zebrafish भ्रूण विकास जीव विज्ञान अनुसंधान के लिए एक शानदार मॉडल है. Embryogenesis दौरान, zebrafish नमूना अवलोकन और विश्लेषण के लिए तीन आयामी चुनौतियां प्रस्तुत करता है, जो एक जर्दी जन, साथ विकसित करना. इस प्रोटोकॉल सीटू (इच्छा) दाग zebrafish भ्रूण नमूनों में पूरे माउंट के दो आयामी फ्लैट माउंट तैयारी बनाने के लिए कैसे करें.
zebrafish भ्रूण अब सामान्य विकास की प्रक्रिया के आनुवंशिक नियंत्रण की जांच के लिए और जन्मजात असामान्यताएं मॉडल पर बुनियादी और जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए प्रयोग किया जाता है. जीवन के पहले दिन के दौरान, zebrafish भ्रूण निषेचन, दरार, gastrulation, विभाजन, और इस तरह के गुर्दे, हृदय, और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के रूप में संरचनाओं की जीवोत्पत्ति सहित कई विकास के चरणों के माध्यम से प्रगति. भ्रूण एक दौर की जर्दी जन के सहयोग से विकसित करता है क्योंकि एक युवा zebrafish भ्रूण की शारीरिक रचना इन घटनाओं के कई में शामिल ऊतकों के दृश्य और विश्लेषण के लिए कई चुनौतियां प्रस्तुत करता. इस प्रकार, सटीक विश्लेषण और tailbud और 20 विखंड चरण में इस तरह के दाग का उपयोग कर उन के रूप में (क्रमश: 10 और 19 घंटे के बाद निषेचन (HPF),), के बीच तय भ्रूण नमूनों में प्रयोगात्मक phenotypes की इमेजिंग के लिए पूरे आईटी, सीटू संकरण (इच्छा) में माउंट जर्दी बी से भ्रूण को निकालने के लिए अक्सर वांछनीय हैसभी और एक गिलास स्लाइड पर फ्लैट स्थित करने के लिए. हालांकि, एक फ्लैट माउंट प्रक्रिया प्रदर्शन कठिन हो सकता है. इसलिए, फ्लैट सफल और कुशल तैयारी बहुत विच्छेदन तकनीक का दृश्य प्रदर्शन के माध्यम से मदद की है माउंट, और भी इष्टतम ऊतक से निपटने में सहायता कि अभिकर्मकों का उपयोग करके मदद की. यहाँ, हम zebrafish भ्रूण में जीन की अभिव्यक्ति का एक या दो रंग का पता लगाने के लिए हमारी इच्छा प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, और फ्लैट बढ़ते प्रक्रिया एक दाग तय नमूना के इस उदाहरण पर प्रदर्शन किया जा सकता है कि कैसे प्रदर्शित करता है. इस फ्लैट बढ़ते प्रोटोकॉल जल्दी zebrafish विकास के दौरान उभरने कि कई भ्रूण संरचनाओं का अध्ययन करने के लिए मोटे तौर पर लागू है, और तय भ्रूण के नमूने पर प्रदर्शन अन्य धुंधला तरीकों के साथ संयोजन के रूप में लागू किया जा सकता है.
