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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

सर्जिकल रिट्रीवल, अलगाव और Published: April 30, 2014 doi: 10.3791/51597
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 2, 4, 1,2,3
1Department of Medical Microbiology, Immunology & Cell Biology, Southern Illinois University School of Medicine, 2Division of Orthopaedics and Rehabilitation, Department of Surgery, Southern Illinois University School of Medicine, 3Department of Electrical and Computer Engineering, Biomedical Engineering Program, Southern Illinois University Carbondale, 4University of Illinois at Springfield

Summary

पूर्वकाल cruciate बंधन (एसीएल) की आंशिक आँसू की मरम्मत के लिए एक पैच के रूप में भविष्य के अनुप्रयोगों के लिए, मानव एसीएल ली गई कोशिकाओं इन विट्रो में विस्तार किया है और ऊतक इंजीनियर scaffolds पर हो पुनर्निर्माण की प्रक्रिया के दौरान प्राप्त ऊतक से अलग थे. सेलुलर आसंजन और आकारिकी तो पाड़ सतह पर biocompatibility पुष्टि करने के लिए प्रदर्शन किया था.

Abstract

एसीएल के लिए चोट सक्रिय व्यक्तियों में एक अधिक सामना करना पड़ा समस्या है. समारोह और स्थिरता क्षीण कि biomechanical कमियों को इस अंतर जोड़ घुटने बंध नेतृत्व की भी आंशिक आँसू. थर्मल संशोधन, एकल बंडल मरम्मत, पूर्ण पुनर्निर्माण, और देशी बंध के क्षतिग्रस्त हिस्से का पुनर्निर्माण: आंशिक एसीएल आँसू के उपचार के लिए मौजूदा विकल्प nonoperative, रूढ़िवादी प्रबंधन से इस तरह के रूप में कई शल्य चिकित्सा विकल्प, को लेकर. कुछ अध्ययनों से, यदि कोई हो, प्रबंधन लगातार बेहतर होने के लिए किसी एक विधि का प्रदर्शन किया है, और कई मामलों में मरीजों को लगातार अस्थिरता और अन्य comorbidities का प्रदर्शन जारी है.

इस अध्ययन का लक्ष्य एक आंशिक रूप से फटे एसीएल की मरम्मत में लागू किया जा सकता है कि एक ऊतक इंजीनियर पैच के विकास में उपयोग के लिए एक संभावित सेल के स्रोत की पहचान है. एक उपन्यास प्रोटोकॉल patie से ली गई कोशिकाओं के विस्तार के लिए विकसित किया गया थाएसीएल पुनर्निर्माण के दौर से गुजर एनटीएस. कोशिकाओं को अलग, एसीएल पुनर्निर्माण के दौरान प्राप्त कीमा बनाया हुआ hACL ऊतक एक collagenase समाधान में पचा गया था. विस्तार 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / एस) के साथ पूरक DMEM/F12 माध्यम का उपयोग कर प्रदर्शन किया था. कोशिकाओं तो DMSO, FBS और विस्तार मध्यम से मिलकर ठंड मध्यम में -80 डिग्री सेल्सियस पर या तरल नाइट्रोजन में संग्रहीत किया गया. विगलन के बाद, hACL निकाली गई कोशिकाओं को फिर एक ऊतक इंजीनियर पाड़, PLAGA (पाली लैक्टिक सह एसिड) और नियंत्रण टिशू कल्चर polystyrene (TCPS) पर वरीयता प्राप्त थे. 7 दिनों के बाद, SEM नियंत्रण TCPS बनाम PLAGA सेलुलर आसंजन तुलना करने के लिए प्रदर्शन किया था. सेलुलर आकारिकी immunofluorescence धुंधला का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था. SEM (स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप) micrographs कोशिकाओं हुआ और PLAGA और TCPS दोनों सतहों पर पालन किया और सुबह 7 से पूरे सतहों पर मिला हुआ गया कि प्रदर्शन किया. Immunofluorescence धुंधला सामान्य, गैर जोर दिया शब्द के भागों से पता चलादोनों सतहों पर अल पैटर्न. इस तकनीक एसीएल उत्थान और पुनर्निर्माण में आवेदन के लिए वादा किया है.

