Summary
Para aplicaciones futuras como un parche para reparar desgarros parciales del ligamento cruzado anterior (ACL), las células derivadas de ACL humana fueron aisladas de tejido obtenido durante los procedimientos reconstructivos, expandidas in vitro y cultivados en los andamios de ingeniería tisular. A continuación, se realizó la adhesión celular y la morfología para confirmar la biocompatibilidad de la superficie del andamio.
Abstract
La lesión del ligamento cruzado anterior es un problema comúnmente encontrado en los individuos activos. Incluso los desgarros parciales de este intra-articular del ligamento de la rodilla conducir a deficiencias biomecánicas que la función y la estabilidad deterioran. Las opciones actuales para el tratamiento de los desgarros del LCA parciales van desde no quirúrgico, el tratamiento conservador con múltiples opciones quirúrgicas, tales como: la modificación térmica, la reparación de un solo paquete, la reconstrucción completa, y la reconstrucción de la parte dañada del ligamento nativo. Pocos estudios, si los hay, han demostrado un método único para la gestión de ser siempre superior, y en muchos casos los pacientes seguir demostrando la inestabilidad persistente y otras comorbilidades.
El objetivo de este estudio es identificar una fuente de células para la utilización potencial en el desarrollo de un parche de ingeniería tisular que podría implementarse en la reparación de un LCA desgarrado parcialmente. Un nuevo protocolo fue desarrollado para la expansión de las células derivadas de patients sometidos a la reconstrucción del LCA. Para aislar las células, tejido HACL picada obtenida durante la reconstrucción del ACL se digirió en una solución de colagenasa. La expansión se realizó usando medio DMEM/F12 suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina / estreptomicina (P / S). Las células entonces se almacenaron a -80 º C o en nitrógeno líquido en un medio de congelación que consiste de DMSO, de FBS y el medio de expansión. Después de la descongelación, las células HACL derivados fueron luego sembradas en un andamio de ingeniería tisular, de PLAGA (ácido láctico-co-glicólico Poli) y el control de cultivo de tejidos de poliestireno (TCPS). Después de 7 días, SEM se realizó para comparar la adhesión celular a la PLAGA contra el TCPS de control. La morfología celular se evaluó mediante tinción de inmunofluorescencia. SEM (microscopio electrónico de barrido) micrografías demostraron que las células crecieron y se adhirieron sobre ambas superficies de PLAGA y TCPS y fueron confluentes sobre las superficies enteras por día 7. La tinción de inmunofluorescencia mostró morfológica normal, no estresadoAL patrones en ambas superficies. Esta técnica es prometedor para aplicaciones en la regeneración y la reconstrucción de ACL.
Introduction
El ligamento cruzado anterior (LCA) es un ligamento intraarticular comúnmente lesionado de la rodilla. Aproximadamente 200.000 (LCA) se reportan anualmente en los Estados Unidos. Más del 75% de los pacientes que sufren una lesión del LCA opt para la cirugía reconstructiva ortopédica 1,2,3,4. La intervención quirúrgica está indicada a menudo debido a un inherentemente pobre potencial curativo 3. La reconstrucción del ACL se realiza típicamente por medio de un autoinjerto o aloinjerto de tendón. Autoinjerto y aloinjerto representan el estándar de oro para la reconstrucción, ya que cuentan con altas tasas de éxito, y la reparación con sutura primaria, la otra opción de tratamiento, ha mostrado tasas de fracaso de hasta el 94% 5,6,7.
Desgarros parciales del ligamento cruzado anterior representan el 10% y el 28% de todas las rupturas del LCA 8. En un estudio prospectivo, Noyes et al. Estima que el 50% de los pacientes con desgarros parciales que afectan a más de la mitad de la ACL ACL progresó hasta completar insuficiencia después notratamiento quirúrgico 9. Otros estudios reportan persistente inestabilidad y disminución de la función con menos de 30% de los pacientes capaces de volver a su pre-lesión 9,10,11,12,13 nivel de actividad. Las opciones de tratamiento son limitadas e incluyen modalidades conservadoras, la contracción térmica de permanecer ACL, o la reconstrucción del LCA. Recientemente, ha habido un creciente interés en la reparación primaria aumentada. Estas técnicas utilizan productos biológicos para mejorar la reparación de sutura primarios 14. La investigación reciente ha intentado cosechar-mesenquimales como HACL deriva células madre para eludir limitaciones de injerto, 31,32 pero la validez y la eficacia de estas células es todavía desconocido. La fuente de células ideal para aplicaciones de ingeniería de tejidos parece ser no mesechymal HACL deriva células de fibroblastos.
