Summary
För att motverka patogen spridning, värdceller omorganisera sin cytoskelettet att compartmentalize bakterier och framkalla autophagy. Använda Shigella infektion av vävnadsodlingsceller, värd och patogen hälsofaktorer som ligger denna process identifieras och karakteriseras. Med hjälp av zebrafisk modeller av Shigella-infektion, är den roll upptäckta molekyler och mekanismer som undersökts in vivo.
Abstract
Shigella flexneri är en intracellulär patogen som kan fly från fagosomer att nå cytosolen, och polymerisera värd aktin cytoskelettet att främja dess motilitet och spridning. Nytt arbete har visat att proteiner involverade i aktin-baserade motilitet också är kopplade till autophagy, en intracellulär process avgörande för cell autonom immunitet nedbrytning. Påfallande, kan värdceller hindra aktin-baserade motilitet S. flexneri genom compartmentalizing bakterier inuti "Septin burar" och rikta dem till autophagy. Dessa observationer tyder på att en mer fullständig förståelse av septins, en familj av trådformiga GTP-bindande proteiner, kommer att ge nya insikter i processen för autophagy. Denna rapport beskriver protokoll för övervakning autophagy-cytoskeleton interaktioner orsakade av S. flexneri in vitro med användning av vävnadsodlingsceller och in vivo med användning av zebrafisk larver. Dessa protokoll möjliggör undersökning av intracellulära mechanisms som styr bakteriell spridning på molekylär, cellulär och hela organismen nivå.
Introduction
Shigella flexneri, en gramnegativ invasiv enteropatogen bakterie, kan fly från fagosomer till cytosolen, och polymerisera värd aktin cytoskelettet att undgå cytosoliska immunsvar och främja inom och inter rörelsen 1,2. Trots förståelsen av aktin-baserade motilitet in vitro 3,4, de mekanismer som begränsar bakteriespridning in vivo har inte fullständigt klarlagda. Detta är avgörande för en mer fullständig förståelse av medfödd immunitet och värdförsvar.
Septins, en mycket konserverad familj av proteiner bland metazoans, är guanosintrifosfat (GTP) -bindande proteiner som monterar in i hetero-oligomera komplex och bildar opolära trådar som associerar med cellmembran och cytoskelettet 5,6. Senaste arbete har upptäckt att infekterade värdceller kan förhindra Shigella aktin baserade motilitet genom compartmentalizing bakterier riktade till autophAGY inne "Septin burar", avslöjar den första cellulära mekanism som motverkar aktin baserade motilitet 7,8. Ett stort öppet fält av utredning ligger nu i "Septin biologi och infektion". Septin montering, som orsakas av en mängd olika patogener (t.ex., Listeria monocytogenes 7,9,10, Mycobacterium Marinum 7,8, Candida albicans 11), kan dyka upp som en nyckelfråga i värdförsvar 5,12.
Autophagy, ett starkt konservativa intracellulär nedbrytningsprocessen, ses som en viktig komponent i cellautonoma immunitet på grund av dess förmåga att leverera cytosoliska bakterier till lysosomen 13,14. Men den roll som bakterie autophagy in vivo begränsar eller främjar bakteriell replikering fortfarande dåligt kända 15,16. Den zebrafisk (Danio rerio) har vuxit fram som ett ryggradsdjur modell för studier av infektioner eftersom det är optiskt tillgängligtpå larvstadier när det medfödda immunsystemet redan är funktionell 17,18. Senaste arbete har präglat känslighet zebrafisk larver till S. flexneri, ett paradigm för bakteriell autophagy 15, och har använt Shigella -zebrafish infektionsmodell för att studera manipulation av autophagy för antibakteriell behandling in vivo 19.
Denna rapport ger nya verktyg och analyser för att studera S. flexneri interaktioner med autophagy och cytoskelettet. I ett första steg, att protokoll övervaka autophagy-cytoskelettet interaktioner beskrivs med Shigella infektion av det humana epiteliala cellinjen HeLa. För att bedöma vilken roll autophagy-cytoskeleton interaktioner på infektionsprocessen Shigella in vitro metoder manipulera autophagy och cytoskeleton komponenter (med siRNA eller farmakologiska reagenser) tillhandahålls. Nytt arbete har visat att genom användning av Shigella infektion of zebrafisk larver, kan liknande analyser användas för att studera cellbiologin för infektion in vivo. Protokoll för att förbereda och infektera zebrafisk larver är detaljerade, och bedöma värd svar på Shigella-infektion in vivo, protokoll för att bestämma värd överlevnad och bakteriebörda infekterade larver finns. Metoder för att övervaka rekryteringen av Septin och autophagy markörer för att Shigella (antingen fast eller levande zebrafisk larver) och metoder för att testa vilken roll dessa processer in vivo [använder morfolinogrupper oligonukleotider (injiceras i 1-4 cell stadium embryon) eller farmakologiska reagens ( till direkt i zebrafisk badvattnet)] diskuteras också. Detta arbetsprogram förväntas ge insikt i de mekanismer som krävs för kontroll av infektion med cytosoliska värdsvar.
Protocol
1. Övervakning Autophagy och cytoskelettet in vitro med användning vävnadskulturceller
- Förbered S. flexneri
- Plansch S. flexneri M90T (vildtyp) från -80 ° C glycerolstam på en kongorött tryptisk kasein soja (TCS) agarplatta. Inkubera över natten vid 37 ° C. Samma platta kan användas för flera experiment.
- Plocka en enskild koloni och växa i 8 ml TCS media i en skakare över natten vid 37 ° C.
OBS: Congo-röd bindning indikerar att virulensplasmid har behållits. - Att subkultur bakterier för exponentiell tillväxt, ympa färska TCS med övernattning bakteriekultur vid 1/80 späd och växa i en shaker vid 37 ° C till OD 600 = 0,3-0,6.
- Snurra bakterie subkultur vid 1000 xg under 5 minuter. Tvätta pelleten med MEM och centrifugera vid 1000 xg under 5 min. Lös pelleten i MEM till OD 600 = 0,3-0,6.
- Förbered HeLa Cells för Infektion
- Väx HeLa-celler i "komplett medium", dvs., MEM plus L-alanyl-L-glutamin kompletterat med 1 mM natriumpyruvat, 0,1 mM icke-essentiell aminosyralösning, och 10% fetalt kalvserum.
- Plate 1-1,5 x 10 5 celler i 6-brunnsplattor 24 eller 48 h före försöket börjar. Platta på täckglas i 6-brunnsplattor för mikroskopi, eller platta på 35 mm glas botten rätter att förbereda sig för levande avbildning.