Introduction

पूर्वकाल cruciate बंधन (एसीएल) घुटने की एक सामान्यतः घायल इंट्रा जोड़ बंधन है. लगभग 200,000 (एसीएल) चोटों संयुक्त राज्य अमेरिका में सालाना रिपोर्ट कर रहे हैं. आर्थोपेडिक पुनर्निर्माण सर्जरी 1,2,3,4 के लिए एसीएल चोट ऑप्ट सामना कर रोगियों का 75% से अधिक. शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप के कारण अक्सर एक स्वाभाविक गरीब चिकित्सा संभावित 3 के लिए संकेत दिया है. एसीएल पुनर्निर्माण आम तौर पर एक autograft या allograft कण्डरा के माध्यम से पूरा किया है. वे उच्च सफलता दर है, और प्राथमिक सिवनी मरम्मत, अन्य उपचार के विकल्प के घमंड के रूप में autograft और allograft पुनर्निर्माण के लिए सोने के मानक का प्रतिनिधित्व करते हैं, ऊपर से 94% 5,6,7 की विफलता दर से पता चला है.

एसीएल के लिए आंशिक आँसू सभी एसीएल आँसू 8 से 28% से 10% का प्रतिनिधित्व करते हैं. एक भावी अध्ययन में, Noyes एट अल. अधिक एसीएल के आधे से अधिक प्रभावित करने आंशिक आँसू के साथ रोगियों का 50% के बाद एसीएल कमी को पूरा करने के लिए गैर प्रगति का अनुमान है किऑपरेटिव उपचार 9. अन्य अध्ययनों से लगातार अस्थिरता रिपोर्ट और उनके पूर्व चोट गतिविधि स्तर 9,10,11,12,13 पर लौटने में सक्षम रोगियों के कम से कम 30% के साथ समारोह की कमी हुई. उपचार के विकल्प सीमित हैं और रूढ़िवादी तौर तरीकों, शेष एसीएल के थर्मल दबाव, या एसीएल पुनर्निर्माण शामिल है. हाल ही में, संवर्धित प्राथमिक मरम्मत में रुचि बढ़ा दी गई है. इन तकनीकों में प्राथमिक सिवनी मरम्मत 14 को बढ़ाने के लिए biologics का उपयोग करें. हाल के शोध से mesenchymal की तरह hACL, भ्रष्टाचार सीमाओं को नाकाम करने के लिए 31,32 स्टेम सेल व्युत्पन्न लेकिन इन कोशिकाओं की वैधता और प्रभावकारिता अभी भी अज्ञात है फसल के लिए प्रयास किया गया है. ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए आदर्श सेल स्रोत hACL fibroblast कोशिकाओं व्युत्पन्न गैर mesechymal हो रहा है.

वर्तमान अनुसंधान के लिए एक उपयुक्त सामग्री मैट्रिक्स और इंजीनियर पाड़ के लिए सेल के स्रोत की पहचान करने पर ध्यान केंद्रित किया है. यह सु के रूप में खारिज किए जाने की एक फटे एसीएल के लिए मानक प्रक्रिया हैपुनर्निर्माण सर्जरी के दौरान rgical बेकार, हालांकि, इस क्षतिग्रस्त बंधन एसीएल प्रतिस्थापन इंजीनियर एक आदर्श ऊतक विकसित करने और बढ़ाने की जरूरत कोशिकाओं के अधिग्रहण के लिए एक गुणवत्ता स्रोत हो सकता है. हमारी प्रयोगशाला इन काटा hACL ली गई कोशिकाओं की इन विट्रो विस्तार के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित की है. HACL ली गई कोशिकाओं के साथ संचार के एक इंजीनियर 2D मैट्रिक्स का उपयोग करना, हम संभावित आंशिक एसीएल मरम्मत बढ़ाने और फटे स्नायुबंधन को मजबूत कर सके कि एक पैच तैयार की है.