zebrafish, Danio rerio, विकास जीव विज्ञान के अध्ययन में एक व्यापक रूप से इस्तेमाल जीव बन गया है. Zebrafish परिवार Cyprinidae से संबंधित एक उष्णकटिबंधीय, मीठे पानी हड्डीवाला प्रजातियों हैं. वे आसानी से प्राप्य सस्ती, और 1 को बनाए रखने के लिए आसान थे के रूप में zebrafish मूल रूप से, संभावित जल प्रदूषण के खतरों के बारे में जानकारी हासिल करने के लिए पर्यावरण अनुसंधान के लिए इस्तेमाल किया गया. पिछले तीस वर्षों में, zebrafish कारणों की मेजबानी के लिए एक आनुवंशिक विनयशील हड्डीवाला मॉडल प्रणाली के रूप में मान्यता प्राप्त हो गया है. Zebrafish स्तनधारियों 2,3 सहित उच्च रीढ़ के साथ शारीरिक और शारीरिक संरक्षण के एक उच्च स्तर दिखा. हाल के जीनोम अनुक्रम टिप्पणी मानव जीन का लगभग 70% कम से कम एक zebrafish समकक्ष 4 है कि पता चला है. उदाहरण के लिए, गुर्दे विकास के दौरान एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं कि कई orthologous जीन इन प्रजातियों 5-7 के बीच पहचान की गई है. इस नाटकीयसेलुलर और आणविक जीव विज्ञान के संबंध के साथ संरक्षण के राजनयिक डिग्री zebrafish 8 में मानव रोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए मॉडल बनाने के लिए शोधकर्ताओं के लिए सक्षम है, और zebrafish रासायनिक आनुवंशिक स्क्रीन 9 का उपयोग संभावित दवा उपचार की पहचान करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण बन गए हैं.
इसके अलावा, zebrafish मॉडल न केवल जटिल विकास की प्रक्रिया और मानव में देखा जाता है कि रोग राज्यों की एक किस्म पुनरावृत्ति, लेकिन कई अतिरिक्त विशेषताओं भी embryological के अध्ययन के लिए एक मॉडल के रूप में जीव अपनी अपील बढ़ाने के लिए सक्षम है. Zebrafish अंडप्रसू हैं और निषेचन 10 के शुरू होने से भ्रूण के लिए आसान पहुँच के साथ शोधकर्ताओं प्रदान करता है जो प्रसारण spawning, के माध्यम से पुन: पेश. अन्य लाभ भ्रूण आकार, पारदर्शिता, और तेजी से, बाह्य विकास 10 में शामिल हैं. इसके अतिरिक्त, zebrafish वयस्कों उच्च उपजाऊपन के अधिकारी और आम तौर पर 200-500 के बीच लेकर कर सकते हैं कि अपेक्षाकृत बड़े क्लच आकार का उत्पादनप्रति सप्ताह, अंततः आसानी 9 के साथ इस तरह के phenotype आधारित रासायनिक स्क्रीन के रूप में उच्च throughput प्रयोगों, प्रदर्शन करने के लिए शोधकर्ताओं को सक्षम.
फिर भी, zebrafish मॉडल के आधार पर प्रदर्शित कर रहे हैं कि फायदे की अधिकता के बावजूद, विश्लेषण और जल्दी विकास के चरणों से प्राप्त प्रयोगात्मक परिणामों के संचार से संबंधित चुनौतियों का सामना कर रहे हैं. कुछ मामलों में, zebrafish भ्रूण के निहित शारीरिक रचना एक के डेटा के दृश्य अस्पष्ट सकता है. विकास 11 प्रगति के रूप में निषेचन के बाद, प्रारंभिक सेल कई दरार घटनाओं आए. Gastrulation के बाद भ्रूण अक्ष यह जर्दी 11 के आसपास लिपटे है कि इस तरह के tailbud चरण (10 HPF) पर उभर रहे हैं. बाद के विकास के विभाजन की अवधि के माध्यम से प्रगति, ट्रंक जन में आगे बढ़ने और भी अक्षीय बढ़ाव से लंबा होगा जर्दी के एक हिस्से के साथ एक पूंछ ही थैली केंद्रीय जर्दी जन से बाहर का विस्तार है कि इस तरह के11. Tailbud और 20 विखंड चरण (19 HPF) के बीच, इस तरह की इच्छा के रूप में विभिन्न धुंधला प्रोटोकॉल, के उपयोग के बाद विशिष्ट विकासात्मक सुविधाओं का निरीक्षण करने के लिए प्रयास करता है, दोनों की वजह से भ्रूण और अस्पष्टता की ज्यामिति को कल्पना और तस्वीर के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है जर्दी थैली. इन चुनौतियों को खत्म करने के लिए एक तरह की जर्दी को हटाने और फिर एक और अधिक सरल तरीके से विश्लेषण किया जा सकता है कि एक दो आयामी नमूना में भ्रूण समतल करने के लिए है.
