440 xg 5 min), og re-suspendere cellepelleten i frisk MSC vedligeholdelse medier ved en koncentration på 4,5 x 10 ⁶ celler / ml.
3. Fordyb PCL scaffold i 70% ethanol O / N. Efter at opløsningsmidlet er fordampet, udsætte begge sider af stilladset til bakteriedræbende UV-lys (254 nm) i 5-8 min.
4. Soak PCL stilladset i en 20 pg / ml fibronectin opløsning ved 37 ° C i 1 time. Sæt fibronectin-coatede stillads i siliconemembran. Saml bioreaktoren som beskrevet i trin 1.
5. Fordel 40 pi af cellesuspensionen jævnt på den sikrede PCL stilladset. Lad cellerne til at vedhæfte til 1-1,5 time, før du tilføjer yderligere 1,5 ml friske medier til vibration kammer.
6. Kultur MSC-laden PCL stillads statisk i 3 dage og opdatere medierne efter afslutningen af ​​den statiske kultur.
7. Pålægge udvalgte vibrationer regimer til de cellulære konstruktioner. Bemærk: Som et eksempel, celler udsat for en 1-timers-on-1-h-off (OF) vibration ved 200 Hz med aw ₀ i ~ 40 um i 12 timer per dag i op til 7 dage. Konstruktioner, der udsættes for vibrerende stimulationer er udpeget som vib prøver og de kulturød statisk i identiske vibrationer kamre tjene som statiske kontroller (Stat).

5. Biologiske Evalueringer

1. Saml 200 ul cellekulturmedier fra hvert kammer hver anden dag (dag 1, 3, 5 og 7), og samle prøver fra den samme prøve sammen (800 pi hver).
2. Kvantificerer cellulær produktion af matrixmetalloproteinase-1 (MMP1) og HA ved hjælp af en MMP1 ELISA Development kit og en hyaluronan konkurrencedygtig ELISA kit, henholdsvis efter fabrikanternes procedure. I mellemtiden analysere produktionen af opløselige elastin forløber efter de tidligere rapporterede ELISA-procedure. ^8.
3. Ved afslutningen af ​​sidste vibrationer cyklus på dag 7, hurtigt fjerne de cellulære konstruktioner fra vibrationer kamre ved hjælp af skarpe pincet og kort skyl dem med koldt phosphatbufret saltvand (PBS, 4 ° C).
4. For den levende / døde farvning, inkuberes konstruktionerne med propidiumiodid (1:2.000 i PBS), ogSyto-13 (1:1000 i PBS) samtidig i 5 minutter ved stuetemperatur. Billede de farvede konstruktioner med en multiphoton konfokal mikroskop.
5. Separat, snap-indefryse PBS-skyllede cellulære konstruktioner på tøris og udtrække det totale cellulære RNA efter en tidligere rapporteret protokol til genanalyse. ^9.
6. Kontroller mængden og kvaliteten af ​​det ekstraherede RNA ved anvendelse af et UV-Vis spektrofotometer. RNA-prøver med A260/A280 og A260/A230 forhold på 1,8-2,2 anvendes til efterfølgende qPCR analyse.
7. Reverse transskribere RNA (500 ng / prøve) til cDNA ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt revers transkription kit.
8. Udfør PCR-reaktionen på en real-time sekvens detection system ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt PCR Master Mix efter den tidligere detaljerede procedure. ^8.
9. Analysere resultaterne qPCR brug af kommerciel qPCR dataanalyse software. For at sikre pålideligheden af ​​dataanalyse er flere reference-gener (YWHAZ, TBP, PPIA) ansat som internal kontrol, og variansen af specifikke primer effektivitet tages i betragtning. ^8.

Representative Results

PCL stilladser fremstillet ved electrospinning indeholder mikronstørrelse interstitielle porer og tilfældigt sammenfiltrede fibre med en gennemsnitlig diameter på 4,7 um (figur 4A). Ved en højere forstørrelse, nanoskala riller og porerne er synlige på de individuelle fibre (figur 4B). Coating af stilladser med fibronektin forbedrer hydrofilitet og letter den indledende celleadhæsion / spredning på PCL stillads (upubliceret observation).

