Summary
الجنين الزرد هو نموذج ممتاز للبحوث البيولوجيا التطورية. خلال مرحلة التطور الجنيني، الزرد تطوير مع كتلة البيض، الذي يعرض التحديات ثلاثي الأبعاد للمراقبة العينة والتحليل. يصف هذا البروتوكول كيفية إنشاء ثنائي الأبعاد جبل الاستعدادات شقة من جبل بأكمله في الموقع (WISH) ملطخة العينات الجنين الزرد.
Abstract
يتم الآن استخدام الأجنة الزرد عادة للبحوث الطبية الحيوية والأساسية للتحقيق في التحكم الجيني للعمليات التنموية ونموذج التشوهات الخلقية. خلال اليوم الأول من الحياة، وتقدم الجنين الزرد من خلال العديد من المراحل التنموية بما في ذلك التخصيب، الانقسام، تكون المعيدة، وتجزئة، وتوالد من هياكل مثل الكلى والقلب والجهاز العصبي المركزي. تشريح الجنين الزرد الشباب يقدم العديد من التحديات لتصور وتحليل الأنسجة المشاركة في العديد من هذه الأحداث لأن الجنين يطور بالتعاون مع صفار الشامل الجولة. وهكذا، على التحليل الدقيق والتصوير من الظواهر التجريبية في عينات الجنينية ثابتة بين tailbud و 20 الجسيدة مرحلة (ما بعد 10 و 19 ساعة الإخصاب (HPF)، على التوالي)، مثل تلك الملون باستخدام جبل بأكمله في الموقع التهجين (WISH) في، غالبا ما يكون من المرغوب فيه لإزالة الجنين من صفار بوجميع لوضعه مسطح على شريحة زجاجية. ومع ذلك، وأداء الإجراء جبل المسطحة يمكن أن تكون مملة. لذلك، ناجحة وفعالة شقة جبل وإعداد سهلت إلى حد كبير من خلال مظاهرة البصرية للتقنية التشريح، وساعد أيضا باستخدام الكواشف التي تساعد في التعامل مع الأنسجة الأمثل. هنا، ونحن نقدم بروتوكول WISH لدينا للكشف عن لون واحد أو اثنين من الجينات في الأجنة الزرد، وتوضح كيف يمكن تنفيذ الإجراء تركيب مسطحة على هذا المثال من عينة ثابتة الملون. هذا البروتوكول تركيب مسطحة قابلة للتطبيق على نطاق واسع لدراسة العديد من الهياكل الجنينية التي تنشأ أثناء التطور الزرد في وقت مبكر، ويمكن تنفيذها بالتعاون مع وسائل تلطيخ أخرى أجريت على عينات الأجنة ثابتة.
Introduction
الزرد، دانيو rerio، وأصبح الحي تستخدم على نطاق واسع في دراسة البيولوجيا التطورية. الزرد هي الاستوائية، وأنواع الفقاريات في المياه العذبة تعود لعائلة Cyprinidae. واستخدمت الزرد أصلا للبحوث البيئية للحصول على معلومات حول مخاطر ملوثات المياه المحتملة، كما كانت يمكن الحصول عليها بسهولة، وغير مكلفة، وسهلة للحفاظ على 1. على مدى السنوات الثلاثين الماضية، أصبح الزرد المعترف بها كنظام نموذج الفقاريات لين العريكة وراثيا لمجموعة من الأسباب. الزرد تظهر على مستوى عال من الحفظ التشريحية والفسيولوجية مع الفقاريات العليا بما في ذلك الثدييات 2،3. وقد كشفت مؤخرا الشرح تسلسل الجينوم أن ما يقرب من 70٪ من الجينات البشرية واحد على الأقل الزرد نظيره 4. على سبيل المثال، تم تحديد العديد من الجينات orthologous أن تلعب دورا هاما أثناء التطور الكلى بين هذه الأنواع 5-7. هذه غرفة المعيشةوقد مكن درجة ماتيتش الحفظ فيما يتعلق البيولوجيا الخلوية والجزيئية الباحثين لخلق نماذج لمجموعة واسعة من الأمراض التي تصيب الإنسان في الزرد 8، وأصبحت الزرد أداة قيمة لتحديد العلاجات المخدرات المحتملة باستخدام شاشات الجينية الكيميائية 9.
وعلاوة على ذلك، فإن النموذج الزرد ليست فقط قادرة على تلخيص مجموعة متنوعة من العمليات التنموية المعقدة والحالات المرضية والتي ينظر اليها في البشر، ولكن عدة سمات إضافية أيضا زيادة جاذبيتها باعتبارها كائن نموذج للدراسات الجنينية. الزرد هي بيوض وتتكاثر عن طريق وضع البيض البث، التي تنص على الباحثين مع سهولة الوصول إلى الأجنة من بداية الإخصاب 10. وتشمل المزايا الأخرى حجم الجنين، والشفافية، وتطوير الخارجية السريع 10. بالإضافة إلى ذلك، تمتلك البالغين الزرد الخصوبة العالية وعادة إنتاج أحجام مخلب كبير نسبيا التي يمكن أن تتراوح بين 200-500في الأسبوع، مما يتيح في نهاية المطاف الباحثين لإجراء تجارب إنتاجية عالية، مثل شاشات الكيميائية النمط الظاهري القائم، مع سهولة 9.