निम्नलिखित प्रोटोकॉल और वीडियो संसाधनों सफलतापूर्वक deyolk और फ्लैट एक या दो रंग इच्छा धुंधला के उदाहरण का उपयोग, निर्धारण और धुंधला निम्नलिखित एक भ्रूण माउंट करने के लिए एक गाइड प्रदान करते हैं. काश संरक्षित नमूनों में विशिष्ट न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने में सक्षम बनाता है और इस प्रकार के ऊतकों के भीतर पता लगाया जा जीन अभिव्यक्ति की साइट (ओं) के लिए अनुमति देता है एक व्यापक रूप से इस्तेमाल तकनीक है. काश तकनीक बड़े पैमाने पर वर्णित किया गया है, और विभिन्न रंग substrates के रूप में अच्छी तरह से किया जा सकता है फ्लूorescent पता लगाने प्रणालियों 12-20. यहाँ हम विकास की tailbud और विभाजन चरणों के बीच zebrafish भ्रूण के लिए इस्तेमाल हमारे संशोधित इच्छा प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. नीचे प्रोटोकॉल के शुरू में के रूप में विख्यात वैकल्पिक इच्छा प्रोटोकॉल, हालांकि, यहां वर्णित फ्लैट माउंट प्रक्रिया के साथ संगत कर रहे हैं. इसके अलावा, फ्लैट बढ़ते इस तरह के प्रोटोकॉल में वर्णित नहीं कर रहे हैं, जो पूरे माउंट immunohistochemistry, या सेल वंश ट्रैकिंग लेबल, के रूप में मौजूदा दृश्य तकनीकों के किसी भी संख्या के साथ संयोजन के रूप में उपयोग किया जा सकता है. कुल मिलाकर, फ्लैट बढ़ते की तकनीक बेहतर zebrafish में भ्रूण के विकास के प्रारंभिक चरणों के साथ प्रयोगों से प्राप्त आंकड़ों के बेहतर विश्लेषण और प्रस्तुति सक्षम कर सकते हैं.
Zebrafish हाल के वर्षों के दौरान अनुसंधान समुदाय भर में एक बहुत ही मूल्यवान मॉडल जीव साबित किया है. Zebrafish उच्च रीढ़ के साथ कि आनुवंशिक संरक्षण का एक बड़ा डिग्री दिखा रहे हैं, और उनके शरीर रचना विज्ञान, प्रजनन, और जीवन चक्र से संबंधित फायदे प्रयोगात्मक विश्लेषण करने के लिए इस प्रजाति बहुत उत्तरदायी बनाते हैं. इसके अलावा, zebrafish के लिए लागू आणविक तकनीक की उन्नति के आगे वैज्ञानिक अनुसंधान में इस मॉडल जीव के प्रयोग को बढ़ावा दिया है. उदाहरण के लिए, ट्रांसजेनिक zebrafish लाइनों की एक विशाल विविधता रोग प्रगति का अध्ययन करने और जीवोत्पत्ति सहित विकास की कुंजी तंत्र कायम करना है कि कई मौलिक सवालों के जवाब देने के लिए उत्पन्न किया गया है.