Sinusformede bølgeformer med ønskede frekvens (f, 100-300 Hz) og spænding (Vpp: 0-0,125 V) introduceres til højttaleren under hver vibration kammer, og luften indesluttet mellem bunden af siliconemembran og papiret kegle af en mini-woofer drives ind svingning. Luften svingning leveres til PCL stillads med eller uden celler. LDV anvendes til at analysere vibrationer karakteristika stilladset på et givet f og Vpp,under hensyntagen til brydningsindekset for vand (1,33). ^20. Figur 5 viser den normale forskydning (w ₀₎ i midten af PCL stilladset som en funktion af Vpp og f. De vibrationer frekvenser er valgt til at afspejle fundamentale menneskelige talende frekvenser. ^21. Der er en lineær sammenhæng mellem w ₀ og Vpp i intervallet 0 til 0,125 V for alle de testede frekvenser. Ved en given Vpp, w ₀ falder med f stiger fra 100 til 300 Hz.

En specifik vibration tilstand (f = 200 Hz, Vpp = 0,1 V) er valgt til yderligere analyse. Hastigheden profil som funktion af tiden (figur 6A) viser, at den sinusformet signal indføres til højttaleren er fanget af PCL stillads med high fidelity. I midten af PCL stillads svinger på langs med et højdepunkt hastighed på 52 mm / sek, en maksimal acceleration på 66 m / sek ² (~ 6,7 g) og ennormale forskydning af ~ 40 um. De harmoniske signaler 100, 300, 400 og 500 Hz er mindst en størrelsesorden lavere end dem på den grundlæggende frekvens (200 Hz). Men hvis Vpp værdi er for høj (0,15 V) er flere harmoniske toppe af sammenlignelig intensitet til den grundlæggende frekvens opdaget (Figur 7). De vibrationer profil på tværs af stilladset er skabt ved at overvåge det normale forskydning fra i alt 73 repræsentative punkter på de radiale retninger af PCL overflade (Figur 3). 3D colormap (figur 8) viser, at vibrationen detekteres på overfladen af membranen axisymmetrical forhold til centrum og dens hvilepositioner. Den normale forskydning findes at falde monotont fra midten til kanten, hvor membranen er sikret.

MSC dyrket på PCL stilladser dyrkes under udvalgte vibrationer forhold. Celler udsat for en 7-daY af stimulation opretholde lignende levedygtighed og spredning egenskaber som de statiske kontroller (figur 9), bekræfter, at fiber stilladser var cytocompatible og vibrationer anvendte resulterede ikke i nogen tab af levedygtighed. Cellulære reaktioner på vibrerende stimulationer undersøges på mRNA-niveauer med hensyn til ekspressionen af essentielle vokal fold ECM-proteiner, såsom elastin (ELN), hyaluronan synthase-1 (has1) Col3A1 og MMP1 (figur 10). De vibrationer fører til en 2,3 gange stigning i ELN udtryk på 7. dag, i forhold til de statiske kontrol. De vibrerende stimulationer steg også Col3A1 udtryk moderat. Det er bemærkelsesværdigt, at ekspressionen af vigtige ECM remodeling enzymer, has1 og MMP1, signifikant forøget med de vibrationssignaler. Konkret dynamisk behandling resulterede i en dobling på ~ 1,7 og ~ 16,3 for has1 og MMP1 udtryk (begge p <0,05), henholdsvis over deres statiske kontrol på dag 7.. Generelt blev den induktive effekt af vibrationerne på has1 og MMP1 forbedret fra dag 3 til dag 7.

For yderligere at underbygge resultaterne qPCR, er den cellulære produktion af HA, opløselig elastin og MMP1 kvantificeret ved ELISA på det translationelle niveau (figur 11). De dynamisk dyrkede celler producerer 4,2 ± 0,1 pg / mg (pr. tør stillads vægt) opløselig elastin efter 7 dages vibrationer, mens de statiske kontroller kun akkumulere 2,7 ± 0,2 mg / mg) elastin. I gennemsnit 7-dages vibrationer resulterer i 2,2 og 4,7 gange stigning i HA og MMP1 sekretion, i forhold til de tilsvarende statiske kontroller.

Video 1: En 3D-simulation, der viser samlingen af et J2 bioreaktor. Videoen blev skabt af Autodesk 3ds Max Design (Courtesy of Congfei Xie).

"Fo: keep-together.within-side =" altid ">
. Figur 1. fotografere illustrerer dimension af Al støbeform bruges til fabrikere silikone membran med indgroet ærme Ø:. Diameter, d: tykkelse / dybde, h:. Højde Klik her for at se en større version af dette tal.