وحتى مع ذلك، على الرغم من عدد كبير من المزايا التي أظهرتها نموذج الزرد، وهناك التحديات التي تتعلق التحليل والإبلاغ عن النتائج التجريبية التي تم الحصول عليها من مراحل النمو المبكرة. في بعض الحالات، يمكن تشريح المتأصلة في الجنين الزرد تحجب التصور بيانات واحد. بعد الإخصاب، الخلية الأولي يخضع الأحداث الانقسام متعددة كما تقدم التنمية 11. تكون المعيدة التالية، يظهر محور الجنينية في مرحلة tailbud (10 HPF) بحيث يتم لفه حول صفار البيض 11. كما تقدم تطور لاحق خلال الفترة تجزئة، والجذع تنمو في الشامل وكذلك إطالة بواسطة استطالة المحوري بحيث ذيل جنبا إلى جنب مع جزء من الكيس المحي نفسها تمتد خارج من الكتلة صفار المركزية11. بين tailbud و 20 مرحلة الجسيدة (19 HPF)، يحاول أن نلاحظ الميزات التنموية محددة بعد الاستفادة من مختلف البروتوكولات تلطيخ، مثل WISH، يمكن أن يكون تحديا على حد سواء لتصور وصورة نظرا لهندسة الجنين وغموض الكيس المحي. طريقة واحدة للقضاء على هذه التحديات هو إزالة صفار ثم تتسطح الجنين في عينة ثنائية الأبعاد التي يمكن تحليلها بطريقة أكثر وضوحا.
توفير الموارد البروتوكول والفيديو التالية دليلا لكيفية deyolk بنجاح ومسطحة جبل الجنين بعد تثبيت وتلوين، وذلك باستخدام مثال واحد أو اثنين من لون WISH تلطيخ. WISH هو أسلوب يستخدم على نطاق واسع التي تمكن من الكشف عن الأحماض النووية محددة في العينات المحفوظة، وبالتالي يسمح لموقع (ق) في التعبير الجيني ليتم الكشف داخل الأنسجة. وقد وصفت على نطاق واسع تقنيات WISH، ويمكن أن يؤديها مع ركائز لون مختلف وكذلك الانفلونزاأنظمة الكشف عن orescent 12-20. ونحن هنا نقدم لبروتوكول WISH تعديل المستخدمة لأجنة الزرد بين tailbud وتجزئة مراحل التنمية. بروتوكولات WISH البديلة، ومع ذلك، متوافقة مع الإجراء جبل مسطح وصفها هنا، كما لوحظ في بداية البروتوكول أدناه. بالإضافة إلى ذلك، يمكن الاستفادة تركيب مسطحة جنبا إلى جنب مع أي عدد من تقنيات التصوير الحالية، مثل جبل بأكمله المناعية، أو التسميات تتبع نسب الخلايا، والتي لا توصف في هذا البروتوكول. وعموما، فإن تقنية تركيب مسطحة تمكن أفضل تحليل متفوقة وعرض البيانات التي تم الحصول عليها من التجارب مع المراحل الأولى من التطور الجنيني في الزرد.
Protocol
تمت الموافقة على إجراءات للعمل مع الأجنة الزرد الموصوفة في هذا البروتوكول من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدم في جامعة نوتردام. ملاحظة: تم استخدام الإجراءات الموضحة في أجزاء 1-5 لتوليد الجنين الصور المقدمة هنا في نتائج ممثل. يمكن أن تكون بديلا للإجراءات الموصوفة في الأجزاء 1-5 كما تريد مع إجراءات بديلة WISH 12-16 أو تقنيات التصوير الأخرى مثل وضع العلامات المناعى للبروتينات معينة باستخدام أجسام مضادة محددة. في أداء يتصاعد شقة على WISH الأجنة الزرد مع بروتوكول وصفها في أجزاء 1-5، وتثبيت الجنين والخطوات الأولية تلطيخ التثبيت النهائي هي التلاعب الرئيسية التي تؤثر على القدرة على إزالة حبيبات الصفار من العينة لتركيب مسطحة. ويتم الحصول على أفضل النتائج تركيب مسطحة عند تنفيذ التثبيت الأولي مع الثلج الباردة إذابة حديثا بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) / برنامج تلفزيوني 1X والتثبيت منوWISH النهائي تلطيخ رد فعل مع الثلج الباردة PBS 4٪ PFA/1x (والتي لا تحتاج إلى إذابة حديثا)، وينصح أن القراء على النظر في هذا عند استبدال أساليب تلطيخ البديلة في تركيبة مع قطع 6-8.
1. جمع الأجنة، تثبيت، والتخزين
- إعداد أقفاص التزاوج عن طريق وضع الذكور البالغين الزرد (ق) والإناث (ق) في غرف من الماء النظام بحيث يتم فصلهم عن طريق مقسم بين عشية وضحاها.
- إزالة فواصل بين البالغين وجمع البويضات المخصبة باستخدام غرامة سلكية مصفاة الشاي داخل ~ 15-30 دقيقة من التزاوج لجمع براثن التي لديها المراحل الجنينية ما يعادلها.