तदनुसार, रोग और विकास के अनुसंधान दोनों में zebrafish के गतिशील उपयोग पर आधारित, सेल लेबलिंग के तरीके और संकेत मात्रा का ठहराव डेटा का विश्लेषण का एक महत्वपूर्ण पहलू हैं. जबकि फ्लोरोसेंट एक है कि रोजगार के तरीकोंtibodies ट्रांसजेनिक zebrafish में प्रोटीन अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, शोधकर्ताओं आम तौर पर एक निश्चित, गैर ट्रांसजेनिक zebrafish नमूने में जीन टेप के spatiotemporal स्थानीयकरण की जांच करना चाहते हैं 12-16 की तरह मानक प्रक्रियाओं पर भरोसा करते हैं. वास्तव में, काश जीव विज्ञान में 16 में सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया तकनीकों में से एक है, और आनुवंशिक परिवर्तन और रासायनिक आनुवंशिक perturbations के phenotype विशेषताएँ इस्तेमाल एक महत्वपूर्ण उपकरण है. फिर भी, काश संभावित नुकसान और चुनौतियों का एक संख्या के साथ जुड़ा हुआ है. Antisense ribroprobe की विशिष्टता की पुष्टि, भावना riboprobes antisense riboprobe धुंधला पैटर्न की विशिष्टता का आकलन करने के लिए एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. वर्गों 4 और 5 लेबलिंग और fluorescein लेबल जांच के बाद digoxygenin लेबल जांच का पता लगाने के क्रम में प्रस्तुत कर रहे हैं, यह क्रम उलट हो सकता है. आमतौर पर, कमजोर संकेतों (कम अभिव्यक्ति के स्तर के साथ जीन) अच्छी digoxygenin लेबल जांच और इस दाग से पता चला रहे हैंपता लगाने और लाल सब्सट्रेट का उपयोग मजबूत संकेत (अधिक बहुतायत व्यक्त जीन) के धुंधला के बाद बैंगनी सब्सट्रेट, के साथ पहली बार विकसित की है. दो रंग प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन होने जा रहे हैं हालांकि, अगर यह लेबल और substrates के विभिन्न संयोजनों डेटा संग्रह और विश्लेषण के लिए सबसे उपयुक्त है कि प्रक्रिया को खोजने के लिए जांच की जाती है कि सिफारिश की है. इसके अलावा, कई बार, 4-5 24 घंटे के बाद निषेचन की तुलना में छोटी भ्रूण के लिए सिलवाया रहे वर्गों में प्रदान की एंटीबॉडी ऊष्मायन और धोने रोकने के लिए प्रदान की जाती; पुराने भ्रूण के साथ ही इन कदमों का लंबा अंतराल नमूना पर नमक संचय के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. मानक zebrafish भ्रूण इच्छा समस्या निवारण के लिए व्यापक सुझावों पहले से ही साहित्य 12-16 में दर्ज किया गया है. यकीनन सबसे आम दुविधा उच्च पृष्ठभूमि है. हम अगर जरूरत रातोंरात MABT 'सुपर धोने' के अलावा हमारे अनुभव में, हालांकि, चरण 4.7 15-20 washes में MABT washes की संख्या बढ़ाने की सिफारिश4.8 चरण के लिए आगे बढ़ने से पहले 10 या अधिक कम MABT washes के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जब उत्कृष्ट परिणाम देता है. एक अन्य उदाहरण दुविधा लंबा riboprobes साथ हो सकता है जो गरीब जांच घुसपैठ है. क्षारीय hydrolysis के माध्यम से 3.6 कदम निम्नलिखित riboprobe कर्तन इस प्रतिक्रिया कर सकते हैं. युवा नमूनों के साथ हमारे अनुभव में, जांच के बाल काटना आम तौर पर आवश्यक नहीं है. हालांकि, एक यह एक इच्छा प्रयोग के परिणाम में कारकों योगदान किया जा सकता है जैसे मानकों कि ध्यान में रखना चाहिए, और हम जरूरत के रूप में अपने खुद में इच्छा के लिए प्रयोगात्मक मापदंडों को परिष्कृत करने के लिए समुदाय में पहले से ही सार्वजनिक रूप से उपलब्ध इन उपयोगी समस्या निवारण निर्देश की परीक्षा का सुझाव शोध 12.