OBS: (. T.ex., aktin svansar, Septin burar) För att följa autophagy (t.ex. ATG8 / LC3 + ve autophagosomes) och cytoskelettet dynamik i realtid under Shigella-infektion genom att använda levande avbildning, kan vävnadsodlingsceller transient med hjälp GFP-, RFP- eller GFP-märkta konstruktioner (se diskussion).
- Infektion
- Infektera celler med 100: 1 infektions (MOI) av Shigella (OD 600 = 0,3 till 0,6) utspädd i MEM; direkt lägga till HeLa-celler pläterade i 6-wEll plattor 24-48 timmar före infektion (som beskrivs i avsnitt 1.2) i 2 ml MEM (serum svalt).
- För att maximera bakteriell vidhäftning till värdceller, centrifug bakterier och celler vid 700 xg under 10 minuter vid rumstemperatur. Efter centrifugering, inkubera i 30 min vid 37 ° C, 5% CO2 och tillåta infektion att fortskrida.
- Tvätta infekterade celler två gånger med färsk MEM och inkubera med gentamicin innehållande fullständigt medium (50 ^ g / ml, för att eliminera extracellulära bakterier) för 1-4 h beroende på experimentet.
- Fastställande och märkning Infekterade HeLa celler för mikroskopi
- Tvätta infekterade celler två gånger med 1 x PBS, och fastställa till 15 min i 4% paraformaldehyd i 1 x PBS vid rumstemperatur. För att ta bort paraformaldehyd, tvätta celler 2x med 1x PBS.
- Inkubera fixerade celler i 50 mM ammoniumklorid för 10 min vid rumstemperatur. Tvätta en gång med 1x PBS och permeabilize celler i 4 minuter med 0,1% oktylfenol etylenoxid kondensat vid rums temperatur.
OBS: Alternativ till oktylfenol etylenoxid kondensat för permeabilization, såsom saponin eller metanol, kan tillämpas för olika bevarande av cellulära strukturer 20. - Tvätta cellerna i 1 x PBS och inkubera i våt kammare med primära antikroppar mot autophagy kritiska komponenter (t.ex. p62 / SQSTM1) eller Septin cytoskelettet (SEPT2, SEPT6, SEPT7, SEPT9 och Sept11 uttrycks i HeLa-celler) för 30 min (vid rumstemperatur) över natten (vid 4 ° C).
- Tvätta cellerna två gånger med 1 x PBS och inkubera i våt kammare med sekundära antikroppar, och märka filamentöst aktin (F-aktin) med falloidin, för 30 min (vid rumstemperatur) till över natten (vid 4 ° C). För färgning av värdcellkärnor lägg 4 ", 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI).
- Tvätta cellerna i 1x PBS och montera täckglas på objektglas med hjälp av monteringsmedel.
- Mikroskopisk avbildning av Infekterade HeLa-celler
- Till bilden av infsad celler använder en epifluorescens eller konfokalmikroskop och en 63X eller 100X mål att identifiera DAPI-märkt Shigella.
OBS: Som framgår av figurerna 1A - 1C, kan Septin burar visualiseras som ringliknande strukturer, ~ 0,6 mikrometer i diameter, omgivande cytosoliska bakterier polymeriserande aktin och rekryterar autophagy markörer (t.ex. P62 och LC3) 7,8. Däremot kommer bakterier polymeriserande aktin svansar inte i fack av Septin burar och kommer inte att riktas till autophagy 7,8. - Använda en epifluorescens eller konfokalmikroskop och en 63X eller 100X mål, kvantifiera antalet intracellulära bakterier per mikroskopfält. Också kvantifiera antalet bakterier som infångats i Septin burar och riktade till autophagy eller polymerisering aktin svansar och flyr autophagy.
- För att bestämma procentsatsen för bakterier som infångats i Septin burar eller polymeriserande aktin svansar, ta en Z-stack bildserie av infeCTED celler, process bilderna och räkna minst 500-1000 bakterier per försök från minst tre oberoende experiment.
- Till bilden av infsad celler använder en epifluorescens eller konfokalmikroskop och en 63X eller 100X mål att identifiera DAPI-märkt Shigella.
2 Funktionell Analys av Autophagy och Cytoskeleton In Vitro
OBS: Både genetiska och farmakologiska metoder kan användas för att störa autophagy i infekterade vävnadsodlingsceller, och effekterna av dessa behandlingar på infektionsförloppet kan övervakas.
- siRNA-förmedlad Ljuddämpning
- Plate 0,8 x 10 5 HeLa-celler på täckglas av glas i sex-brunnars plattor i fullständigt medium.
- Transfektera följande dag med en lipidbaserad transfektionsreagens med siRNA mot autophagy och / eller cytoskeleton markörer.
- Efter den önskade inkubationstid, infektera cellerna med Shigella som beskrivs i avsnitt 1.3.
- Fix och märka cellerna som beskrivs i avsnitt 1.4.
- Farmakologisk Manipulation
t.ex. för att depolymerisera aktin cytoskelettet användning cytochalasin D eller latrunculin B, att depolymerisera mikrotubuli använder nokodazol, för att blockera aktomyosin aktivitets användning blebbistatin, eller att störa Septin monterings användning forchlorfeneuron. Autophagy kan stimuleras med hjälp av rapamycin eller blockeras genom att använda bafilomycin.- Att manipulera cytoskelettet under Shigella-infektion, först infektera cellerna med Shigella som beskrivs i avsnitt 1.3 och ger tillräckligt med tid för bakterier att komma in i cellerna och fly från phagosome till cytosolen (t.ex..,> 1,5 h efter infektion).
- Späd drogerna från förrådslösningen [stamlösning suspenderade i dimetylsulfoxid (DMSO)] i MEM till en slutlig koncentration av 5 M (cytochalasin D, latrunculin B, nokodazol), 20 M (forchlorfeneuron) eller 50 M (blebbistatin), och behandla celler 30 min vid 37 ° C. Den totala mängden läkemedel (volymen av DMSO / dmatta blandning) sätts per platta / injektionsflaska med celler är 1-5 l (beroende på stamlösning) per 2 ml media. Behandla celler med en liknande dos av DMSO späddes i MEM som en negativ kontroll.
- Fix och märka cellerna som beskrivs i avsnitt 1.4.
OBS: För hantering av autophagic flöde (i infekterade eller icke-infekterade celler), utöka läkemedelsbehandling med hjälp av rapamycin (20 nM) eller bafilomycin (160 nM) 4-12 tim.
- Western Blöt
OBSERVERA: autophagic aktivitet kan kvantifieras genom mätning av proteinnivån autophagy markörer såsom p62 och LC3.- Efter den önskade perioden av inkubering, samla och lysera cellerna för immunblotting. Kör proteinextrakt på 8, 10 eller 14% akrylamidgeler.