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Protocol

1. सर्जिकल रिट्रीवल

नोट: एक आईआरबी अनुमोदन एसीएल पुनर्निर्माण सर्जरी के दौरान एसीएल स्टंप एकत्र करने के लिए प्राप्त हुई थी. इस्तेमाल किया एसीएल स्टंप आम तौर पर शल्य चिकित्सा अपशिष्ट के रूप में खारिज कर दिया गया के रूप में आईआरबी छूट दी गई थी. 20 रोगियों एसीएल स्टंप इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल किया गया.

  1. रोगी को संस्था के प्रोटोकॉल के अनुसार सामान्य संज्ञाहरण और पूर्व ऑपरेटिव एंटीबायोटिक दवाओं प्रशासन.
  2. बंधन लागू करें और सिस्टोलिक रक्तचाप ऊपर 100 मिलीग्राम बढ़ा देते हैं.
  3. लापरवाह स्थिति में रोगी बैठा. एक 5 मिमी पोर्टल के लिए 30-45 डिग्री बल में घुटने के साथ एक क्षैतिज अग्रपाश्विक चीरा और 30 डिग्री पर suprapatellar थैली में arthroscopic trocar और कैमरा डालें.
  4. एक दिनचर्या निदान आर्थोस्कोपी प्रदर्शन करना.
  5. एक पायदान दर्ज करें और फटे एसीएल अधिक झिल्लीदार synovium debride.
  6. एसीएल स्टंप की पहचान करने के लिए एक 4.5 मिमी शेवर और ablator का प्रयोग करें.
  7. कई विशेष एकत्र करने के लिए सीधे कड़वा एक duckbill का प्रयोग करेंशेष एसीएल स्टंप से cimens.
  8. एक बाँझ कंटेनर में सामान्य नमक में नमूना बनाए रखें.
  9. डिकोडिंग और प्रयोगशाला की सुविधा के लिए अंतिम वितरण के लिए विकृति के लिए नमूने भेज.
  10. रोगी ठीक हो और संस्था के प्रोटोकॉल के अनुसार पोस्ट ऑपरेटिव देखभाल करते हैं.

2. ऊतक पाचन और hACL अलगाव

  1. बाँझ खारा / पीबीएस के साथ एक पेट्री डिश को विकृति से प्राप्त मानव एसीएल ऊतक स्थानांतरण (फास्फेट खारा buffered).
  2. 1-2 मिमी 3 टुकड़ों में बाँझ कैंची का उपयोग ऊतक क़ीमा और नमक के साथ कम से कम 3 बार कीमा बनाया हुआ ऊतक धो लो.
  3. DMEM/F-12 में 0.4% Collagenase 37 डिग्री सेल्सियस पर 4-6 घंटे के लिए 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक (50/50, 1x) मध्यम के साथ कीमा बनाया हुआ ऊतक डाइजेस्ट
  4. 5 मिनट के लिए 1000 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र और फिर मध्यम में कोशिकाओं resuspend.
  5. एस तो 2-3 बार के लिए माध्यम के साथ कोशिकाओं को धो लें औरeed / 2-3 दिनों के लिए T-25 बोतल में संस्कृति.