- تحويل مصفاة رأسا على عقب وشطف السطح مع تيار غرامة E3 الاستغناء من زجاجة بخ لنقل الأجنة في أطباق الحضانة التي تحتوي على ما يقرب من 25 مل من محلول E3.
- بعد جمع براثن، تقسيمها إلى عدة أطباق مثل أن حوالي 50-60 الأجنة يتم تحضينفي كل طبق من 25 مل من محلول E3. ملاحظة: الاكتظاظ الأجنة يمكن أن يؤدي إلى اتواقت التنموية الكبير في غضون ينبغي أن تؤخذ في مخلب والحذر لتجنب هذا لتمكين جمع في الوقت المناسب من مرحلة المطلوب (ق).
- احتضان الأجنة في 28.5 درجة مئوية لتمكين التقييم التنموية وفقا لالزرد انطلاق سلسلة معيار 11.
- استخدام ماصة نقل البلاستيك لوضع بلطف العدد المرغوب فيه من الأجنة في timepoint المحددة، وصولا إلى مرحلة الجسيدة 20 (19 HPF)، إلى أسفل أنبوب microcentrifuge مسطحة. ملاحظة: العناية في التعامل مع الأجنة الشباب، لأنها هشة ويمكن أن تتلف بسهولة عن طريق سحق أو التعامل مع عدوانية مع ماصات نقل. بدلا من ذلك، قوارير زجاجية يمكن استخدامها لتثبيت ومعالجة الأجنة. يمكن لجميع يغسل بروتوكول اللاحقة أن تستخدم ماصات نقل البلاستيك، باستثناء إضافة وإزالة riboprobe (الخطوات 3.11، 3.14).
- استبدال E3 مع الثلج الباردة PBS 4٪ PFA/1x، وإصلاح الأجنة في chorions في 4٪ PFA/1x برنامج تلفزيوني لمدة 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة أو في 4 درجات مئوية خلال الليل. مذكرة من الحذر: PFA هي سامة، وينبغي التعامل حلول PFA في غطاء الكيميائية في حين يرتدي معدات الوقاية الشخصية المناسبة، بما في ذلك القفازات ومعطف المختبر. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي التعامل مع مسحوق PFA رعاية استثنائية عندما جعل حل الأسهم، وحتى PFA حبيبات يمكن ان تميل لتفريق من خلال تهمة ثابتة. وعادة ما يتم إعداد PFA عن طريق تسخين برنامج تلفزيوني 1X ليغلي لإذابة مسحوق منهاج العمل، ومن ثم يتم تخزين الحل في aliquots في -20 درجة مئوية. إذا الرواسب الدقيقة موجودة في 4٪ PFA/1x PBS مرة واحدة يتم تبريد الحل، فلتر تعقيم الحل تبريده قبل aliquoting لتخزين تجميد بتمريرها من خلال نظام تصفية 0.45 ميكرون. فقط الطازجة أو يستخدم إذابة طازجة PFA لهذا الأولي (أي الابتدائية) تثبيت الجنين.
- إزالة الإصلاح وغسل الأجنة مرتين مع 1X PBST، ثم نقل إلىطبق الحضانة.
- عرض الأجنة تحت stereomicroscope واستخدام اثنين من أزواج من ملقط غرامة لإزالة chorions المحيطة الأجنة، بحيث يستخدم زوج واحد للاستفادة بلطف الجنين بينما يستخدم الزوج الثاني لتمزيق مفتوحة المشيماء.
2. Permeablization الأجنة
- نقل الأجنة dechorionated مرة أخرى إلى أنبوب microcentrifuge أو قارورة من الزجاج، ثم شطف مرتين مع 1X PBST لإزالة أي المتبقية الحطام المشيماء.
- إزالة 1X PBST وغسل الأجنة مرتين مع 100٪ الميثانول (MeOH).
- وضع الأجنة في -20 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة على الأقل. ملاحظة: يمكن تخزين الأجنة في -20 درجة مئوية في MeOH لمدة سنة واحدة أو أكثر. الميثانول يجعل chorions لزجة، وبالتالي لا الشروع في هذه الخطوة ما لم تكن قد إزالة chorions.
- ترطيب الأجنة عن طريق إزالة MeOH 100٪ وغسلها في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق في كل من 50٪ MeOH/1x PBST، 30٪ MeOH/1x PBST، ثم مرتين مع 1X PBST. </ لى>
- إعداد بروتين K الحل الطازجة عمل (5 ميكروغرام / مل) وذلك بإضافة 25 ميكرولتر من إذابة طازجة K بروتين الأسهم (10 ملغ / مل) إلى 50 مل من 1X PBST.
- إزالة 1X PBST من الأجنة، ثم استبدل مع بروتين K الحل واحتضان العمل استنادا إلى المرحلة الجنينية: <= 5 somites لمدة 1 دقيقة؛ 10-12 somites ل1.5 دقيقة؛ 15 somites لمدة 2 دقيقة، و 20 somites لمدة 3 دقائق.
- إزالة بروتين K الحل العمل وغسل الأجنة مرتين مع 1X PBST.