- Autophagic flussmedel, dvs. hastigheten av autophagy, kan analyseras såsom beskrivet i 21,22.
- Mikroskopisk Imaging och kvantifiering
- Använda en epifluorescens eller konfokalmikroskop och en 63X eller 100X-objektive, effekten av siRNA eller läkemedelsbehandling på Shigella-infektion kan utvärderas genom kvantitativ mikroskopi (dvs räkna av autophagosomes, Septin burar och aktin svansar) som beskrivs i avsnitt 1.5 och som visas i figurerna 2A och 2B.
3 In vivo avbildning av S. flexneri Interaktion med Autophagy och Cytoskeleton
OBS: zebrafisk modell av Shigella infektion kan användas för att undersöka Septin caging och autophagy in vivo 19.
- Förbered S. flexneri
- Kultur S. flexneri som beskrivs i avsnitt 1.1.
- På OD 600 = 0,3-0,6, spinn 8 ml bakterie subkultur vid 1000 xg under 10 minuter. Tvätta pelleten med 1 x PBS och centrifugera vid 1000 xg under 10 min.
- Resuspendera pelleten i 80 pl av 0,1% fenolrött 1x PBS för att erhålla ~ 2000 bakterier / nl. Håll bacterial förberedelser på is för att bromsa tillväxten.
OBS: Lägga fenolrött hjälper till att visualisera inokulat vid injektion in i larverna.
- Förbered Zebrafish Larver för injektion
OBS: Zebrafisk läggs som ägg och identifieras som embryon tills 72 timmar efter befruktningen, när de kallas larver.- Breed vuxna zebrafisk enligt beskrivningen i Westerfield 23 genom placering av fyra hanar och 8 honor (vanligtvis ett 2: 1 ratio) i en separat akvarium med botten täckta med kulor (som kommer att hindra vuxna från att äta lekt ägg). Alternativt, placera ägget uppsamlingskorgar inne i avelstankar natten innan.
OBS: Ägg befruktas ~ 30 min efter ljuset släcks på i zebrafisk anläggningen 23, och ska samlas så snart som möjligt för att förhindra mögeltillväxt. Ägg insamlingskorgar tjänar till att samla in äggen så att de lätt kan skördas och också skydda äggen från vuxna. - Samla embryots och rengör dem genom att tvätta i embryo media (E2) med 0,003% blekmedel i 10 min. Ta E2 med blekmedel, tvätta embryon 5x i E2 medium och odla embryona i 10 cm petriskål (100 embryon / 50 ml E2 medium) vid 28 ° C.
- Om embryon eller larver kommer att användas för mikroskopi studier vid 24 h efter befruktning lägga 0,003% N-fenyltiokarbamid till E2-medium för att förhindra melanin. Håll embryon vid 28 ° C för normal utveckling.
OBS: Zebrafisk larver är redo för infektion vid 72 h efter befruktningen. - För infektion och mikroskopi förfaranden, söva zebrafisk larver i 200 g / ml tricaine i E2.
- Breed vuxna zebrafisk enligt beskrivningen i Westerfield 23 genom placering av fyra hanar och 8 honor (vanligtvis ett 2: 1 ratio) i en separat akvarium med botten täckta med kulor (som kommer att hindra vuxna från att äta lekt ägg). Alternativt, placera ägget uppsamlingskorgar inne i avelstankar natten innan.
- Beredning av Zebrafish Larver för intravenös och lokal infektion
OBS: För att bedöma zebrafisk överlevnad under Shigella-infektion, utför stjärtfenan intravenösa injektioner. För att visualisera rekryteringen av Septin och autophagy markörer för att Shigella, utföra infektion vid lokala platser som svansen muskeln.- För en caudal intravenös injektion, placera sövda larver i sidled med ryggsidan vänd nålen. Som visas i figur 3A, placera nålspetsen nära (bakre) till urogenitala öppningen, siktar kaudalvenen och tränga igenom huden och leverera den önskade bakterie dos (injektionsvolym 1-5 nl).
OBS: Intravenös infektion är utmanande att utföra och kommer att ta flera veckors utbildning för att bli bekant med den här proceduren. Injektion fenolrött (utan bakterier) för utbildning kommer att bidra till att bedöma injektionsstället ordentligt.
OBS: För Shigella, har dosberoende experiment visat att en infektion låg dos (<1,000 CFU) rensas inom 48 timmar, och en hög dos infektion (> 4000 CFU) leder till värd dödligheten inom 48 timmar 19. - För en svans muskelinfektion, placera sövd larver som beskrivs i avsnitt 3.3.1. Såsom visas i figur 3A, placera nålen carey över muskel somites (dvs. segment av skelettmuskel) och injicera en liten volym (dvs., 1 nl) bakteriell beredning.
- För en caudal intravenös injektion, placera sövda larver i sidled med ryggsidan vänd nålen. Som visas i figur 3A, placera nålspetsen nära (bakre) till urogenitala öppningen, siktar kaudalvenen och tränga igenom huden och leverera den önskade bakterie dos (injektionsvolym 1-5 nl).
- Intravenös injektion av bakterier i Larver
- Dra borosilikatglas mikrokapillärer såsom beskrivs i 24.
- Anslut nålen till innehavaren av den tredimensionella grov manuell manipulator och bryta nålspetsen med fina pincett.
- För att ladda nålen, placera en droppe bakteriekultur på ett täckglas. Slå på microinjector och gas cylinder, något dränka nålspetsen i drop, och fyll upp nålen med den önskade mängden bakteriepreparat.
- För att kalibrera injektionsvolym, placera en droppe mineralolja på ett täckglas och injicera den bakteriella preparatet. Mät diametern av droppen med användning av en mikrometer och beräkna den injicerade volymen [V = (4/3) πr 3].
OBS: Genom att använda injektionsinställningar 40 psi och 50 msek med en bacterial beredning som beskrivs i avsnitt 3.1 kommer att ge ~ 2000 CFU / nl. - Förbered injektionsplattan med hjälp av en plastform som beskrivs i Westerfield 23.
- Överför larver till insprutningsplattan och rada upp dem med hjälp av en fin pensel. Orient och injicera larver som beskrivs i avsnitt 3.3.1.
- För bedömning av zebrafisk överlevnad, överföring infekterade larver individuellt i 24-brunnars plattor i 1 ml E2 / brunn och inkubera vid 28 ° C. Övervaka smittade larver dagligen under de närmaste 2-5 dagarna och tomt överlevnad över tid (Figur 3B).