3. सेलुलर विस्तार, ठंड और विगलन

  1. एक टी 25 फ्लास्क में 2-3 दिनों के लिए संवर्धित कोशिकाओं कल्पना करने के लिए एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करें.
  2. DMEM/F-12 में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / एस) के साथ पूरक (50/50, 1x) मध्यम बनाए रखें.
    नोट: कोशिकाओं पालन और मानक आकारिकी दिखा जब मीडिया बदलें. कोशिकाओं का पालन करने के लिए एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करें.
  3. सुबह 7 (~ 1.3 x 10 6 कोशिकाओं / फ्लास्क) में पीबीएस के साथ मिला हुआ कोशिकाओं को धो लें. Trypsin (0.5 ग्राम / एल) जोड़ें और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं सेते हैं. Trypsin बेअसर करने के लिए निलंबित कोशिकाओं को मीडिया जोड़ें. तीन टी 25 बोतल के बीच मीडिया सेल मिश्रण विभाजित करते हैं.
  4. Trypsin (0.5 ग्राम / एल) जोड़ने, पीबीएस के साथ मिला हुआ कोशिकाओं को धो लें, और DMSO, FBS और पूरा मध्यम युक्त मध्यम ठंड में resuspend में (DMEM/F-12 मध्यम + 10% FBS + 1% पी / एस) अनुपात 01:02:07.
  5. दुकानकोशिकाओं अब durations के लिए संग्रहीत किया जाएगा यदि कोशिकाओं को एक महीने के भीतर इस्तेमाल किया, और तरल नाइट्रोजन में किया जाएगा अगर -80 डिग्री सेल्सियस पर क्रायोजेनिक शीशियों.
  6. पुन: उपयोग के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में शीशियों पिघलना.
    नोट: आमतौर पर 90-95% की कोशिकाओं को जीवित.

4. 2 डी पाली लैक्टिक सह एसिड (PLAGA) पाड़ इंजीनियर ऊतक का निर्माण

  1. एक 20 मिलीलीटर जगमगाहट शीशी में 12 एमएल dichloromethane में PLAGA की 1 ग्राम भंग और एक स्थिर गति (800 आरपीएम) में 8 घंटे के लिए समाधान भंवर.
    नोट:. गुप्ता एट अल 15 में विस्तृत विवरण
  2. Fluorinated सुरक्षा कागज के साथ लाइन में खड़ा एक गिलास पेट्री डिश को भंग समाधान स्थानांतरण.
  3. 30 मिनट के लिए एक निर्वात हुड के तहत पेट्री डिश रखें. कमरे के तापमान पर रातोंरात और तब -20 डिग्री सेल्सियस पर पेट्री डिश छोड़ दें. बहुलक फिल्मों पतली प्राप्त करने के लिए विलायक का पूरा वाष्पीकरण सुनिश्चित करने के लिए lyophilizer में पेट्री डिश रखें.
  4. बहुलक फाई रखें24 घंटे के लिए एक desiccator में एलएमएस.
  5. 12 मिमी व्यास परिपत्र डिस्क में बहुलक फिल्मों में कटौती और जब तक जरूरत desiccator में उन्हें दुकान.

5. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM)

  1. कोशिकाओं (50,000 कोशिकाओं / डिस्क) धो बोने के लिए 7 दिनों बाद पीबीएस के साथ नियंत्रण TCPS और PLAGA पाड़ पर वरीयता प्राप्त.
  2. कोशिकाओं को ठीक करने और बाद के निर्धारण के लिए 0.1 एम Cacodylate बफर में 2.5% Oso 4 के लिए 0.1 एम Cacodylate बफर में 1.5% glutaraldehyde का प्रयोग करें.
  3. 0.1 एम Cacodylate बफर के साथ तय की कोशिकाओं को धो लें. 15 मिनट प्रत्येक, और रात भर hexamethyldisilazane (HMDS) में आगे सूखे धारावाहिक इथेनॉल निर्जलीकरण (50%, 70%, 80%, 90% और 100%) का उपयोग कर तय कोशिकाओं सूखी.
  4. बटन वाल्व के साथ SEM धूम कोटिंग प्रणाली के कक्ष वेंट और ऊपर थाली बढ़ा.
  5. चैम्बर में सूखे नमूने रखें. शीर्ष प्लेट कम करें.
  6. चैम्बर निकालने शुरू करने के लिए पंप करने के लिए नियंत्रण घुंडी स्विच.
  7. ओपन आर्गन रिसाव वाल्व. प्रतीक्षावैक्यूम 0.05 एम्बार को ड्रॉप करने के लिए.
  8. सोना / पैलेडियम की एक पतली परत (0.13 एनएम) के साथ कोट सूखे नमूने.
  9. इसके बंद की स्थिति को आर्गन रिसाव वाल्व लौटें.
  10. बंद करने के लिए नियंत्रण घुंडी स्विच.
  11. बटन वाल्व के साथ चैम्बर वेंट और ऊपर थाली बढ़ा.
  12. नमूने निकालें और 24 घंटे के लिए एक desiccator में उन्हें दुकान.
  13. एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के अंतर्गत नमूनों का निरीक्षण करें.