La investigación actual se centra en la identificación de un material de matriz adecuado y fuente de células para el andamiaje de ingeniería. Es un procedimiento estándar para una rotura de ligamentos que ser descartado como doresiduos rgical durante la cirugía de reconstrucción, sin embargo, este ligamento dañado puede ser una fuente de calidad para la adquisición de células necesarias para desarrollar y mejorar un tejido ideal de ingeniería reemplazo ACL. Nuestro laboratorio ha desarrollado un protocolo para la expansión in vitro de estas células derivadas HACL cosechados. El uso de una matriz 2D diseñado infundido con células HACL derivados, hemos diseñado un parche que podrían aumentar la reparación del LCA parcial y fortalecer los ligamentos desgarrados.
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Protocol
1. Recuperación Quirúrgica
Nota: La aprobación IRB se obtuvo para recoger el muñón ACL durante la cirugía de reconstrucción del LCA. Exención IRB fue dado como el muñón ACL utilizados han sido generalmente descartada como desecho quirúrgico. 20 pacientes se utilizaron para recoger el muñón ACL.
- Administrar anestesia general y antibióticos preoperatorios según el protocolo de la institución para el paciente.
- Aplicar el torniquete e inflar 100 mg por encima de la presión arterial sistólica.
- Situar el paciente en posición supina. Haga una incisión anterolateral horizontal con la rodilla en flexión de 30 a 45 ° para un portal de 5 mm e insertar el trocar artroscópica y la cámara en la bolsa suprarrotuliano a 30 °.
- Lleve a cabo una artroscopia diagnóstica de rutina.
- Escriba una muesca y desbridar la sinovial membranosa sobre el LCA roto.
- Use una máquina de afeitar 4,5 mm y ablador para identificar el muñón ACL.
- Utilice un pico de pato recta amarga para recoger múltiples especimens del muñón ACL restante.
- Mantener la muestra en solución salina normal en un recipiente estéril.
- Enviar las muestras a la patología para la decodificación y la entrega final a las instalaciones del laboratorio.
- Recuperar paciente y realizar el cuidado postoperatorio según el protocolo de la institución.
2. Digestión de los tejidos y HACL Aislamiento
- Transferir el tejido del LCA humano recibido de la patología a una placa de Petri con solución salina estéril / PBS (tampón fosfato salino).
- Picar el tejido con tijeras estériles en 1-2 mm de 3 piezas y lavar el tejido picado con solución salina al menos 3 veces.
- Se digiere el tejido picado con 0,4% de colagenasa en DMEM/F-12 (50/50, 1x) medio suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina / estreptomicina durante 4-6 horas a 37 ° C.
- Centrifugar las células a 1000 xg durante 5 minutos y luego volver a suspender las células en el medio.
- Lavar las células con el medio durante 2-3 veces y luego seed / cultura en matraces T-25 durante 2-3 días.
3. Expansión Celular, congelación y descongelación
- Utilice un microscopio de luz para visualizar las células cultivadas durante 2-3 días en un matraz T-25.
- Mantener las células a 37 ° C en la DMEM/F-12 (50/50, 1x) medio suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina / estreptomicina (P / S).
Nota: Cambiar los medios de comunicación cuando las células muestran la adhesión y la morfología normal. Utilice un microscopio de luz para observar las células. - Lavar las células confluentes con PBS en el día 7 (~ 1,3 X 10 6 células / frasco). Añadir tripsina (0,5 g / L) e incubar las células a 37 ° C durante 5 min. Añadir los medios de comunicación a las células en suspensión para neutralizar la tripsina. Divida la mezcla de células de medios entre tres matraces T-25.
- Lavar las células confluentes con PBS, añadir tripsina (0,5 g / L), y volver a suspender en medio de congelación que contiene DMSO, de FBS y el medio completo (medio DMEM/F-12 + 10% de FBS + 1% P / S) en el proporción 01:02:07.
- Tiendalos viales criogénicos a -80 ° C si se utilizan las células dentro de un mes, y en nitrógeno líquido si las células se almacenarán durante un período prolongado.
- Descongele los viales en un 37 ° C baño de agua para su reutilización.
Nota: Típicamente 90-95% de células sobreviven.