- Plätering Zebrafish Larver för Bakteriell Kvantifiering
OBS: Arbeta i en steril huva för att undvika kontaminering.- För att utvärdera antalet bakterier injiceras i fisk (vid tiden 0 h efter infektion) och för bakteriell kvantifiering vid önskade tidpunkter, offra zebrafisk larver med en överdos av tricaine (200-500 mg / L). Placera individuella larver i 1,5 ml polypropylene mikrocentrifugrör med 200 ul 0,1% oktylfenol etylenoxid kondensat 1x PBS och mekaniskt homogenisera med hjälp av en mortelstöt.
OBS: För att bekräfta bakteriehalten i injektionsvolym, pumpa lika dos i en steril 1x PBS droppe och platta ut den. - Lägg till en serieutspädning av zebrafisk larver homogenat i sterilt vatten och plattan på lysogeni-buljong (LB) agarplattor. Larver kan beläggas växelvis Congo Red TCS plattor för att skilja mellan Shigella har behållit den virulenta plasmid eller inte.
OBS: Plate 3 eller fler icke-infekterad fisk som en kontroll för att kontrollera status för zebrafisk larver används för infektionen. - Efter inkubering över natt av plattorna vid 37 ° C, räkna bakteriekolonier. Såsom visas i figur 3C, representerar användning av en log-skala.
OBS: Bakteriell belastning under infektion av zebrafisk larver kan också visualiseras med fluorescerande Shigella och mikroskopisk jagmaging som beskrivs i avsnitt 3.7 eller 3.8 (figur 3D).
- För att utvärdera antalet bakterier injiceras i fisk (vid tiden 0 h efter infektion) och för bakteriell kvantifiering vid önskade tidpunkter, offra zebrafisk larver med en överdos av tricaine (200-500 mg / L). Placera individuella larver i 1,5 ml polypropylene mikrocentrifugrör med 200 ul 0,1% oktylfenol etylenoxid kondensat 1x PBS och mekaniskt homogenisera med hjälp av en mortelstöt.
- Zebrafish Larver Immunfärgning
- Vid önskade tidpunkter, offra larverna med hjälp av en överdos av tricaine. Samla fisken i 1,5 ml polypropylen mikrocentrifugrör (10-20 larver / rör).
- Fix larverna med användning 4% paraformaldehyd med 0,4% oktylfenol etylenoxidkondensat i 1x PBS och inkubera i en orbital omrörare (för att undvika larv klustring) under 2 h (vid rumstemperatur) eller över natten (vid 4 ° C).
OBS: Elektronmikroskopi kan användas för ultrastrukturella analyser av infekterade zebrafisk larver. I detta fall bör sövda embryon fastställas och behandlas enligt Mostowy m.fl. 19. - Tvätta 3x i 1x PBS 0,4% oktylfenol etylenoxidkondensat för 5 min, därefter blockera i blockeringslösning (10% fetalt kalvserum, 1% DMSO, 0,1% polyoxietylensorbitanmonolaurat i 1x PBS) under 1 h vid rumstemperatur.
- Diluta den primära antikroppen i blockeringslösning. Lägg larver till utspädd primär antikropp och inkubera över natten vid 4 ° C i en orbital omrörare. Använd primära antikroppar som beskrivs ovan i avsnitt 1.4.3.
- Tvätta larverna 4x för 15 min i 0,1% polyoxietylensorbitanmonolaurat 1x PBS vid rumstemperatur.
- Späd den sekundära antikroppen i blockeringslösning. Lägg larver till utspädd sekundär antikropp och inkubera över natten vid 4 ° C i en orbital omrörare. Använd samma sekundära antikroppar och phalloidin som beskrivs i avsnitt 1.4.4.
- Tvätta 4x för 15 min i 0,1% polyoxietylensorbitanmonolaurat 1x PBS vid rumstemperatur. För färgning av värdcellkärnor lägga DAPI (150 nM slutkoncentration) under det första av dessa 15 min tvättar.
- För bevarande av fluorescensmärkt larver, inkubera dem successivt i en glycerolgradient på 15, 30, 60, och 80% utspädd i 1x PBS och 0,1% polyoxietylensorbitanmonolaurat i 2 h (vid rums humörperatur) till över natten (vid 4 ° C).
OBS: Stained larver kan lagras under långa tidsperioder i 80% glycerol vid 4 ° C (t.ex. fyra månader.).
- Mikroskopisk avbildning av Fast Zebrafish Larver
- Ta fast glycerol inbäddad larver till en liten nedgång på 80% glycerol i en 35 mm petriskål (för stereomikroskopi) eller helt glas nedre skålen (för konfokal miscopy).
- Ta Z-stack bildserie av smittade larver och bearbeta bilderna efter behov.
- Använd en epifluorescens eller konfokalmikroskop och en 10X eller 20X mål för hela organismen avbildning. Använd sedan en konfokalmikroskop och en 40X, 63X eller 100X mål att visualisera enskilda celler och rekryteringen av autophagy och cytoskelettet markörer till enskilda bakterier in vivo 19 (figur 4A och 4B).
OBS: Infect fisk i svansen muskeln och montera i glycerol plant längs botten av glaset nedre skålen för att möjliggöra easy fokus.
- Live Mikroskopisk avbildning av Infected Zebrafish Larver
OBS: Larver är optiskt tillgängliga, därmed in vivo autophagosomes kan visualiseras med hjälp av GFP-Lc3 zebrafisk transgen linje 25. Smitta zebrafisk larver som beskrivs i avsnitt 3.3 och montera enligt beskrivningen i det här avsnittet.- Förbered lågsmältande 1% agaros (LMA) i E2 och låt svalna till 35-37 ° C för att undvika larver skada / dödande. Fördela droppar LMA i en 35 mm petriskål (för stereomikroskopi) eller helt glas nedre skålen (för konfokalmikroskopi).
- Transfer sövda zebrafisk larver individuellt (med så lite vatten som möjligt) till LMA droppar. Orient larver till önskat läge med hjälp av en pensel och vänta agarosen stelna.
- Täck hela skålen ytan med LMA, och overlay med E2 innehåller 200 mikrogram / ml tricaine att undvika preparatet från att torka ut och låta fisken att utbyta syre från vattnet.
- Använd en epifluorescens eller konfokalmikroskop och en 10X eller 20X objektiv för avbildning hela zebrafisk larver. Använd ett konfokalmikroskop och en 40X, 63X eller 100X mål att visualisera bakterie authopagosomes (dvs, GFP-Lc3 + ve vakuoler kring Shigella) in vivo.
- Ta en Z-bunt med infekterade larver över tid (t ex., Varje 2 min under flera timmar) att visualisera autophagosomes och deras dynamik, i realtid.