6. Immunofluorescence धुंधला

  1. कोशिकाओं (50,000 कोशिकाओं / डिस्क) धो बोने के लिए 7 दिनों बाद पीबीएस के साथ नियंत्रण TCPS और PLAGA पाड़ पर वरीयता प्राप्त.
  2. 10 मिनट के लिए 70% इथेनॉल (ठंड) का उपयोग कोशिकाओं को ठीक करें.
  3. पीबीएस 20 मिनट के लिए 0.05% ट्राइटन X-100 होने में 1% गोजातीय सीरम albumin (BSA) के साथ कमरे के तापमान पर तय की कोशिकाओं को सेते हैं.
  4. 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 1% बीच में नमूनों को विसर्जित कर दिया.
  5. मोनोक्लोनल माउस विरोधी β-actin एंटीबॉडी (1:400) जोड़ें और overnigh कोशिकाओं सेते4 डिग्री सेल्सियस पर टी
  6. 0.05% के बीच के साथ कोशिकाओं को धो लें. कोशिकाओं को माध्यमिक एंटीबॉडी (विरोधी माउस एफ (एबी 'बकरी) एक प्रतिदीप्ति जांच, 1:400 साथ संयुग्मित आईजीजी के 2 टुकड़ा) जोड़ें और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सेते हैं.
  7. पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें. परमाणु दाग ​​के साथ कोशिकाओं दाग और ग्लिसरॉल 80% का उपयोग कर माउंट.
  8. एक confocal खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं का पालन.

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Representative Results

शल्य पुनर्प्राप्ति, ऊतक पाचन और मानव पूर्वकाल cruciate बंधन (hACL) ली गई कोशिकाओं के अलगाव के लिए काम कर मॉडल चित्र 1 में दिखाया गया है. explants से चले गए और T-25 बोतल का पालन कोशिकाओं. इन कोशिकाओं को 3 दिनों के लिए सुसंस्कृत थे और फिर एक प्रकाश माइक्रोस्कोप (चित्रा 2) के तहत कल्पना कर रहे थे. मिला हुआ monolayer सुबह 7 से प्राप्त हुई थी. स्वस्थ, व्यवहार्य कोशिकाओं की उपस्थिति hACL ली गई कोशिकाओं के सफल पुनर्प्राप्ति और संस्कृति को दर्शाते थे.

PLAGA और TCPS की सतह के लिए सेलुलर लगाव SEM के माध्यम से गुणात्मक रूप से निर्धारित किया गया था. प्रत्येक बहुलक सतह पर hACL ली गई कोशिकाओं के 3 प्रदर्शन पालन और प्रसार चित्रा. सेलुलर संगम PLAGA और TCPS के लिए मनाया गया.

सेलुलर आकारिकी और आसंजन विश्लेषण immunofluorescence धुंधला के माध्यम से निर्धारित किया गया था. β-actin धुंधला hACL ली गई कोशिकाओं पालन का प्रदर्शनविकास के लिए और PLAGA और TCPS दोनों की सतह पर proliferated. 4 दर्शाती polymeric पालन चित्रा और hACL कोशिकाओं के सामान्य, गैर जोर देकर उपस्थिति extenuates.