- إزالة 1X PBST واستبدالها مع الثلج الباردة PBS 4٪ PFA/1x لا يقل عن 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
3. Riboprobe التجميعي، Prehybridization، التهجين، وإزالة مسبار
- تجميع العقاقير riboprobe في المختبر النسخ التفاعل في درجة حرارة الغرفة في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل، مع الحفاظ على الإنزيمات على الجليد، من خلال الجمع بين قالب الحمض النووي التي تحتوي على تسلسل المقابلة لهذا الجين من الفائدة (إما 100-200 نانوغرام من PCRأدرج المنتج أو 1.5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد خطي، أعد كما هو موضح 12،13)، 2 ميكرولتر من digoxygenin أو فلوريسئين ribonucleotides المسمى، 2 ميكرولتر من بوليميريز RNA المناسبة (SP6، T3، T7 اعتمادا على أي تسلسل في المنتج PCR أو موجودة على البلازميد DNA)، 2 ميكرولتر من 10X العازلة النسخ، و 0.5 ميكرولتر من ريبونوكلياز المانع، وتجلب إلى وحدة تخزين ما مجموعه 20 شباط مع الماء المقطر الصف الجزيئية (الدناز، ريبونوكلياز مجانا). ملاحظة: يجب prewarmed المخزن المؤقت النسخ 10X عن طريق وضع أنبوب في بالحمام المائي 37 درجة مئوية لمدة 10-20 دقيقة، وبعد ذلك vortexed لضمان أن جميع المكونات في الحل. إذا رقائق بيضاء موجودة، واحتضان الأنبوب لمدة 5-10 دقيقة ودوامة أخرى من جديد. يمكن أن ردود الفعل النسخ تفشل أو أن يكون المحصول الضعيف إذا لم يتم حل العازلة النسخ بالكامل ويخلط جيدا.
- مزج المكونات واحتضان كل رد فعل عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة في بالحمام المائي.
- إزالة رد فعل توتكون (ق) من بالحمام المائي، وتدمير الحمض النووي القالب في كل عينة عن طريق إضافة 5 ميكرولتر من 10X الدناز أنا العازلة، 2 ميكرولتر من الدناز أنا الانزيم، و 23 ميكرولتر من الماء المقطر الصف الجزيئية لتبرزي حجم الإجمالي إلى 50 ميكرولتر، ثم احتضان كل أنبوب عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في بالحمام المائي.
- إجراء هطول الايثانول في كل أنبوب microcentrifuge بإضافة 5 ميكرولتر من 3 خلات الصوديوم M، ودرجة الحموضة 5.2 و 110 ميكرولتر من الجليد الباردة الإيثانول بنسبة 100٪، تليها 1 ميكرولتر من الجليكوجين المخزون لتسهيل RNA بيليه التصور في الخطوات اللاحقة، ومن ثم احتضان أنبوب في -20 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل أو طوال الليل.
- أجهزة الطرد المركزي كل أنبوب microcentrifuge في أقصى سرعة 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة، ثم إزالة الإيثانول بنسبة 100٪ طاف واستبدالها مع 100 ميكرولتر من الايثانول 70٪ الجليد الباردة.
- أجهزة الطرد المركزي كل أنبوب microcentrifuge في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ثم إزالة 70٪ من الإيثانول طاف والهواء الجاف بيليه لمدة 5 دقائق، ثم أخيرا إضافة 100 ميكرولتر من موالصف lecular الماء المقطر لresuspend الكرية وتحديد riboprobe تركيز الأسهم باستخدام معمل NanoDrop. ملاحظة: مرة واحدة وقد ذهب بيليه في الحل، يجب أن تبقى الأسهم riboprobe على الجليد وتخزينها في -20 درجة مئوية.
- لإعداد الأجنة ثابتة لعملية prehybridization، وإزالة 4٪ PFA/1x برنامج تلفزيوني من كل عينة وغسل الأجنة مرتين مع 1X PBST.
- نقل بين 25-40 الأجنة في 1X PBST في كل واحدة مسطحة القاع أنبوب microcentrifuge. ملاحظة: سوف الاكتظاظ الأجنة تؤدي إلى تلطيخ متفاوتة في وقت لاحق، وينبغي توخي الحذر للحد من حجم العينة في كل أنبوب إلى ما يقرب من 40 الأجنة.
- استبدال 1X PBST في كل أنبوب مع 500-1،000 ميكرولتر من HYB +.
- وضع أنبوب (ق) من الأجنة في فرن وضعت في 70 درجة مئوية، واحتضان لهم عند هذه الدرجة لمدة 4 ساعة لأداء prehybridization.
- إعداد riboprobe / HYB + الحل بإضافة 100-500 نانوغرام من riboprobe (digoxygenin و / أو fluorescعين المسمى) إلى 500 ميكرولتر من الطازجة HYB + ثم احتضان هذا الحل عند 70 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة على الأقل قبل الخطوة 3.11 لprewarm ذلك. ملاحظة: للكشف عن النصوص الجينات متعددة، وذلك باستخدام وضع العلامات اللونية واحد و / أو مزدوجة، كل من riboprobes المقابلة لهذه الجينات تحتاج إلى دمجها في riboprobe واحد / HYB + كوكتيل.