पारंपरिक इच्छा तकनीक 12-16 के अलावा, काश के तरीके और तैयार किया गया है कि वैकल्पिक प्रोटोकॉल के क्षेत्र में प्रगति की एक निरंतर उद्भव हुआ है. ये ऐसे fluores के उपयोग के माध्यम के रूप में संकेत का पता लगाने के नए तरीके, शामिलcence 17-19, microRNAs 20 का स्थानीयकरण कि सक्षम तरीकों के लिए. दाग (एस) आसानी से एक वांछित समय बिंदु पर ब्याज का नमूना भीतर देखे जा नहीं सकते हैं फिर भी, वर्तमान सेल लेबलिंग तरीकों के लिए बनाया गया है कि कई सुधार के बावजूद, इन प्रक्रियाओं के प्रभाव को नकार रहे हैं. इस सीमा संभवतः इन बार में उठता है कि विभिन्न विकास की प्रक्रिया के बारे में हमारी समझ में अंतराल को ले जा सकता है, जो यह zebrafish व्यक्तिवृत्त की जल्दी भ्रूण चरणों से संबंधित है, खासकर जब शोधकर्ताओं के लिए समस्याग्रस्त है. सामान्य zebrafish विकास के दौरान, जर्दी थैली उत्तरोत्तर भ्रूण उम्र 11 के रूप में आकार में कमी होगी. भ्रूण उसके आसपास की जर्दी थैली की तुलना में बड़ा है इसलिए, क्योंकि इन बाद में विकास के चरणों (> 24 घंटे के बाद निषेचन) में, काश धुंधला का विश्लेषण करने के लिए काफी सरल है. बहरहाल, यह (प्रारंभिक somitogenesis पूंछ कली मंच से मामला नहीं है जब भ्रूणअपारदर्शी जर्दी थैली कभी कभी दाग के दृश्य अस्पष्ट कर सकते हैं, जहां बड़े पैमाने पर) की जर्दी के आसपास तैनात है. नतीजतन, फ्लैट बढ़ते की विधि (चित्रा 1 और चित्रा 2 में schematized) जल्दी zebrafish भ्रूण नमूने के लक्षण वर्णन के साथ जुड़े इमेजिंग और डेटा विश्लेषण की समस्याओं को दूर करने में मदद करने के लिए तैयार किया गया था, और मोटे तौर पर अलग आनुवंशिक परिवर्तन के व्यवस्थित phenotyping के बाद से इस्तेमाल किया गया है पहली बार बड़े पैमाने पर आनुवंशिक स्क्रीन 21 से.
फ्लैट बढ़ते तकनीक के आगमन के बाद से, जल्दी विकास के चरणों का विश्लेषण काफी बढ़ाया गया है. जर्दी भ्रूण से निकाले जाने के बाद, यह इमेजिंग के लिए वांछित अभिविन्यास में एक गिलास स्लाइड पर भ्रूण फ्लैट करना संभव है. इस दो आयामी स्थिति नमूना बारी बारी से करने की आवश्यकता समाप्त, जो एक ही बार में पूरे भ्रूण के देखने के लिए सक्षम बनाता है. कई ऊतकों जैसे भ्रूण की व्यापक डोमेन में स्थित हैंरक्त और गुर्दे कि फार्म व्यापारियों. इसके अलावा, एक एक समय में कई अलग विकासशील ऊतकों की तुलना करने की जरूरत पड़ सकती है. फ्लैट बढ़ते एक साथ इस तरह के सेल समूहों के पूरे डोमेन को देखने के लिए, और इस प्रकार बहुत तरह के एक ऊतक या कोशिकाओं की गिनती के लिए एक क्षेत्र के माप के रूप में quantifications सहायता कर सकते हैं शोधकर्ता सक्षम बनाता है. इस तकनीक को अंततः hematopoiesis, neurogenesis, और जीवोत्पत्ति के अंतर्निहित महत्वपूर्ण विकास तंत्र की एक किस्म के विषय में कई खोजों के लिए नेतृत्व में मदद मिली है. इस प्रकार, एक बार में महारत हासिल है, शोधकर्ताओं के लिए इस सरल तकनीक के लिए आवेदन पत्र काफी महत्वपूर्ण हैं.