चित्रा 1
चित्रा 1. शल्य पुनर्प्राप्ति, ऊतक पाचन और एसीएल पुनर्निर्माण सर्जरी के दौरान ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों. के लिए घायल पूर्वकाल cruciate बंधन (एसीएल) से कोशिकाओं के अलगाव में शामिल कदम की एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व, शेष (शल्य चिकित्सा अपशिष्ट) एसीएल स्टंप एकत्र की है और कर रहा है खारा में संग्रहीत. एकत्र एसीएल स्टंप 1-2 मिमी 3 टुकड़ों में कीमा बनाया हुआ और खारा से धोया जाता है. कीमा बनाया हुआ एसीएल DMEM/F-12 माध्यम में 0.4% collagenase समाधान से पच जाता है. कोशिकाओं को फिर centrifuged resuspended और सुसंस्कृत हैंDMEM/F-12 मध्यम 37 पर डिग्री सेल्सियस

चित्रा 2
एक प्रकाश माइक्रोस्कोप (10x पर और 20x ज़ूम) का उपयोग कर लिया चित्रा 2. मानव पूर्वकाल cruciate बंधन ली गई कोशिकाओं. धुरी या लम्बी आकार की कोशिकाओं संस्कृति के 3 दिन के बाद T-25 बोतल की सतह पर बढ़ देखा गया था.

चित्रा 3
चित्रा 3. (100x, 300X और 1000 एक्स बढ़ाई पर) नियंत्रण TCPS और PLAGA पर सुसंस्कृत मानव पूर्वकाल cruciate बंधन ली गई कोशिकाओं के SEM micrographs. पालन कोशिकाओं बढ़ी और PLAGA और वीं की पूरी सतह पर मिला हुआ गयाई TCPS नियंत्रित करते हैं.

चित्रा 4
एक confocal खुर्दबीन (10X 3.1 ज़ूम पर) का उपयोग कर लिया चित्रा 4. Immunofluorescence धुंधला छवियों. मानव पूर्वकाल cruciate बंधन ली गई कोशिकाओं β-actin (हरा) और परमाणु (नीला) डाई के साथ दाग रहे थे. पालन ​​कोशिकाओं बढ़ी, और प्रयोगात्मक (PLAGA) और नियंत्रण (TCPS) दोनों सतहों पर एक सामान्य, गैर जोर दिया आकारिकी प्रदर्शन किया.

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Discussion

इस hACL/2D पाड़ अध्ययन के प्राथमिक उद्देश्य आंशिक एसीएल आँसू की प्राथमिक मरम्मत बढ़ाने के लिए एक पैच में प्राप्त कोशिकाओं का इस्तेमाल किया गया. आंशिक एसीएल आँसू की Nonoperative प्रबंधन स्थिरीकरण, ताल्लुक़, एक प्रगतिशील पुनर्वास कार्यक्रम, और नियमित रूप से अनुवर्ती मूल्यांकन 13,16,17 की एक छोटी अवधि शामिल हो सकते हैं. हालांकि, कई अध्ययनों एथलीटों में रूढ़िवादी उपचार गरीब परिणाम और विफलता के साथ संबद्ध किया गया है कि दिखा. बकले एट अल. मध्यवर्ती अनुवर्ती पर आंशिक एसीएल आँसू के साथ 25 रोगियों का मूल्यांकन और रोगियों के केवल 44% उनके पूर्व चोट स्तर पर खेलों को फिर से शुरू किया है, और 72% गतिविधि से संबंधित लक्षण 8 सूचना दी. बक एट अल. 5.3 साल का एक मतलब के लिए पृथक आंशिक एसीएल आँसू के साथ 56 रोगियों का पालन किया और रोगियों के केवल 30% पूर्व चोट गतिविधियों 10 शुरू हुआ. Fritschy एट अल. आंशिक एसीएल आँसू के साथ 43 रोगियों के 18 5 साल की अनुवर्ती से संबंध विच्छेद को पूरा करने के लिए आगे बढ़े पाया कि11. ये अध्ययन आंशिक एसीएल आंसू इलाज और सुधार करने के लिए नवीन तकनीकों के लिए एक की जरूरत का प्रदर्शन.