- إزالة HYB prehybridization + من كل أنبوب من الأجنة واستبدالها مع كافية riboprobe / HYB + لتغطية الأجنة. ملاحظة: عادة، 200-250 ميكرولتر من riboprobe / HYB + ضروري لتغطية الأجنة في شقة واحدة أسفل أنبوب microcentrifuge. وعادة ما يتم تنفيذ Riboprobe / HYB + إضافة وإزالة باستخدام ماصة نصائح وحاجز لمنع التلوث المتبادل بين العينات.
- احتضان الأجنة عند 70 درجة مئوية خلال الليل مع ribroprobe / HYB +.
- إعداد مجموعة من الحلول التالية غسل وقبل تدفئة لهم بين عشية وضحاها في 70 درجة مئوية: 50٪ formamide/2x SSCT، 2X SSCT، و0.2x SSCT. ملاحظة: أنه لأمر مريح للتحضير 50 مل آلiquots كل غسل الحل، لأن الزائد يمكن تخزينها في درجة حرارة الغرفة وبعد ذلك إعادة تسخينها لاستخدامها في المستقبل.
- إزالة riboprobe / HYB + باستخدام ماصة وحاجز نصائح وتخزينها في -20 درجة مئوية. ملاحظة: عادة كل riboprobe / HYB + خليط يمكن استخدامها عدة مرات (على سبيل المثال، 3 أو أكثر) دون انتقاص من الإشارة. في حين استخدامها riboprobe / HYB + ويرتبط مع انخفاض الخلفية، ومع ذلك، نضع في اعتبارنا أن استخدامها يمكن أن مخاليط riboprobe تخضع للتدهور.
- غسل الأجنة مرتين مع 50٪ SSCT formamide/2x لمدة 30 دقيقة عند 70 درجة مئوية.
- غسل الأجنة مرة واحدة مع 2X SSCT لمدة 15 دقيقة عند 70 درجة مئوية.
- غسل الأجنة مرتين مع SSCT 0.2x لمدة 30 دقيقة عند 70 درجة مئوية.
- إزالة SSCT 0.2x وغسل الأجنة مرتين مع MABT في درجة حرارة الغرفة.
4. مكافحة digoxygenin جسم الحضانة وكشف
- إعداد الحل كتلة جديدة.
- إزالة MABT واستبدالها مع كتلة المحاليلنشوئها.
- احتضان الأجنة في حل كتلة لمدة 2-4 ساعة في درجة حرارة الغرفة. ملاحظة: توفير حضانات أطول كتلة أفضل النتائج مع الأجنة الزرد الشباب مراحل (<15 somites). للقيام بهذا الإجراء كتلة طويلة، نفذ الحضانة كتلة ل 8-12 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو مزيج من درجة حرارة الغرفة زائد (إلى ~ 8 ساعة) لاحقة 4 ° C الحضانة بين عشية وضحاها.
- إعداد الحل الأجسام المضادة لمكافحة digoxygenin بجعل 5،000 التخفيف أضعاف في حل الطازجة كتلة (على سبيل المثال، 1 ميكرولتر لكل 5 مل من كتلة).
- إزالة كتلة وإضافة محلول الأجسام المضادة / كتلة.
- تغطية العينة في احباط واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية لمدة 4 أو ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة anti-digoxygenin/block وغسل الأجنة 10 مرات على الأقل مع MABT. ملاحظة: نقل الأجنة إلى 12 الأطباق جيدا ليغسل MABT. هذا يزيد من السرعة التي الأجنة يمكن غسلها، وهو أمر مفيد عند معالجة كميات عينة كبيرة، والثاني يجعل من السهل رصد التقدم المحرز في رد فعل تلطيخ (الخطوة 4.11) تحت stereomicroscope. ملاحظة: في هذه الخطوة الأجنة يمكن 'فائقة غسلها "التي يحتضنها منهم بين عشية وضحاها في MABT في 4 درجات مئوية قبل الشروع في الخطوة 4.8، وهو علاج مفيد للتحقيقات التي تميل إلى إعطاء خلفية عالية أو البقع التي تتطلب مراقبة مطولة خلال تعمل اليوم.
- إعداد المخزن المؤقت قبل تلطيخ والحل تلطيخ المطلوب (الركيزة الأرجواني أو الأحمر).
- إزالة MABT وغسل الأجنة في المخزن قبل تلطيخ لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة المخزن المؤقت قبل تلطيخ وإضافة محلول تلطيخ.
- رصد التقدم المحرز في درجة حرارة الغرفة رد فعل تلطيخ كل 15-30 دقيقة عن طريق التحقق من ظهور الأجنة تحت stereomicroscope. ملاحظة: يمكن تباطأ معدل التفاعل تلطيخ أسفل عن طريق نقل العينات إلى 4 درجات مئوية، إذا كان ذلك ضروريا لإعطاء مزيد من الوقت للانتهاء من وصمة عار. مرة واحدة المبردة إلى 4درجة مئوية، ومع ذلك، لا يمكن تسريع رد فعل من قبل ارتفاع درجة حرارة لدرجة حرارة الغرفة.
- عندما رد فعل تلطيخ كاملة، وإزالة الحل تلطيخ واستبدالها مع 1X PBST.