उदाहरण के लिए, hematopoiesis दौरान वंश चुनाव की जांच के अध्ययन में, फ्लैट 14 और 18 विखंड चरणों (एसएस) में zebrafish भ्रूण की तैयारी माउंट के बीच PU.1 जस्ता उंगली प्रतिलेखन कारक की अभिव्यक्ति पैटर्न में किए गए परिवर्तनों को वर्णन करने के लिए इस्तेमाल किया गया जंगली प्रकार और GATA1 morpholino भ्रूण 22 इंजेक्शन.इस विधि GATA1 सबसे अधिक संभावना इस समय बिंदु के आसपास मध्यवर्ती सेल द्रव्यमान (आईसीएम) में PU.1 की अभिव्यक्ति को विनियमित करने का संकेत है कि, 18 एसएस में एक विस्तारित PU.1 डोमेन का पता लगाने में सक्षम बनाया. – / – Gtpbp1 और epsin सहित विभिन्न एर्य्थ्रोइद जीनों के लिए दाग अतिरिक्त फ्लैट घुड़सवार भ्रूण GATA1 थे कि VLT म्यूटेंट में इन जीनों की अभिव्यक्ति में एक नुकसान का प्रदर्शन किया. आगे के विश्लेषण biklf और Gata गतिविधि के स्वतंत्र होने के लिए जाने जाते थे कि testhymin तरह erythoid जीनों की अभिव्यक्ति में कोई परिवर्तन नहीं दिखाई. इसलिए, उनके अन्य प्रयोगात्मक परिणामों के साथ संयोजन के रूप में, यह GATA1 myelo-एर्य्थ्रोइद वंश के भीतर कोशिकाओं की भिन्नता को विनियमित करने में आवश्यक है कि पता चला था. तंत्रिका शिखा विकास के एक अध्ययन में, फ्लैट mounts एक अध्ययन में (भीड़ M610) म्यूटेंट मोंट ब्लांक में crestin अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गयामोंट ब्लांक और tfap2a जीन समारोह 23 की भूमिका की जांच. 10 और 20 एसएस में crestin अभिव्यक्ति पूरी तरह से सिर में निराकृत किया गया था और अंततः मोंट ब्लांक के महत्व और tfap2a विनियमन पर समाप्त करने के लिए इस समूह को सहायता, सामान्य प्रकार के जंगली अभिव्यक्ति की तुलना में भीड़ M610 म्यूटेंट के ट्रंक क्षेत्र में कमी आई थी तंत्रिका शिखा गठन के दौरान. इसके अतिरिक्त, जीवोत्पत्ति के मामले में, फ्लैट mounts pronephros के रूप में जाना zebrafish भ्रूण गुर्दे के विकास के दौरान जल्दी गुर्दे पूर्वज क्षेत्र में अलग डोमेन की मौजूदगी की खोज के लिए सक्षम है. zebrafish भ्रूण गुर्दे progenitors pronephros कि शामिल नेफ्रॉन कार्यात्मक इकाइयों को जन्म दे कैसे अध्ययन करने के लिए एक संरक्षित और अभी तक anatomically सीधा प्रणाली, nephrogenesis 6,7 के रूप में जाना जाता प्रक्रिया (चित्रा 4) प्रदान करता है. फ्लैट माउंट विश्लेषण पुनः के दस्तावेज़ डोमेन के लिए उपयोगी हो गया हैएनएएल progenitors और पहले से अनजान था जो (चित्रा 5), 6,7 patterning pronephros दौरान आरए संकेतन में परिवर्तन के परिणाम काटना. साथ में ले ली, इन उदाहरणों को इस फ्लैट सामान्य विकास और रोगग्रस्त राज्यों के दौरान होने वाले विविध प्रक्रियाओं के अध्ययन में प्रोटोकॉल माउंट के लिए कई व्यापक आवेदन वास्तव में सुझाव है कि वहाँ.
धारणा, इस फ्लैट माउंट प्रक्रिया समग्र काफी सरल है. हालांकि, इस पद्धति मास्टर करने के लिए आवश्यक कौशल की जोड़तोड़ और डिग्री दृश्य प्रदर्शन की अनुपस्थिति में मास्टर करने के लिए काफी चुनौतीपूर्ण हो सकता है. इसलिए, इस प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं, बेहतर इस तकनीक का प्रदर्शन और ऊतक निपटने का अनुकूलन कर सकते हैं कि अभिकर्मकों पर हमारी सलाह को साझा करने के लिए समझने का अवसर के साथ zebrafish मॉडल के लिए नया है, खासकर उन सक्षम करने के लिए संकलित किया गया था. हम इस प्रोटोकॉल अंततः समुदाय में दूसरों यू होने के लिए सबसे आदर्श नमूना शर्तों को परिष्कृत करने की अनुमति देगा कि आशाSED प्रीमियम इमेजिंग, डेटा विश्लेषण, और प्रकाशनों में उनके परिणामों के संचार के लिए. अंत में, इस प्रयोगात्मक परिणामों की प्रस्तुति अस्पष्ट कर सकते हैं, जो जल्दी embryogenesis दौरान zebrafish के संरचनात्मक बाधाओं पर काबू पाने के लिए सक्षम शोधकर्ताओं, और इस सरल लेकिन महत्वपूर्ण तकनीक के उपयोग के माध्यम से इन का समाधान करना चाहिए.