इस अध्ययन का लक्ष्य मानव एसीएल (hACL) कोशिकाओं काटा गया जिसमें एक उपन्यास तकनीक, एक इंजीनियर पाड़ को सुसंस्कृत और प्रदर्शन पालन दिखा दिया कि एक प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए था. इस तकनीक एसीएल पुनर्निर्माण के लिए भविष्य में जांच की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए एक संभावित सेल स्रोत प्रदान करने के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और विश्वसनीय तरीका है. पिछले अध्ययनों 31,32 के लिए अद्वितीय, hACL ली गई कोशिकाओं सर्जिकल कचरे से प्राप्त किया गया और न mesenchymal hACL fibroblast कोशिकाओं व्युत्पन्न का प्रतिनिधित्व करते हैं.

इस अध्ययन में, गैर mesenchymal hACL ली गई कोशिकाओं इन विट्रो में विस्तार किया है और ऊतक इंजीनियर scaffolds पर हो पुनर्निर्माण की प्रक्रिया के दौरान प्राप्त ऊतक से अलग थे. सेलुलर आसंजन और आकारिकी तो पाड़ सतह पर biocompatibility पुष्टि करने के लिए प्रदर्शन किया था. भविष्य के अध्ययन के आगे योग्यता के रूप में की पेशकश करनी चाहिएइस तरह अलग कक्षों को चिह्नित करना, छंटनी (FACS) वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) और प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल के रूप में ntitative प्रसार विश्लेषण,. इसके अतिरिक्त, मात्रात्मक प्रसार विश्लेषण पृथक hACL कोशिकाओं पर सबसे अच्छा हो जाना biomaterials के जो वर्ग को निर्धारित करने के क्रम में इस्तेमाल किया जाना चाहिए.

इन hACL कोशिकाओं का एक मात्रात्मक विश्लेषण की कमी इस अध्ययन का एक प्रमुख सीमा है. बहरहाल, यह एक प्रारंभिक अध्ययन है और इस अध्ययन का लक्ष्य केवल अलग और hACL ली गई कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए था. भविष्य के अध्ययन के वास्तविक समय पीसीआर और FACS का उपयोग कर इन कोशिकाओं के सेल प्रसार अध्ययन और लक्षण वर्णन शामिल होगी. इस अध्ययन की एक और सीमा समय की राशि संस्कृति के लिए कक्षों की आवश्यकता है और दो सर्जिकल प्रक्रियाओं से गुजरना करने के लिए रोगी की आवश्यकता होगी पैच में उन्हें शामिल है. इसके अलावा, श्लेष द्रव में जीवित रहने के लिए इन मानव व्युत्पन्न एसीएल कोशिकाओं की क्षमता स्थापित नहीं किया गया है. भविष्य के अध्ययनश्लेष तरल पदार्थ की उपस्थिति में एक ऊतक इंजीनियर निर्माण पर पैदा करना hACL की क्षमता का मूल्यांकन करना होगा.

इस प्रोटोकॉल सिवनी और 2 डी पाड़ के माध्यम से एक आंशिक रूप से फटे एसीएल की मरम्मत के लिए अनुमति देगा. इस प्रोटोकॉल घाव साइट पर hACL fibroblasts के लिए एक वितरण प्रणाली प्रदान करता है और साथ ही साथ श्लेष तरल पदार्थ से कोशिकाओं की रक्षा. इस एसीएल पुनर्निर्माण के साथ जुड़े comorbidities परहेज, एसीएल के लिए एक आंशिक आंसू के कार्यात्मक मरम्मत और घाव भरने की अनुमति दे सकता है. इस तकनीक आशाजनक परिणाम को दर्शाता है और भविष्य जांच एसीएल मरम्मत और पुनर्निर्माण के लिए इस तकनीक की क्षमता को प्रदर्शित करेगा.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