4 Funktionell Analys av Autophagy och Cytoskeleton In Vivo
OBS: Effekterna av farmakologiska och genetiska störningar i autophagy på infektionsförloppet kan övervakas på hela-djuret nivå och på nivån för den enda cell.
- Autophagy Manipulation av Morfolino Injection
- Rekonstituera morpholino oligonukleotider i sterilt vatten till en stamlösning av 1 mM genom värmning vid 65 ° C under 10 min. Affärvid rumstemperatur.
OBS: morfolino oligo injektioner måste utföras i 1-4 cell stadium embryon. - Förbered morfolino oligonukleotid arbetslösning med steril 0,1% fenolrött i Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning. Fyll nålen enligt beskrivningen i avsnitt 3.4.2., Kan morfolino- oligonukleotid injektionsvolym kalibreras enligt beskrivningen i avsnitt 3.4.3.
OBSERVERA: Fenolrött hjälper att visualisera den injicerade volymen. - Förbered ett embryo-positionering kammare (dvs., Ett objektglas limmas med cyanoakrylat på en petriskål lock 10 cm med kanter som vetter mot nålen delvis bort). Transfer 1-4 cell stage embryon till kammaren med en liten mängd vatten och rikta dem med en fin pensel.
- Penetrera chorion och äggulan smidigt. Väl inne, tryck på pedalen för att injicera den önskade volymen morpholino oligonukleotidlösningen.
OBS: Minimera volymen injektion till 0,5-2 nl; volymer högre than 5 nl kan orsaka utvecklingsdefekter och öka ägget dödlighet. - Efter mikroinjektion, rena embryon (av blekning som beskrivs i avsnitt 3.2) och inkubera dem i en petriskål med E2 vid 28 ° C.
- Smitta 72 timmar efter befruktning kontroll (som t.ex. zebrafisk larver injiceras med kontroll morpholino oligonukleotid) eller P62 morphants (dvs., Zebrafisk larver injiceras med p62 morpholino oligonukleotid) med Shigella som beskrivs i avsnitt 3.4. Bedöm överlevnad och bakteriell belastning för de närmaste 2-5 dagar enligt avsnitt 3.5. Bild fast zebrafisk larver som beskrivs i avsnitt 3.7 och som anges i figur 4C eller bild levande zebrafisk larver som beskrivs i avsnitt 3.8.
OBS: Den effektiva morpholino oligonukleotid dos kan bedömas utifrån dess effektivitet för att hämma avskrift skarvning eller protein translation (se diskussion).
- Rekonstituera morpholino oligonukleotider i sterilt vatten till en stamlösning av 1 mM genom värmning vid 65 ° C under 10 min. Affärvid rumstemperatur.
Representative Results
Vid infektion av vävnadsodlingsceller in vitro, S. flexneri kan fly från phagosome och invadera cytosolen. I cytosolen, kan värdceller hindra aktin baserade motilitet av Shigella genom compartmentalizing bakterier inuti Septin burar (Figur 1A). Bakterier infångade av Septin burar kan också märkas med autophagy markörerna p62 (Figur 1B) och LC3 (Figur 1C). Dessa observationer markera en ny mekanism för värdförsvar som begränsar spridningen av invasiva patogener, och visar också nya länkar mellan autophagy och cytoskelettet. Påfallande, utarmning av autophagy markörer minskar avsevärt Septin placering i kasse av bakterier (figur 2A), och arbetet har också visat att utarmningen av Septin caging minskar rekrytering av autophagy markörer 8 avsevärt. Således, åtminstone i fallet med Shigella Septin buraggregatet och autophagosome formation kan ses som ömsesidigt beroende processer. Andra cellulära krav på uppdelning av Shigella efter Septin burar inkluderar aktin polymerisation och aktomyosin aktivitet (Figur 2B).
Det finns ingen naturlig musmodell av shigellos, och utredning av Shigella patogenes, Septin biologi och bakterie autophagy in vivo kan dra nytta av en ny djurmodell för infektion, zebrafisk larver 19. Det är möjligt att infektera zebrafisk larver genom injicering av bakterier i olika anatomiska ställen såsom kaudala intravenösa injektioner för överlevnad experiment, och stjärtmuskelinjektioner för in vivo-mikroskopi (figur 3A). Beroende på dos, S. flexneri injiceras i zebrafisk larver kan antingen tillsättas inom 48 timmar efter infektion, eller kan leda till en progressiv och slutligen dödlig infektion (figur 3B - 3D). Shigella virulens factors uttrycks vid 28 ° C, varvid den optimala tillväxttemperaturen för zebrafisk, och zebrafisk infektion av Shigella är strikt beroende av dess typ III-sekretionssystemet (T3SS) 19, en viktig virulensdeterminant i human sjukdom. Sammantaget visar dessa observationer tyder på att zebrafisk larv representerar en värdefull ny värd för in vivo analys av Shigella infektion.
Den optiska tillgänglighet zebrafisk larver möjliggör visualisering av Septin caging in vivo (Figur 4A), en bedrift som aldrig tidigare åstadkommits med hjälp av däggdjursvärdmodeller. För att komplettera bevis för att Septin burar snärja bakterier riktade till autophagy in vivo, kan man infektera transgena zebrafisk larver som uttrycker GFP-Lc3 och observera autophagy markör rekrytering till Shigella (Figur 4B). För ultrastrucutral analys av Shigella autophagosomes in vivo elEctron mikroskopi kan användas för att tydligt visa cytosoliska upptag av bakterier genom dubbelmembran vakuoler 19. Autophagy ses som en nyckelkomponent i cell-autonoma immunitet och en avgörande försvarsmekanism mot intracytosolic bakterier 14-16. För att karakterisera autophagy funktion in vivo, kan användas p62 morfolino behandlade zebrafisk larver. Till skillnad från kärn autophagy maskiner [t ex., De 36 autophagy relaterade proteiner (ATG) 26], är p62 inte nödvändigt för ryggradsdjur utveckling 27 och därmed zebrafisk larver kan utvecklas normalt före infektion. Påfallande, p62-utarmat larver ympas med S. flexneri resultat i kraftigt ökad dödlighet och ökad bakteriebörda 19. I samförstånd med in vitro-arbete som visar att Septin buraggregat är beroende av varandra med autophagosome formation 7,8, är Septin rekrytering till Shigella tydligt minskat i p62-utarmat larver ( 
Figur 1. Septin bur in vitro. (A) HeLa-celler infekterades med S. flexneri under 4 h 40 min, fast, märkta med antikroppar mot SEPT9 och phalloidin och avbildas av konfokal microcopy. Skala bar, var en um. (B) HeLa-celler infekterade med S. flexneri under 4 h 40 min, fast, märkta med antikroppar mot p62 och SEPT2 och avbildas av fluorescerande ljus mikroskopi. Skala bar, var en um. (C) HeLa-celler transfekterade med GFP-ATG8 / LC3, infekterade med S. flexneri under 4 h 40 min, fast, märkta med antikroppar mot SEPT2 och avbildas av lysrörs milcroscopy. Skala bar, 1 pm. Dessa siffror har ändrats från Mostowy m.fl. 7. 