The authors have nothing to disclose.
इस काम आंशिक रूप से निम्नलिखित में से प्रत्येक से रॉ को धन के द्वारा समर्थित किया गया था: एनआईएच अनुदान K01 DK083512, DP2 OD008470, और R01 DK100237; 5 FY12-75 ऑफ डाइम्स तुलसी O'Connor स्टार्टर विद्वान अनुदान पुरस्कार # के मार्च; विज्ञान और जीव विज्ञान विभाग के नोट्रे डेम कॉलेज के विश्वविद्यालय से धन शुरू. हम विशेष रूप से स्टेम सेल अनुसंधान को बढ़ावा के लिए नोट्रे डेम विश्वविद्यालय के लिए एक उदार उपहार प्रदान किया, जो पूरे Gallagher परिवार के साथ साथ, एलिजाबेथ और माइकल Gallagher धन्यवाद देना चाहूंगा. funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी. हम उनके समर्थन के लिए जीव विज्ञान विभाग के कर्मचारी धन्यवाद, और हमारे zebrafish कॉलोनी की देखभाल और कल्याण में उनके उत्कृष्ट समर्पण के लिए नोट्रे डेम पर Zebrafish अनुसंधान के लिए केंद्र. अंत में, हम के रूप में, उनकी टिप्पणी, विचार विमर्श और इस काम के बारे में अंतर्दृष्टि के लिए हमारे अनुसंधान प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवादअच्छी तरह से स्वाभाविक रूप से हमारे अनुसंधान के लिए सबसे उत्कृष्ट चाबुक उपकरण बनाने के लिए बिल्ली के समान मूंछ शेड उपलब्ध कराने के लिए मैरीगोल्ड (Maripooka) और Zinnia Wingert के रूप में.
50 X E3 | 250 mM NaCl, 8.5 mM KCL, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination. | ||
1 X E3 | Dilute 50 X E3 in distilled water. | ||
mesh tea strainer | English Tea Store | SKU #ASTR_KEN, MPN#1705 | |
embryo incubation dish | Falcon | 35-1005 | |
transfer pipet | Samco | 202, 204 | |
flat-bottom microcentrifuge tube | VWR | 87003-300; 87003-298 | |
glass vial | Wheaton | 225012 | |
1 X Pbst | 0.1% Tween-20 detergent in 1 X Pbs, made by diluting 10 X Pbs in distilled water. | ||
Tween-20 stock | American Bioanalytical | AB02038 | |
10X Pbs | American Bioanalytical | AB11072 | |
paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 19210 | |
4% PFA/1X Pbs | Dissolve 4% PFA (w/v) in 1 X Pbs, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze aliquots for storage at -20 °C. Thaw just before use and do not refreeze stocks. | ||
filter sterilization unit | Corning | 430516 | 1L filter system, 0.45 um CA |
MeOH | Sigma | 34860-4L | |
proteinase K | Roche | 03-115-879-001 | Dissolve in distilled water to make proteinase K stock (10 mg/mL) and store aliquots at -20 °C. |
HYB+ | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/mL yeast torula RNA, 50 ug/ul heparin | ||
DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents | Roche | 11175025910; 11685619910 | Refer to manufacturer instructions. |
SP6 RNA polymerase | Roche | 11487671001 | |
T7 RNA polymerase | Roche | 10881775001 | |
T3 RNA polymerase | Roche | 11031171001 | |
RNase 1 inhibitor | Roche | 3335399001 | |
DNase 1 inhibitor, 10 X DNase 1buffer | Roche | 4716728001 | |
glycogen | Roche | 10901393001 | |
Ethanol (EtOH) | Sigma | E7023 | Aliquot 50 ml aliquots of 100% EtOH and 70% EtOH (diluted with molecular grade water) and store at -20 °C. |
molecular grade distilled water | Mediatech | 25-055-CM | |
waterbath | Thermo | 51221073 | Model 2831 |
nanodrop | Thermo | ND-2000c | |
formamide | American Bioanalytical | AB00600 | Store at -20 °C. |