लेखकों शुरू हुआ निधि और दक्षिणी इलिनोइस विश्वविद्यालय के स्कूल ऑफ मेडिसिन से सर्जरी अनुसंधान अनुदान विभाग स्वीकार करना चाहते हैं; और मेमोरियल मेडिकल फाउंडेशन अनुदान.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Petri dish Fisher Scientific 08-757-103C
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific BP3994
Collagenase Gibco 17018-029 Store at 4 °C
DMEM/F-12 Cellgro 10-092-CV Store at 4 °C. Warm in 37 °C water bath before use.
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 10082 Store at -80 °C
Penicillin/Streptomycin Lonza 17-602E Store at 4 °C
Centrifuge Tubes- 15 ml Corning 430790
T-25 flasks BD Falcon 3013
Trypsin-Versene mixture Lonza 17-161E Store at 4 °C. Warm in 37 °C water bath before use.
DMSO Fisher Scientific BP231-100 Combustible liquid. Can cause skin, eye and respiratory tract irritation.
Cryogenic vials Corning 430489
PLAGA Purac Biomaterials Purasorb PLG8523 Store at -80 °C
TCPS disks Fisher Scientific 12-545-82
Dichloromethane Fisher Scientific AC36423-0010 Possible cancer hazard. Store in a dry, cool place.
Bytac paper Saint gobin performance plastics 1420652
Scintillation vial Fisher Scientific 03-339-21G
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich A7906 Store at 4 °C
Tween Fisher Scientific BP337-500
mouse Anti-β-actin antibody (1° Ab) Sigma Aldrich A5441 Store at -20 °C
goat-anti-mouse antibody (2° Ab) Cell Signaling 4408 Store at -20 °C
Hoechst dye Sigma Aldrich 14530 Store at -20 °C
Glycerol Fisher Scientific BP229-1
Glutaraldehyde Fisher Scientific BP2547-1 Toxic by inhalation and if swallowed. Causes burns by all exposure routes.
Hexamethyldisilazane Fisher Scientific AC43085-1000 Flammable liquid and vapor. Causes burns by all exposure routes.
Sterile Scissors McKesson 25-716
Centrifuge Eppendorf 5804R
Light Microscope Olympus CK40
Water Bath Thermo scientific 2845
Vortex Labnet VX-200
Glass Petri plates fisher Scientific S31473
Acu-Punch Acuderm Inc. P1225 Acu-Punch was used to cut 12 mm disks
Cacodylate buffer Sigma Aldrich 97068 Flammable liquid, carcinogen and irritant.
Osmium tetraoxide Sigma Aldrich 201030 Highly toxic
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787 Harmful if swallowed
Ethanol Decon Labs 2705 Keep away from heat, sparks, flame and other form of ignition.
General/regional Anesthesia Amphastar pharmaceuticals 1% Lidocaine, 0.25% Bupivacaine,Anesthetic agents for induction and maintenance
Antibiotics Hospira 0409-0805-01 Ancef 1 g i.v.
Arthroscopy trocar Smith and Nephew
Arthroscopy Camera Smith and Nephew
Arthroscopic grasper and bitter Arthrex
4.5 mm shaver Arthrex
Interference Screws Arthrex stainless steel screws
Sputter Coater Polaron E5400

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Johnson, R. J. The anterior cruciate ligament: A dilemma in sports medicine. Int J Sports Med. 3, 71-79 (1982).
  2. Owings, M. F., Kozak, L. F. Ambulatory and inpatient procedures in the United States, 1996. Vital Health Stats. 13, 1-119 (1998).
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जैव अभियांत्रिकी अंक 86 पूर्वकाल cruciate बंधन ऊतक इंजीनियरिंग hACL ली गई कोशिकाओं PLAGA, एसीएल आंशिक आँसू
सर्जिकल रिट्रीवल, अलगाव और<em&gt; इन विट्रो</em&gt; ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए मानव पूर्वकाल cruciate बंधन व्युत्पन्न कोशिकाओं का विस्तार
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Gupta, A., Sharif, K., Walters, M.,… More

Gupta, A., Sharif, K., Walters, M., Woods, M. D., Potty, A., Main, B. J., El-Amin III, S. F. Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications. J. Vis. Exp. (86), e51597, doi:10.3791/51597 (2014).

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