Figur 2. Cellular krav för Shigella -septin bur bildning. (A) HeLa-celler behandlades med kontrollen (CTRL), P62, ATG5, ATG6 eller ATG7 siRNA. Hel-cellysat av siRNA-behandlade celler immunblottades för GAPDH, p62, ATG5, ATG6 eller ATG7 att visa effektiviteten av siRNA utarmning (överst). siRNA-behandlade celler infekterade med S. flexneri under 4 h 40 min, fast, och märkt för kvantitativ mikroskopi. Grafer (nederst) representerar medelvärdet% ± SEM av Shigella inne SEPT2 burar från n ≥3 experiment per behandling. (B) HeLa-celler infekterade med S. flexneri, behandlades med DMSO, cytochalasin D (CytD), latrunculin B (LatB), nokodazol (Noco), eller blebbistatin (bleb) och efter 4 tim 40 min fixerades och märkt för kvantitativ mikroskopi. Grafer representerar medelvärdet% ± SEM av Shigella inne SEPT2 burar från två oberoende experiment per behandling. Dessa siffror har ändrats från Mostowy m.fl. 7. 
Figur 3 Den zebrafisk modell av Shigella-infektion. (A) Bilder för att illustrera orienteringen av zebrafisk larv under stereomikroskop. (Vänster panel) Zebrafish larver 72 timmar efter befruktning var placerad i sidled i injektions plattan med sin ryggsidan vänd injektionsnålen. (Middle panel) Blodomlopp infektion utfördes genom injecting bakterierna (röd lösning) i kaudalvenen, posteriort om urogenitala öppningen. (Höger panel) Infektion i svansen muskel utfördes genom injicering av bakterier (röd lösning) över en somit. (B) Överlevnadskurvor av 72 h efter befruktning larver injiceras med olika doser av S. flexneri och inkuberades vid 28 ° C under 48 h efter infektion. Den effektiva ympen klassificerades som låg (<10 3 CFU, öppna cirklar), medium (~ 4 x 10 3 CFU, ofyllda trianglar) eller hög (~ 10 4 CFU, öppna torg). Medelvärde% ± SEM (horisontella staplar) från n ≥3 experiment per ymp klass. (C) Räkning av levande bakterier i homogen från enskilda larver vid olika tidpunkter efter infektion mätt med plätering på LB. Obs, endast larver som överlevt infektionen ingår i uppräkning analys. Medelvärde ± SEM (horisontella staplar) visas också. (D) Distribution av GFP- Shigella bestäms avBildproduktion med hjälp av en fluorescerande stereomikroskop vid olika tidpunkter efter infektion med hjälp av en låg, medelhög eller hög dos inokulat (stjärtfenan intravenösa injektioner). Overlay överföringsbild (grå) och GFP fluorescens (grön) (B) -. (D) Dessa siffror har ändrats från Mostowy m.fl. 19. 
Figur 4. cellbiologi av Shigella-infektion in vivo. (A) Zebrafish larver var smittade i svansen muskeln med GFP- Shigella (låg dos) under 24 timmar, fast, märkt med antikroppar mot SEPT7 (röd) och GFP (green ), och avbildas av konfokalmikroskopi. Skala bar, var 5 pm. (B) GFP-Lc3 zebrafisk larver infekterade med mCherry- Shigella (medium dos) för4 tim, fast, märkt med antikroppar mot mCherry (röd) och GFP (grönt), och avbildas av konfokalmikroskopi. . Scale bar, 1,5 m (C) Zebrafish larver behandlades med antingen kontroll (CTRL, vänstra bilden) eller p62 (högra bilden) morpholinos infekterades med GFP- Shigella i 4 timmar (medelhög dos), fast, märkt med antikroppar mot SEPT7 ( röd) och GFP (grönt), och avbildas av konfokalmikroskopi. Pilar belysa några exempel på Shigella infångats i Septin burar (CTRL) eller inte (p62 utarmat) a 4 timmar efter infektion. Scale bar, 5 | im. Dessa siffror har ändrats från Mostowy m.fl. 19.
Discussion
Vid övervakning autophagy och cytoskelettet in vitro med hjälp av vävnadskulturceller, kan protokollen i avsnitt 1 och 2 tillämpas på en mängd olika vävnadsodlingscelltyper. Dessutom, för att följa autophagy (t.ex. ATG8 / LC3 + ve autophagosomes) och cytoskelettet (t.ex.., Aktin svansar, Septin burar) dynamiken i realtid under Shigella-infektion genom att använda levande avbildning, kan vävnadsodlingsceller transient med hjälp GFP-, RFP- eller GFP-märkta konstruktioner som tidigare beskrivits 7,8. För att öka andelen celler infekterade med Shigella (dvs allmänt önskvärt för realtidsanalys med tanke på att Shigella kan invadera 5-30% av HeLa-celler på 100:. 1 MOI), direkt lägga 400 pl av Shigella (OD 600 = 0,3 -0.6) till celler i 2 ml MEM (serumsvältes) och vänta minst 1,5 timmar efter infektion tillräcklig bakterie posten, fly från phagosome, replikering, autophagy erkännande och Septin placering i kasse. Alternativt kan en använd Shigella M90T AfaI stam som uttrycker adhesinet AfaE och har mycket högre invasions förmågor i epitelceller jämfört med M90T-stammen 28. Att notera, det M90T AfaI stammen har ännu inte testats in vivo med hjälp av zebrafisk. Plattor av Shigella-kolonier kan hållas vid 4 ° C under 2-3 dagar och används för flera experiment. Men med tiden, kolonier av Shigella som har förlorat virulens plasmiden kan också absorbera Kongo Röd och verkar ha behållit sin virulensplasmid. Därför rekommenderar vi att använda färska bakteriella lager när det är möjligt.
Vid övervakning av cellbiologi infektions in vivo, protokoll som beskrivs i avsnitt 3 och 4 använder vildtyp AB line zebrafisk. Om du vill övervaka Shigella -leukocyte interaktioner, kan transgena zebrafisk linjer användas, t.ex. mpx: GFP eller LYZ: DsRed till visuellize neutrofiler 19,29,30 eller MPEG1: mCherry att visualisera makrofager 19,31. Att visualisera autophagy in vivo, kan användas GFP-Lc3 zebrafisk transgen linje 19,24 som beskrivs i avsnitt 3.8.