.. Figur 2. Rutediagram der viser bioreaktoren samling (A) Et fotografi af en fire-arm formet PCL stillads; (B) Et fotografi viser PCL stilladset fastgjort i vibration kammer, og vibrometer laser fokuseret på bunden af kammeret, ( C) Et tværsnital visning af vibrationer kammeret. 1: PCL stillads (rød); 2: silikone membran (cyan); 3: Al stationær bar; 4: top akryl blok; 5: bund akryl blok; 6: mini-woofer (D) sidebillede af vibrationer modul, (E) Et fotografi, der viser hele konstruktionen. Dette tal er blevet ændret fra Tong et al. ¹⁰ Copyright 2013 Mary Ann Liebert, Inc. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3.. Illustration af radialt mærket silikone membran til enkelt punkt LDV målinger. Dette tal er blevet ændret fra Tong et al. ¹⁰ Copyright 2013 Mary Ann Liebert, Inc.

Figur 4.. SEM billeder af PCL stilladser ved forskellige forstørrelser. (A) 600X, (B) 7,000 X. Dette tal er blevet ændret fra Tong et al. ¹⁰ Copyright 2013 Mary Ann Liebert, Inc. Klik her for at se en større version af dette tal.

Fig. 5. Den normale forskydningen i centrum af siliconemembran (w ₀₎ som en funktion af den anvendte frekvens (100, 200 og 300 Hz) og drivende spænding (Vpp = 0 til 0,125 V). Dette tal er blevet ændret fra Tong et al. ¹⁰ Copyright 2013 Ma Ry Ann Liebert, Inc.

Figur 6. Vibrationsdæmpende egenskaber opdaget ved midten af siliconemembran med f = 200 Hz og en Vpp = 0,1 V. (A) Velocity profil som funktion af tiden. (B) Velocity profil som en funktion af frekvens. (C) Acceleration som en funktion af frekvens. (D) Normal forskydning (w ₀₎ som en funktion af frekvens. Dette tal er blevet ændret fra Tong et al. ^10.. Copyright 2013 Mary Ann Liebert, Inc. Klik her for at se en større version af dette tal.

/ 51594fig7highres.jpg "/>
Fig. 7. Normal forskydning detekteres ved midten af membranen (w ₀₎ som en funktion af frekvens, når en 200 Hz sinusbølge indføres i mini-woofer ved en Vpp = 0,15 V.

Figur 8.. 3D colormap konstrueret ved overfladen gridding bruge data normale forskydning indsamlet fra alle steder markeret på PCL stilladset. Dette tal er blevet ændret fra Tong et al. ¹⁰ Copyright 2013 Mary Ann Liebert, Inc.

Figur 9.. Cellelevedygtighed, visualiseret ved levende / død farvning, efter 7 dages vibrationer. Dette tal er blevet ændret fra Tong et al. ¹⁰ Copyright 2013 Mary Ann Liebert, Inc. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 10. Cellulære reaktioner på de vibrerende stimulationer i form af udtryk for vokal fold relevant, ECM gener. Den relative genekspression (fold ændring) er normaliseret til de respektive statiske kontrol på dag 3 og dag 7 (stiplet baseline). **: Signifikant forskel (p <0,05) mellem dag 3 og 7, ^#: ændret væsentligt (p <0,05) i forhold til baseline. Data repræsenterer middelværdien ± standardfejl på middelværdien (SEM, n = 4). To-halet student t-test anvendes til statistisk analyse, med p <0,05 blev betragtet som signifikant difference (samme som nedenfor). Dette tal er blevet ændret fra Tong et al. ¹⁰ Copyright 2013 Mary Ann Liebert, Inc.

Fig. 11. Biokemisk kvantificering af HA (A), opløselig ELN (B) og MMP1 (C) fremstillet af MSC'er dyrket på PCL stillads under Stat og vib betingelser for 7 dage. Samlede mængde af ECM-molekyler pr tør stillads vægt (mg) er repræsenteret som middelværdi ± SEM, n = 4 fra den repræsentative forsøg ^#:. signifikant forøget (p <0,05) sammenlignet med de Stat kontrol. Dette tal er blevet ændret fra Tong et al. ¹⁰ Copyright 2013 Mary Ann Liebert, Inc.