- يغسل مرتين مع 1X PBST لمدة 5 دقائق. ملاحظة: إذا لم يكن الكشف عن الجينات الأخرى مع الركيزة أخرى، ثم إصلاح العينات في الثلج الباردة PBS 4٪ PFA/1x لمدة 20 دقيقة على الأقل، وانتقل إلى الخطوة 6.1. المضي قدما إلى الخطوة 5.1 خلاف ذلك.
5. مكافحة فلوريسئين جسم الحضانة وكشف
- إزالة 1X PBST وغسل الأجنة مرتين مع 0.1 M الجلايسين، ودرجة الحموضة 2.2 لمدة 15 دقيقة كل في درجة حرارة الغرفة. ملاحظة: الوقت ليغسل الجلايسين ضروري لتنشيط تماما رد فعل تلطيخ الأولى.
- إزالة 0.1 M الجلايسين وغسل الأجنة مرتين مع MABT لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- إعداد الحل الأجسام المضادة لمكافحة فلوريسئين بجعل 5،000 التخفيف أضعاف في حل الطازجة كتلة (على سبيل المثال، 1 ميكرولتر لكل 5 مل من كتلة).
- إزالة MABT وإضافة محلول الأجسام المضادة / كتلة. اتبع الخطوات 4،6-4،13 لأداء الكشف عن ribroprobe المسمى فلوريسئين. ملاحظة: عندما يتم الانتهاء من رد فعل تلطيخ النهائي، فمن الضروري أن التثبيت الأخير من عينة يتم في الجليد الباردة PBS 4٪ PFA/1X. التثبيت مع حلول PFA دفئا تميل إلى أن تكون مرتبطة مع صفار زجة يصعب إزالته من الجنين أثناء تشريح وdeyolking لإجراء جبل مسطح.
6. تشريح الأجنة وDeyolking الأولية للجنين
- تحديد، الجنين الملون ثابتة لتركيب مسطحة.
- استخدام ماصة نقل لوضع الجنين عينة مختارة في البلاستيك أو الزجاج طبق بتري تحتوي على 1X PBST.
- وضع صحن تحت stereomicroscope، ولفة الجنين باستخدام زوج من ملقط غرامة أو أداة السوط بحيث يتم الحصول على عرض الوحشي وتصور نهايات الرأس والذيل.
- استخدام زوج واحد من ملقط غرامة لإجراء شق في اله صفار في موقف موقعا مركزيا بين الرأس والذيل للجنين، وفي الوقت نفسه استخدام الزوج الثاني من ملقط غرامة لعقد الجنين وذلك لتوفير النفوذ من أجل شق صفار. ملاحظة: بدلا من ذلك، وجعل اثنين من الشقوق الرئيسية في صفار البيض، وثيقة واحدة في الرأس وأخرى على مقربة من ذيل الجنين.
- استخدام ملقط غرامة و / أو أداة السوط لحلج القطن من صفار البيض من تجويف الخلية صفار.
- شطف الجنين بلطف مع 1X PBST لإزالة صفار الضالة.
7. Deyolking الجميلة من الأجنة
- نقل الجنين إلى شريحة الزجاج المسطح مع 1-2 قطرات من 1X PBST.
- استخدام أداة السوط وملقط غرامة لوضع الجنين بلطف مع بطني (صفار) الجانب مواجهة على شريحة زجاجية.
- سحب الجنين إلى حافة الحل 1X PBST باستخدام أداة السوط بحيث يبقى الجنين في وضع مسطح ضد شريحة زجاجية.
- كشط السطح البطني للجنين بلطف باستخدام السوط لرأ من أجل إزالة حبيبات الصفار دون تمزيق الجنين. في الوقت نفسه استخدام زوج من ملقط غرامة لترسيخ الجنين أثناء تجريف مع أداة السوط. ملاحظة: إزالة حبيبات الصفار يمكن أن تتطلب تجريف المتكررة لمدة 5-10 دقيقة.
- إذا أصبح الحل PBST تشوش مع صفار الزائدة أو يبدأ لتتبخر، إضافة 1-2 قطرات جديدة من 1X PBST إلى الشريحة باستخدام البلاستيك أو الزجاج ماصة نقل، ثم قم بسحب الجنين إلى المنطقة مع الحل نظيفة لمزيد من صفار الحبيبية الإزالة.
- عندما تمت إزالة صفار مرضية، استخدم ماصة نقل لنقل بلطف الجنين مرة أخرى إلى البلاستيك أو الزجاج طبق بتري تحتوي على 1X PBST لشطف النهائي من أجل إزالة حبيبات الصفار الضالة.
- نقل الجنين deyolked باستخدام البلاستيك أو الزجاج ماصة نقل إلى البلاستيك أو الزجاج طبق بتري تحتوي على 100٪ الجلسرين.
- احتضان الجنين في 100٪ الجلسرين ل~ 5 دقائق حتى يتأقلم الجنين.
8. تركيب على شريحة زجاجية
- نقل الجنين deyolked إلى شريحة زجاجية نظيفة في 1-2 قطرات من الجلسرين بنسبة 100٪.
- وضع الجنين مع بطني (صفار) الجانب التي تواجه شريحة زجاجية.