Att störa autophagy in vivo, måste bedömas experimentellt baserat på dess effektivitet för att hämma avskrift skarvning eller protein översättningen den effektiva morpholino oligonukleotiden dos. Det är lämpligt att utföra en titrering experimentet och bekräfta utarmning av RT-PCR (för skarv morfolino oligonukleotid) eller genom SDS-PAGE (för translationell morfolino oligonukleotid) 32. RNA-isolering från zebrafiskembryon eller larver kan utföras med guanidintiocyanat-fenol-kloroform-extraktion. För att extrahera protein från zebrafisk larver (8 till 15 larver / rör), mekaniskt homogenisera med hjälp av en mortelstöt i 200 pl lyseringsbuffert (1 M Tris, 5 M NaCl, 0,5 M EDTA, 0,01% oktylfenol etylenoxid condensate, och proteashämmare). Centrifugera rören vid 19.000 xg vid 4 ° C under 15 minuter och överför supernatanten till ett nytt rör. Lägg Laemmli-buffert och värma provet vid 95 ° C under 15 min. Lysat kan lagras vid -80 ° C tills det behövs, och kan utvärderas genom Western blotting som beskrivs i avsnitt 2.3.
Den zebrafisk är en utmärkt modell för in vivo drogansökan. Analys med hjälp morfolino oligonukleotider kan kompletteras med etablerade läkemedel för att manipulera autophagy (t.ex. rapamycin och bafilomycin). Oinfekterade och / eller infekterade larver kan behandlas med rapamycin (1,5 pM) eller bafilomycin (80 nM) utspädd i E2 och autophagic flussmedel kan utvärderas med Western blotting såsom beskrivits i 25,33. Kan utvärderas Konsekvensen av autophagy manipulation om resultatet av infektionen och överlevnad smittade larver som beskrivs i avsnitt 3.5.
Förutom att studera värdcellbestämningsfaktorer, in vitro och in vivo-protokoll kan användas för att bedöma bakteriefaktorer som krävs för autophagy erkännande, med hjälp av bakteriemutantstammar som differentiellt erkänns av autophagy, t ex., Shigella ΔicsA (Shigella protein ICSA rekryterar N-WASP och sedan Arp2 / 3 för aktin svans och Septin bur bildning, i sin frånvaro kan det inte finnas några aktin svansar, inga Septin burar) och ShigellaΔicsB (Shigella undviker autophagic svar via den bakteriella effektorprotein ICSB, som förhindrar rekrytering av autophagy maskiner till ICSA, i sin frånvaro Det kan finnas fler Septin burar, mer autophagy) 7,8.
Shigella är inte en naturlig patogen av zebrafisk och växer optimalt vid 37 ° C. Däremot har arbetet visat att virulensfaktorer som krävs för Shigella invasion, fly från fagocytiska vakuolen och replikering i cytosol kan uttryckas och är funktionella i zebrafisk larver vid 28 ° C 19. 28 ° C är den mest vanligen använda temperaturen för zebrafisk uppfödning och standardtemperatur för att säkerställa normal zebrafisk utveckling 23. Påfallande är de stora patogena händelser som leder till shigellos hos människor (dvs makrofager celldöd, invasion och multiplikation i epitelceller, cell-till-cell spridning, inflammatorisk förstörelse av värd epitel) troget i zebrafisk modell av Shigella-infektion 19.
Autophagy och cytoskeleton generna ubiquitously uttryckta och har ett brett spektrum av biologiska funktioner. Mus studier har visat att knockout av väsentlig autophagy 26 eller Septin gener 5 är embryonala dödliga, och det är troligt att en del av dessa gener också kommer att vara avgörande för zebrafisk utveckling (även om detta problem kan minskas av att zebrafisk har fleraparaloga gener 33). Om så är fallet, finns det flera alternativ för att övervinna detta problem, inklusive (i) användning av farmakologiska reagens för att reglera autophagy och cytoskelettet, (ii) morpholinos kan titreras ned, kan (iii) knockout av gener utformas för endast specifik cell typer, och / eller (iv) gener involverade i autophagic erkännande som inte är väsentliga för djurens utveckling (t ex., p62) kan riktas.
Medan zebrafisk är en idealisk modellsystem för att undersöka autophagy och cytoskelettet under Shigella-infektion, är molekylära verktyg för närvarande saknas. Fältet måste skapa nya verktyg och drivcellspecifikt uttryck av proteinerna av intresse. För att slå ner uttryck av autophagy / cytoskeleton gener, nya morfolinogrupper sekvenser behövs, och nya metoder för genomteknik (t.ex. TALEN, CRISPR / Cas9) kan också användas. Under tiden, flera verktyg som tidigare genererats för människa eller mus studierkan lika arbete för zebrafisk.
De intracellulära bakterier S. flexneri har vuxit fram som en exceptionell modellorganism för att ta upp viktiga frågor inom biologi, inklusive möjligheten för bakterier att kännas igen av immunsystemet 1,2. Värdcellen sysselsätter septins att begränsa motilitet av S. flexneri och rikta dem till autophagy, en kritisk komponent i cell autonom immunitet 7,8. Dessa observationer antyder en ny molekylär ramverk för att studera autophagy och dess förmåga att nedbryta cytosoliska bakterier. En viktig fråga är nu att till fullo tolka de underliggande molekylära och cellulära händelser, och för att validera dessa händelser som analyserats in vitro under bakteriell infektion in vivo med hjälp av relevanta djurmodeller. För detta ändamål har zebrafisk etablerats som en värdefull ny värd för analys av S. flexneri infektion 19. Interaktioner mellan bakterier och värdceller kan avbildas med hög upplösning, ochzebrafisk modellen bör visa sig vara användbara för förståelse av cellbiologi av Shigella infektion in vivo. Zebrafisk larver kan användas för att undersöka vilken roll bakterie autophagy i värdförsvaret, och arbete har visat att att den störning av autophagy kan påverka värd överlevnad som svar på Shigella-infektion 19.
Observationerna genereras från studier av Shigella, Septin placering i bur och autophagy in vitro med hjälp av vävnadskulturceller och in vivo med hjälp av zebrafisk larver kan ge grundläggande framsteg i förståelsen värdförsvar. De kan också föreslå att utveckla nya strategier för att bekämpa smittsamma sjukdomar.