4. Fabricación de ingeniería tisular 2-D poli láctico-co-glicólico (PLAGA) Andamios
- Disolver 1 g de PLAGA en 12 ml de diclorometano en un vial de centelleo de 20 ml y agitar la solución durante 8 horas a una velocidad constante (800 rpm).
Nota: Descripción detallada en Gupta et al 15. - Transferir la solución disuelta a una placa de Petri de vidrio forrado con papel de protección fluorado.
- Coloque la placa de Petri bajo una campana de vacío durante 30 min. Agregar la placa de Petri a -20 ° C durante la noche y luego a temperatura ambiente. Colocar las cápsulas de Petri en liofilizador para asegurar la completa evaporación del disolvente para obtener películas delgadas de polímero.
- Coloque la fi polímerolms en un desecador durante 24 horas.
- Cortar las películas de polímero en 12 discos circulares mm de diámetro y almacenarlos en un desecador hasta que se necesite.
5. Microscopía Electrónica de Barrido (SEM)
- Lavar las células (50000 células / disco) se sembraron en la TCPS control y el andamio PLAGA con PBS 7 días después de la siembra.
- Use 1,5% glutaraldehído en tampón cacodilato 0,1 M para fijar las células y 2,5% OSO 4 en 0,1 M de tampón cacodilato de post-fijación.
- Lavar las células fijadas con tampón cacodilato 0,1 M. Secar las células fijadas usando deshidratación serie de etanol (50%, 70%, 80%, 90% y 100%) durante 15 min cada uno, y más seco en hexametildisilazano (HMDS) durante la noche.
- Purgar la cámara del sistema de recubrimiento por pulverización catódica SEM con válvula de botón y levante la placa superior.
- Coloque las muestras secas en la cámara. Baje la placa superior.
- Cambie la perilla de control a la bomba para comenzar a evacuar la cámara.
- Válvula de escape abierto argón. Esperarpara el vacío caiga a 0,05 mbar.
- Cubrir las muestras secas con una capa delgada (0,13 nm) de oro / paladio.
- Devuelva la válvula de escape de argón a su posición cerrada.
- Cambie la perilla de control en off.
- Purgar la cámara con válvula de botón y levante la placa superior.
- Retire las muestras y almacenarlas en un desecador durante 24 horas.
- Tenga en cuenta las muestras en un microscopio electrónico de barrido.
6. Inmunofluorescencia La tinción
- Lavar las células (50000 células / disco) se sembraron en la TCPS control y el andamio PLAGA con PBS 7 días después de la siembra.
- Fijar las células utilizando etanol al 70% (en frío) durante 10 min.
- Se incuban las células fijadas a temperatura ambiente con 1% albúmina de suero bovino (BSA) en PBS que tenía un 0,05% de Triton X-100 durante 20 min.
- Sumergir las muestras en 1% de Tween a temperatura ambiente durante 20 min.
- Añadir el anticuerpo anti-β-actina monoclonal de ratón (1:400) y se incuban las células overnight a 4 ° C.
- Lavar las células con 0,05% de Tween. Añadir anticuerpo secundario (de cabra anti-ratón F (ab ') 2 fragmento de IgG conjugado con una sonda de fluorescencia, 1:400) a las células y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente.
- Se lavan las células con PBS. Teñir las células con tinción nuclear y montar utilizando 80% de glicerol.
- Observar las células bajo un microscopio confocal.
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Representative Results
El modelo de trabajo para la recuperación quirúrgica, la digestión del tejido y aislamiento de la humana ligamento cruzado anterior (HACL) células derivadas se muestra en la Figura 1. Las células que migraron a partir de los explantes y se adhirieron a los matraces T-25. Estas células se cultivaron durante 3 días y luego se visualizaron bajo un microscopio de luz (Figura 2). Una monocapa confluente se obtuvo por día 7. La presencia de células sanas, viables indica la recuperación exitosa y cultivo de células HACL derivados.
La unión celular a la superficie de PLAGA y TCPS se determinó cualitativamente a través de SEM. Figura 3 exhibe la adherencia y proliferación de células HACL derivados de cada superficie del polímero. Confluencia celular se observó para PLAGA y TCPS.
La morfología celular y análisis de adherencia se determinó a través de la tinción de inmunofluorescencia. tinción de β-actina demostró que las células se adhieren HACL derivadosd para y proliferaron sobre la superficie de ambos PLAGA y TCPS. Figura 4 exhibe adhesión polimérica y atenúa la apariencia normal, no estresado de las células HACL.