- باستخدام أداة السوط، اسحب الجنين إلى حافة الهبوط الجلسرين بحيث يبقى الجنين في وضع مسطح ضد شريحة زجاجية. إذا كان محور الجنينية هو المنحني، استخدم ملقط غرامة لجعل بلطف شقوق صغيرة جدا في غشاء الخلية صفار المتبقية للتخفيف من التوتر بحيث يمكن وضعه الجنين مسطحة على الشريحة مع محور على التوالي.
- وضع divots صغيرة من الصلصال على الزوايا الأربع من 18 × 18 مم الزجاج ساترة. ملاحظة: كبديل، قطرات صغيرة من الشحوم فراغ 15 يمكن أن تكون بديلا لنمذجة الطين.
- وضع ساترة الزجاج ببطء على الجنين، الصيد ساترة من أجل تقليل توليد فقاعات الهواء في الجلسرين حول العينة.
- إضافة قطرة إضافية من الجلسرين بنسبة 100٪إلى جانب ساترة الزجاج لملء الفراغ بين ساترة وشريحة زجاجية.
- اضغط لأسفل ببطء وبعناية على أربع زوايا ساترة لوضع بحزم الجنين بين الزجاج والقضاء على الانجراف. ملاحظة: يجب الحرص على عدم سحق الجنين.
- إذا لم يتم وضع الجنين كما تريد، استخدم ملقط غرامة لإزالة ساترة. استخدام أداة السوط لإعادة الجنين و / أو ملقط غرامة لجعل شقوق إضافية بحيث يمكن تعديل أوضاعها الجنين. كرر الخطوات من 8،4-8،7.
- مراقبة و / أو صورة العينة باستخدام المجهر ستيريو أو مركب.
- تخزين مسطحة جبل إعداد مسطحة مع حامل الشرائح من الورق المقوى في الظلام في 4 درجات مئوية لعدة أسابيع أو مؤقتة في درجة حرارة الغرفة. ملاحظة: سوف تتلاشى تدريجيا وصمة عار WISH مع مرور الوقت، وردود الفعل الركيزة الأحمر بشكل خاص، والتي لا يمكن الحفاظ عليها في الجلسرين إلى أجل غير مسمى. البقع الأرجواني أيضا تتلاشى بسهولة أكبر إذا كان يحتفظ بها في مقارنة مع الجلسرينPFA (راجع الخطوة 8.11). ومن المثير للاهتمام، وقد تم نشر أن الأجنة في تصاعد permount بدلا من الجلسرين يمكن تمكين التخزين إلى أجل غير مسمى في درجة حرارة الغرفة 15.
- للتخزين على المدى الطويل من عينات ملطخة الركيزة الأرجواني، وإزالة ساترة الزجاج وشطف الأجنة تشطف مرتين في 1X PBST، ثم نقل إلى أنبوب microcentrifuge مع 4٪ PFA/1x برنامج تلفزيوني لمدة التخزين على المدى الطويل. ملاحظة: بدلا من ذلك، الأجنة في 1X PBST يمكن معالجتها لتحليلات إضافية، مثل عزل الحمض النووي التنميط الجيني ل.
Representative Results
ويشمل الإجراء بروتوكول تركيب مسطحة تحول الجنين الزرد من التشريح الطبيعي لها، حيث يتم لف الجسم حول محور الكرة صفار تقع مركزيا، إلى إعداد ثنائي الأبعاد (الشكل 1A). التصوير كله جبل الجنين الزرد الشباب محدودة بسبب طبيعة كيفية التفاف حول محور الجنينية صفار البيض. ونتيجة لذلك، وجهات النظر الجانبي أو الظهرية من جبل بأكمله يمكن أن العينات الجنين الملون التقاط سوى جزء من محور أو أنسجة معينة غامضة (الشكل 1B). على سبيل المقارنة، deyolking وتسطيح للجنين تمكن محور الجنينية بالكامل لتكون تصور في وقت واحد (الشكل 1B). وأثبتت هذه القيود عن طريق فحص الجنين WISH الملون التي وصفت مع riboprobes العقاقير للكشف عن irx3b (اللون الأرجواني)، الذي يصادف مجموعة فرعية من الأسلاف الكلوي تقع في جوار somites من 7 إلى 13، وmyod1 (الحمراء) التي تصفsomites (الشكل 1B). تحجب مجال irx3b + الكلوي الأسلاف في كل جبل جهة النظر الجانبي لأن النصوص irx3b وفيرة في النظام العصبي المركزي، مما يجعل مجال الكلوي المستحيل عمليا تصور مع زاوية الكاميرا الجانبي؛ أبعد من ذلك، مجال irx3b + الأسلاف الكلوي هو فقط مرئية جزئيا عندما يتم استدارة الجنين في عرض الكاميرا الظهرية لأن ملفوفة الميدان حول صفار (الشكل 1B). ومع ذلك، وهو رأي الظهرية من نفس الجنين بعد تركيب مسطحة تمكن الحقل بأكمله من irx3b + الأسلاف الكلوي ليتم تحليلها بطريقة واضحة فيما يتعلق و somites على طول الجذع الجنينية والهياكل الأخرى (الشكل 1B). وبالتالي، المجالات المكانية تفصيلا يمكن توثيقها بشكل مثالي مع هذا الأسلوب.