En kritisk Syftet med denna rapport är att göra känsla av de molekylära och cellulära händelser som analyserats in vitro (dvs. autophagy, aktin svansar, Septin placering i bur) under bakteriell infektion in vivo i samband med en entire organism, med användning av zebrafisk larver. Om inte bekant med zebrafisk biologi och hantering, kan man hänvisa till i djup protokoll för korrekt zebrafisk djurhållning 23 och in vivo analys av zebrafisk infektion 19,35.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Arbetet i SM laboratoriet stöds av en Wellcome Trust Research Career Development Fellowship [WT097411MA].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bafilomycin A1 | Sigma-Aldrich | B1793 | |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | B0560 | |
| Borosilicate glass microcapillars | Harvard Apparatus | 30038 | |
| Coarse manual manipulator | Narishige | M-152 | |
| Cytochalasin D | Sigma-Aldrich | C6762 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes | D1306 | |
| Dumont #5 fine tweezers | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Forchlorfeneuron | Sigma-Aldrich | 32974 | |
| Goat anti-mouse IgG (H+L) antibody | Molecular Probes | N/A | |
| Goat ant-rabbit IgG (H+L) antibody | Molecular Probes | N/A | |
| JetPEI transfection reagent | Polyplus transfection | 101-01N | |
| Latrunculin B | Sigma-Aldrich | L5288 | |
| LC3 antibody | Novus Biologicals | NB100-2220 | |
| Low melting agarose | Promega | V2111 | |
| MatTek glass bottom dish | MatTek corporation | P35G-1.0-14 | |
| MEM plus L-alanyl-L-glutamine | GIBCO | 41090028 | |
| MEM non-essential amino acids solution | GIBCO | 11140-035 | |
| Microinjector | Narishige | IM-300 | |
| Micropipette puller device | Sutter Instrument Co., Novato, | P-87 | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | P35G-1.0-14 | |
| Monoclonal anti-tubulin, acetylated antibody | Sigma-Aldrich | T6793 | |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | |
| N-phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Phalloidin | Molecular Probes | A12379 | |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 4693116001 | |
| p62/SQSTM1 antibody | Cliniscience | PM045 | |
| Rapamycin | Sigma-Aldrich | R8781 | |
| Sodium pyruvate | GIBCO | 11360039 | |
| Transfection reagent | Life Technologies | 12252-011 | |
| Vectashield hard set mounting medium containing DAPI | Vector Laboratories | H-1500 |
References
- Ashida, H., et al. Shigella are versatile mucosal pathogens that circumvent the host innate immune system. Curr Opin Immunol. 23, 448-455 (2011).
- Phalipon, A., Sansonetti, P. J. Shigella's ways of manipulating the host intestinal innate and adaptive immune system: a tool box for survival. Immunol Cell Biol. 85, 119-129 (2007).
- Welch, M. D., Way, M. Arp2/3-mediated actin-based motility: A tail of pathogen abuse. Cell Host Microbe. 14, 242-255 (2013).
- Haglund, C. M., Welch, M. D. Pathogens and polymers: microbe-host interactions illuminate the cytoskeleton. J Cell Biol. 195, 7-17 (2011).
- Mostowy, S., Cossart, P. Septins: the fourth component of the cytoskeleton. Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 183-194 (2012).
- Saarikangas, J., Barral, Y. The emerging functions of septins in metazoans. EMBO Rep. 12, 1118-1126 (2011).
- Mostowy, S., et al. Entrapment of intracytosolic bacteria by septin cage-like structures. Cell Host Microbe. 8, 433-444 (2010).
- Mostowy, S., et al. p62 and NDP52 proteins target intracytosolic Shigella and Listeria to different autophagy pathways. J Biol Chem. 286, 26987-26995 (2011).
- Mostowy, S., et al. Septins regulate bacterial entry into host cells. PLoS One. 4 (15), (2009).
- Mostowy, S., et al. Septin 11 restricts InlB-mediated invasion by Listeria. J Biol Chem. 284, 11613-11621 (2009).
- Phan, Q. T., et al. Role of endothelial cell Septin 7 in the endocytosis of Candida albicans. mBio. 4 (e00542-13), (2013).
- Mostowy, S., Cossart, P. Septins as key regulators of actin based processes in bacterial infection. Biol Chem. 392, 831-835 (2011).
- Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. Autophagy in immunity and inflammation. Nature. 469, 323-335 (2011).
- Randow, F., MacMicking, J. D., James, L. C. Cellular self-defense: how cell-autonomous immunity protects against pathogens. Science. 340, 701-706 (2013).
- Mostowy, S. Autophagy and bacterial clearance: a not so clear picture. Cell Microbiol. 2 (12063), (2012).
- Mostowy, S., Cossart, P. Bacterial autophagy: restriction or promotion of bacterial replication. Trends Cell Biol. 22, 283-291 (2012).
- Kanther, M., Rawls, J. F. Host-microbe interactions in the developing zebrafish. Curr Opin Immunol. 22, 10-19 (2010).
- Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity. Dis Model Mech. 5, 38-47 (2012).
- Mostowy, S., et al. The zebrafish as a new model for the in vivo study of Shigella flexneri interaction with phagocytes and bacterial autophagy. Plos Path. 9, e1003588 (2013).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Fixation and permeabilization of cells and tissues. Cold Spring Harb Protoc. , (2008).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy. Autophagy. 8, 445-544 (2012).
- Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 140, 313-326 (2010).
- Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). The Zebrafish Book. , 4-5.2, (2000).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. J Vis Exp. 61 (e3781), (2012).
- He, C., Bartholomew, C. R., Zhou, W., Klionsky, D. J. Assaying autophagic activity in transgenic GFP-Lc3 and GFP-Gabarap zebrafish embryos. Autophagy. 5 (4), 520-526 (2009).
- Mizushima, N., Komatsu, M. Autophagy: renovation of cells and tissues. Cell. 147, 728-741 (2011).
- Komatsu, M., et al. Homeostatic levels of p62 control cytoplasmic inclusion body formation in autophagy-deficient mice. Cell. 131, 1149-1163 (2007).
- Nowicki, B., Coyne, K. E., Lublin, D. M., Nowicki, S., Hart, A. Short consensus repeat-3 domain of recombinant decay-accelerating factor is recognized by Escherichia coli recombinant Dr adhesin in a model of a cell-cell interaction. J Exp Med. 178, 2115-2121 (1993).
- Hall, C., Flores, M., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7 (42), (2007).
- Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108, 3976-3978 (2006).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117, 2010-2010 (2011).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6 (9), (2009).
- He, C., Klionsky, D. J. Analyzing autophagy in zebrafish. Autophagy. 6, 642-644 (2010).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 25 (496 (7446)), 498-503 (2013).
- Levraud, J. P., Colucci-Guyon, E., Redd, M. J., Lutfalla, G., Herbomel, P. In vivo analysis of zebrafish innate immunity. Methods Mol Biol. 415, 337-363 (2008).