Figura 1. Una representación esquemática de los pasos involucrados en la recuperación quirúrgica, la digestión del tejido y aislamiento de las células de heridas del ligamento cruzado anterior (ACL) para aplicaciones de ingeniería de tejidos. Durante la cirugía de reconstrucción del LCA, el (los residuos quirúrgica) restante muñón de ACL se recoge y se almacenado en solución salina. El muñón ACL recogidos se pica en trozos de 1-2 mm 3 y se lavó con solución salina. La ACL picada se digiere con una solución de colagenasa al 0,4% en medio DMEM/F-12. Las células se centrifugaron a continuación, se resuspendieron y se cultivaron enMedio DMEM/F-12 a 37 ° C.
Células Figura 2. Humano Ligamento Cruzado Anterior derivados capturados utilizando un microscopio de luz (10X y 20X en zoom). El huso o células de forma alargada se vieron cada vez más en la superficie de la T-25 frascos después de 3 días de cultivo.
Figura 3. Micrografías de SEM de células derivadas ligamento cruzado anterior humanas cultivadas en TCPS control y PLAGA (a 100X, 300X y 1000 aumentos). Las células adheridas, crecieron y fueron confluentes sobre toda la superficie de la PLAGA y the controlar TCPS.
Figura 4. Imágenes de tinción de inmunofluorescencia capturados utilizando un microscopio confocal (a 10X 3.1 zoom). Células derivadas anterior humana ligamento cruzado se tiñeron con β-actina (verde) y nuclear (azul) de tinte. Las células adheridas, crecieron y exhibieron una morfología normal, no estresado en tanto el grupo experimental (PLAGA) y de control (TCPS) superficies.
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Discussion
El objetivo principal de este estudio andamio hACL/2D era utilizar las células obtenidas en un parche para aumentar la reparación primaria del LCA se desgarra parciales. El tratamiento no quirúrgico de las rupturas del LCA parciales puede incluir un breve período de inmovilización, refuerzos, un programa de rehabilitación progresiva, y las evaluaciones de seguimiento regulares 13,16,17. Sin embargo, muchos estudios demuestran que el tratamiento conservador en los atletas se ha asociado con malos resultados y el fracaso. Buckley et al. Evaluaron 25 pacientes con desgarros del LCA parciales en el seguimiento intermedio y encontró que sólo el 44% de los pacientes se reanudó el deporte a su nivel anterior a la lesión, y el 72% reportó síntomas relacionados con la actividad 8. Bak et al. Siguió a 56 pacientes con aislados rupturas del LCA parciales para un promedio de 5,3 años y sólo el 30% de los pacientes reanudaron las actividades previas a la lesión 10. Fritschy et al. Encontraron que 18 de 43 pacientes con desgarros del LCA parciales, evolucionaron a una rotura completa de 5 años de seguimiento11. Estos estudios demuestran la necesidad de técnicas innovadoras para el tratamiento y la reparación de ruptura del LCA parcial.
El objetivo de este estudio es desarrollar un protocolo que ha demostrado una nueva técnica en la que se recogieron las células ACL humana (HACL), la adhesión culta y expuesto a un andamio de ingeniería. Esta técnica es una manera reproducible y fiable para proporcionar una fuente celular potencial para una amplia variedad de investigaciones futuras para la reconstrucción del LCA. Único en estudios previos 31,32, las células derivadas HACL fueron obtenidos a partir de residuos quirúrgicos y no representan mesenquimales HACL deriva de células de fibroblastos.
En este estudio, las células HACL derivados no mesenquimales se aislaron a partir de tejido obtenido durante los procedimientos reconstructivos, expandidas in vitro y cultivados en los andamios de ingeniería tisular. A continuación, se realizó la adhesión celular y la morfología para confirmar la biocompatibilidad de la superficie del andamio. Los estudios futuros deben ofrecer más quaanálisis de proliferación ntitative, tales como la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR) y de células activadas por fluorescencia (FACS), para caracterizar las células aisladas. Además, el análisis cuantitativo de la proliferación se debe utilizar con el fin de determinar qué clase de biomateriales las células HACL aisladas crecen mejor sobre.