Discussion

Vellykket engineering af funktionelle vokal fold væv in vitro kræver genskabelse af en vocal fold-lignende mikromiljø at mægle adfærd af multipotente celler. Det er generelt accepteret, at væv eller organ strukturer afspejler de funktioner, de skal udføre. ^22. For vokal fold væv er de højfrekvente vibrationer, der opstår under phonation foreslås at være vigtigt for væv modning. I vores undersøgelse, er PCL stilladser bruges til at give et ledbånd-lignende strukturel støtte, mens den vocal fold bioreaktor er designet til at introducere fysiologisk relevante mekaniske signaler til dyrkede MSC. Den her beskrevne (J2) bioreaktor skaber vibrationer elektromagnetisk gennem individuelle højttalere og overfører energi aerodynamisk til de dyrkede celler. I forhold til vores tidligere design, flytter ¹⁸ det nuværende system kilden til vibrations stimulation direkte under hver prøve godt, så fora mere effektiv omdannelse energi. Som følge heraf er en væsentligt større normal forskydning og en højere acceleration opnås ved hjælp af det nuværende system. Det modulære design minimerer også systemets variationer og mekanisk forstyrrelse på tværs af forskellige vibrationer kamre.

Vores design bygger på en silikone membran til at levere de vibrationssignaler. Det er derfor vigtigt at opretholde integriteten membranen og homogenitet. Efter forstadie opløsningen hældes i aluminiumsform, er det ønskeligt at fjerne overskydende væske ved at trække et objektglas over formoverfladen. Konsekvent membraner uden nogen indesluttede luftbobler kan fremstilles ved at sænke hærdetemperatur samtidig øge hærdetid. Derudover kan en 70% ethanolopløsning bruges til midlertidigt at kvælde membran på aluminium-interface for at tillade nem fjernelse af den hærdede silikone. For at imødekomme de cellulære konstruktioner til 3D dynamisk kultur, en centralt placeret tynd rille ir støbt ind i silikone membran, således at PCL stilladser kan perifert forankret i vibration kammeret. Geometrien af ​​rillen er justerbar; således formen af det cellulære konstruktion kan indstilles i overensstemmelse hermed kan bedre efterligne geometri native vokal folder. ^23. Hvis PCL stilladset ikke er stramt fastgjort i siliconemembran de LDV signaler opdaget ved PCL og ved den ydre region på silikone membranen ikke overlappe perfekt. Ved montering af bioreaktoren, er det afgørende, at alle komponenter er sikret og strammet i samme grad, så man undgår uønskede bevægelser og for at minimere kammer til kammer variationer.

For at validere nytten af ​​bioreaktoren, MSC'er dyrket på PCL stilladser og er udsat for intermitterende (AF) vibrationer i 7 dage. De vibrationer over en periode på flere timer hver dag er ansat til at reproducere de talende betingelser for tunge stemme brugere, f.eks professionel synge ter og lærere. ^23. I modsætning til tidligere er rapporteret vokal fold bioreaktorer, vores ikke forårsager nogen skadelig virkning eller fysiologisk traume til cellerne.

De 200 Hz vibrationer findes at forskelligt regulere cellulær produktion af vigtige ECM komponenter. Elastin er en afgørende strukturel protein, der findes i hele vocal fold LP, og giver modstandskraft og elasticitet. ²⁴ Interstitielle amorfe komponenter, såsom HA, bidrage til opretholdelse af en korrekt væv viskoelasticitet og forebyggelse af ardannelse. ^25,26 MSC udsat 7-dags behandling producerer et betydeligt højere beløb af elastin end statisk dyrkede modstykker. HA biosyntese er også følsom over for vibrationer, hvilket bekræftes af qPCR resultater på has1 og ELISA resultater på HA. Disse resultater tyder på, at den vibrationelle stimulation aktiveret af bioreaktoren er befordrende for produktionen af ​​anti-ardannelse molekyler.

jove_content "> Balanced ECM omsætning er afhængig af samtidige matrix deposition og nedbrydning. ^27. Type III collagen er den største retikulære kollagen fibre findes i vokal folder, som giver vævet med bærende egenskaber. ²⁸ De 7-dages vibrationer anvendt heri øge genekspression af Col3A1, men på en størrelsesorden meget lavere end af elastin. Derfor anvendte vibrationer differentielt regulerer cellulære maskineri der er involveret i syntesen af kollagen III og elastin. Interessant MMP1, en ​​af de vigtigste MMP'er er involveret i matrixnedbrydning og vævsomdannelse ²⁷ , er meget følsom over for de vibrerende signaler. Disse resultater stemmer godt med tidligere rapporter om vibrationsinduceret MMP1 opregulering af celler indfanget i en HA-matrix. ^29. Samlet set vibrerende stimulationer genereret af vocal fold bioreaktor dybt mægle MSC-funktioner ved at fremme homeostase af vokal fold-lignende matricer.