20X SSC | American Bioanalytical | AB13156 | |
MAB | 2L formula: Into 1.5 L of distilled water, mix 23.2 g maleic acid, 17.5 g NaCl, 55.0 g Trisma base, then add 8 mLs of 1M Tris-HCl pH 9.5, and then fill to 2 L. Autoclave. | ||
MABT | MAB + 0.1% Tween-20 | ||
block solution | We make in 50 ml fresh aliquots: 10 mLs of BSA (from 10% lab stock), 5 mls of FCS (from stock), and 35 mLs of MABT. Save unused block at 4 °C to use for antibody solution. Note: Thaw the BSA and FCS stocks at 37 °C—if you thaw at a higher temperature they become a thick gel (do not use). | ||
FCS (fetal calf serum) stock | Invitrogen | 16140089 | Aliquot in 5 or 10 ml portions and store at -20 °C. |
BSA (bovine serum albumin) stock | American Bioanalytical | AB00448 | Make a 10% stock diluted in MAB by dissolving the BSA flakes at room temperature with rapid stirring, then store 10 ml aliquots at -20 °C. Store undissolved BSA flakes at 4 °C. |
anti-digoxigenin antibody | Roche | 11-093-274-910 | Store at 4 °C. |
anti-fluorescein antibody | Roche | 11-426-338-910 | Store at 4 °C. |
12-well staining dish | BD-Falcon | 35-3225 | |
pre-staining buffer | 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20. Always make fresh: it will precipitate in the course of a few days. | ||
staining solution-purple | For every 10mLs needed: add 45 uL of NBT and 35 uL of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples). | ||
staining solution-red | For every 10mLs needed: add 31.5 uL of INT and 35 uL of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples).. | ||
NBT stock | Sigma | N6876 | Stored at -20 °C; powder diluted 50mg/mL in 70% DMF, 30% water. |
INT stock | Sigma | I8377 | Stored at -20 °C; powder diluted 55mg/mL in 70% DMF, 35% water. |
BCIP stock | Sigma | B8503 | Stored at -20 °C; powder diluted 50mg/mL in 100% DMF. |
DMF (dimethylformaldehyde) | American Bioanalytical | AB00450 | |
glycine | Sigma | G8898 | 0.1 M glycine, pH 2.2 |
small plastic Petri dish | Corning | 430589, 430588 | |
glycerol | Sigma | G7893 | |
fine forceps | Roboz | RS-1050 | Dumont Tweezers Pattern #55 |
lash tool | Constructed by affixing a suitable lash to a pipet tip (sizes ranging from P10-P1000 can be used) using superglue. We use a naturally shed human eyelash, a naturally shed animal whisker or wiry fur coat hair, or a natural or synthetic lash purchased from the beauty department at a pharmaceutical or retail store (extra long lashes are most amenable to stable mounting on the pipet tip). The pipet tip is affixed onto a straight rod (8-10 cm in length) such as a needle holder (e.g. Fisher 08-965-A) for easy handling. See Figure 3 for images of these homemade tools. | ||
glass slide | Thermo-Fisher | 4445 | White Frost |
glass coverslip | Thermo-Fisher | 12-540A | 18 x 18 mm |
modeling clay | Hasbro | Playdoh | Other craft modeling clay products can be substituted |
slide holder | Thermo-Fisher | 12-587-10 | Cardboard tray to store slides flat |
stereomicroscope | Nikon | SMZ645, SMZ1000 | |
compound microscope | Nikon | 80i, 90i |