La falta de un análisis cuantitativo de estas células HACL es una limitación importante de este estudio. Sin embargo, este es un estudio preliminar y el objetivo de este estudio fue sólo de aislar y expandir las células HACL derivados. Los estudios futuros se implicar estudios de proliferación celular y la caracterización de estas células usando PCR en tiempo real y de FACS. Otra limitación de este estudio es que la cantidad de tiempo necesario para cultivar las células e incorporarlas en el parche requeriría que el paciente se someta a dos procedimientos quirúrgicos. Además, no se ha establecido la capacidad de estas células de ACL humanos derivados de sobrevivir en el líquido sinovial. Los estudios futurosdebe evaluar la capacidad de HACL a proliferar en una construcción de ingeniería tisular en presencia de líquido sinovial.
Este protocolo permitirá la reparación de un LCA desgarrado parcialmente por medio de sutura y andamio 2D. Este protocolo ofrece un sistema de entrega para los fibroblastos HACL a la zona de la herida y al mismo tiempo protege a las células desde el fluido sinovial. Esto podría permitir la reparación funcional y la curación de una rotura parcial del ligamento cruzado anterior, evitando las comorbilidades asociadas con la reconstrucción del LCA. Esta técnica demuestra resultados prometedores e investigación futura mostrará el potencial de esta técnica para la reparación y la reconstrucción de ACL.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer el fondo inicial y el departamento de cirugía de la beca de investigación de la Universidad del Sur de Illinois, Facultad de Medicina; y la beca de la Fundación Memorial Medical.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-103C | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | |
| Collagenase | Gibco | 17018-029 | Store at 4 °C |
| DMEM/F-12 | Cellgro | 10-092-CV | Store at 4 °C. Warm in 37 °C water bath before use. |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10082 | Store at -80 °C |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza | 17-602E | Store at 4 °C |
| Centrifuge Tubes- 15 ml | Corning | 430790 | |
| T-25 flasks | BD Falcon | 3013 | |
| Trypsin-Versene mixture | Lonza | 17-161E | Store at 4 °C. Warm in 37 °C water bath before use. |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | Combustible liquid. Can cause skin, eye and respiratory tract irritation. |
| Cryogenic vials | Corning | 430489 | |
| PLAGA | Purac Biomaterials | Purasorb PLG8523 | Store at -80 °C |
| TCPS disks | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| Dichloromethane | Fisher Scientific | AC36423-0010 | Possible cancer hazard. Store in a dry, cool place. |
| Bytac paper | Saint gobin performance plastics | 1420652 | |
| Scintillation vial | Fisher Scientific | 03-339-21G | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A7906 | Store at 4 °C |
| Tween | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| mouse Anti-β-actin antibody (1° Ab) | Sigma Aldrich | A5441 | Store at -20 °C |
| goat-anti-mouse antibody (2° Ab) | Cell Signaling | 4408 | Store at -20 °C |
| Hoechst dye | Sigma Aldrich | 14530 | Store at -20 °C |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | BP2547-1 | Toxic by inhalation and if swallowed. Causes burns by all exposure routes. |
| Hexamethyldisilazane | Fisher Scientific | AC43085-1000 | Flammable liquid and vapor. Causes burns by all exposure routes. |
| Sterile Scissors | McKesson | 25-716 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Light Microscope | Olympus | CK40 | |
| Water Bath | Thermo scientific | 2845 | |
| Vortex | Labnet | VX-200 | |
| Glass Petri plates | fisher Scientific | S31473 | |
| Acu-Punch | Acuderm Inc. | P1225 | Acu-Punch was used to cut 12 mm disks |
| Cacodylate buffer | Sigma Aldrich | 97068 | Flammable liquid, carcinogen and irritant. |
| Osmium tetraoxide | Sigma Aldrich | 201030 | Highly toxic |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | Harmful if swallowed |
| Ethanol | Decon Labs | 2705 | Keep away from heat, sparks, flame and other form of ignition. |
| General/regional Anesthesia | Amphastar pharmaceuticals | 1% Lidocaine, 0.25% Bupivacaine,Anesthetic agents for induction and maintenance | |
| Antibiotics | Hospira | 0409-0805-01 | Ancef 1 g i.v. |
| Arthroscopy trocar | Smith and Nephew | ||
| Arthroscopy Camera | Smith and Nephew | ||
| Arthroscopic grasper and bitter | Arthrex | ||
| 4.5 mm shaver | Arthrex | ||
| Interference Screws | Arthrex | stainless steel screws | |
| Sputter Coater | Polaron | E5400 |
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