Overalt, romanen vocal fold bioreaktor præsenteres her er modulopbygget og brugervenlig, så dynamisk cellekultur, der skal udføres på en reproducerbar måde. Der findes imidlertid flere begrænsninger i den nuværende udformning. Først vibrationsamplituden, er stadig lille, selv om forbedret fra J1-version i forhold til den vocal fold væv. For det andet betyder vores bioreaktor ikke simulere den bilaterale kollision af vokal folder under normal phonation. For det tredje betyder vores fiberholdigt PCL stillads afspejler ikke vævet anisotropi. Fremtidige arbejde er dedikeret til at forbedre design til bedre efterligne de indfødte phonation forhold. I mellemtiden vil blive udforsket optimale ordninger for 3D dynamisk kultur for en vellykket funktionelle vokal fold samling in vitro.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silicone elastomer kit	Dow Corning	Sylgard 184	Cure the membrane at 100 °C for 2 hr
PCL	Sigma Aldrich	440744-500G	Mn ~80 kDa, dissolve O/N
Chloroform	Sigma Aldrich	C7559-5VL
Human bone marrow-derived MSCs	Lonza	PT-2501	Received with passage 2
MSC maintenance media	Lonza	PT-3001	10% FBS in basal media supplemented with L-glutamine, gentamicin and amphotericin
Accutase cell dissociation reagent	Life Technologies	A11105-01
Ethanol	Sigma Aldrich	E7023-500ML
Fibronectin	Sigma Aldrich	F2006-1MG
MMP1 DuoSet ELISA kit	R&D systems	DY901
HA ELISA kit	Echelon Biosciences	K-1200
PBS	Life Technologies	14190-136
Propidium iodide	Life Technologies	P1304MP
Syto-13	Life Technologies	S7575
QuantiTect reverse transcription kit	Qiagen	205311
SYBR Green PCR master mix	Life Technologies	4309155
Replacement speaker	DAYTON audio (via Parts Express)	DS90-8	Paper cone, full range (80-13,000 Hz), 85 dB
Ergo Micro torque screwdriver	Mountz	# 020377	Torque range: 20-120 cN·m
Stereo speaker selector	RadioShack	40-244	Maximum power handling 50 W
Function generator	Agilent	33220A	Frequency range 1 µHz-20 MHz
Power amplifier	PYLE audio	PylePro PT2400	Frequency response: 10 Hz-50 kHz, two speaker channels
Cell culture incubator	Thermo Fisher	Steri-Cult 3307
Syringe pump	New Era Pump Systems	NE-300
High voltage power supply	Spellman	CZE 1000R	Output voltage: 0-30 kV
Scanning electron microscope	JEOL-USA	JSM-7400F
Desk gold sputter coater	Denton Vacuum	DSK00V-0013
Doppler laser vibrometer	Polytec	PDV-100	Non-contact velocity measurement (0-22 kHz)
PCR sequence detection system	Applied Biosystems	ABI7300
Multiphoton confocal microscope	Zeiss	Zeiss 510Meta NLO
UV-VIS Spectrophotometer	NanoDrop Products via Thermo Scientific	ND-2000
VibSoft Data Acquisition Software	Polytec		Acquisition bandwidth up to 40 MHz
Origin 8.5 data analysis software	OriginLab
qbasePlus qPCR data analysis software	Biogazelle	V2.3
Aluminium alloy	McMaster-Carr	Alloy 6061
Acrylic blocks	McMaster-Carr
Polycarbonate anti-humidity chamber	McMaster-Carr		Impact-Resistant Polycarbonate
screws	McMaster-Carr
Electronic cable/wire
Medical grade PVC tubing	US Plastic Corp.	Tygon S-50-HL	Clear, biocompatible
10 ml Syringe	Becton Dickinson	309604
21 G Blunt ended needle	Small Parts	NE-213PL-25	1-1/2" length
Alligator clip adapters	RadioShack	270-354	Fully insulated
8 mm Biopsy punch	Sklar Surgical Instruments	96-1152	Sterile, disposable
12 mm Biopsy punch	Acuderm (via Fisher Scientific)	NC9998681
Tissue culture flasks	Corning		Cell culture treated