وتشارك العديد من الخطوات الرئيسية في التنفيذ الناجح لإجراء جبل مسطح. لتنفيذ هذه التقنيهه، لا بد من فصل صفار الكرة الأولى من الجنين السليم (الشكل 2A)، والذي يمكن القيام به مع أدوات مثل غرامة زوج من ملقط غرامة في حين تصور الجنين باستخدام stereomicroscope. بعد إزالة الخام على الكرة صفار، ويستخدم أداة السوط غرامة لكشط بعيدا حبيبات الصفار التي ظلت تعلق على الجنين (الشكل 2B). إزالة حبيبات صفار المتبقية يساعد على تسهيل التصور من الأنسجة الجنينية. أخيرا، يتم التلاعب الجنين deyolked لوضعه مستقر على شريحة زجاجية (الشكل 2C)، والتي تمكن وثائق المراقبة والمساعدات من العينة باستخدام برامج التصوير وكاميرا تعلق على المجهر. الأدوات والأجهزة السوط محلية الصنع التي يمكن بناؤها من قبل الالصاق على الرموش مناسبة لطرف ماصة superglue به، والذي يمكن تركيبه على مقبض إذا رغبت في (الشكل 3A، جدول المواد). عينات السوط مختلفة يمكن شراؤها لإنتاجالسوط أدوات ذات خصائص مختلفة قليلا من حيث الطول وتفتق (الشكل 3B)، والتي قد يكون لدى كل مستخدم الميول المختلفة لمرة واحدة فإنها تبدأ في تجربة مع الإجراء جبل مسطح. وتشمل الأمثلة على عينات السوط تسليط بشكل طبيعي الرموش الإنسان، تسليط طبيعي الشعر سلكي الحيوان أو شعيرات، وأخيرا أصناف الاصطناعية من جلدة المتاحة تجاريا وجدت في الإدارات مستحضرات التجميل بالتجزئة.
المنطقة المحلية المحيطة بها، والتي تحتوي على عينة (ق) وضعه على (4A الشكل) شريحة زجاجية يمكن تصوير لتحليل عالية الدقة. تم استخدام مزيج من تحقيقات للتسمية الأسلاف الكلوي النامية التي تؤدي إلى الكلى في نوع الجنين البرية في مراحل النمو المبكر مع اللونين WISH، ومن ثم تحميل مسطحة أجريت التحضيرات لعرض عينات (الشكل 4B، 4C ). خلال المراحل المبكرة الجسيدة، يتم ترسيمها الأسلاف الكلوي في نمط على شكل حرف U من قبل الالتعبير EIR النصوص pax2a (البنفسجية) المحيطة الأديم المتوسط مجاور للمحور الذي يعبر بصورة متزامنة دلتا C (DLC) (أحمر) (العمود الأيسر، الشكل 4B) 6،7. في المقابل، عندما تم الكشف عن محاضر DLC مع الركيزة الأرجواني، وكانت تسمى في تركيبة مع krox20 علامة الدماغ المؤخر (الحمراء)، وتصور فرعي منقاري من الأسلاف الكلوي التي تعبر عن DLC (العمود الأيمن، الشكل 4B)، كما لوحظ سابقا 6،7. جبل الاستعدادات مسطحة يمكن استخدامها على نحو مماثل لدراسة مراحل somitogenesis في وقت لاحق. في مرحلة الجسيدة 14، قمنا بتحليل التعبير عن علامات الكلوي pax2a، slc4a4، وslc12a3 (البنفسجية) جنبا إلى جنب مع smyhc1 (الحمراء)، الذي يصادف و somites (الشكل 4C). هذه المجموعات تمكين تعيين من كامل الكلوي المجال السلف مع pax2a، في حين كشف عن أن مجموعة فرعية من الخلايا في نطاق فرعي EXPR منقاريessed slc4a4a وتميزوا من قبل غير متداخلة فرعي الذيلية من الأسلاف الكلوي التي أعربت عن slc12a3.
WISH اللونين وجبل إعداد المسطحة هي أيضا قيمة لدراسة المجالات الخلوية خلال توالد الأعضاء في الزرد مع الطفرات الجينية أو الاضطرابات الأخرى من التعرض لعوامل بيئية إلى جزيئات صغيرة 6،7 (الشكل 5). وNLS الزرد والمسوخ ليب تؤوي طفرات في ألدهيد نازعة 1A2 (aldh1a2، المعروف سابقا باسم raldh2)، الذي يشفر إنزيم اللازمة لالحيوي من حمض الريتينويك (RA). RA أمر ضروري لتطوير السليم لكثير من أنواع الخلايا الكلوية بما في ذلك تشكيل خلايا خلية رجلاء التي تسهم في جعل تصفية الدم في الكلى الجنينية، والمعروفة باسم الكبيبة 6،7. تم إجراء WISH لتسمية الأسلاف خلية رجلاء مع wt1a بالتزامن مع ترسيم رانه وضع somites مع smyhc1 والدماغ المؤخر مع krox20 في الأجنة wildtype، NLS الأجنة متحولة والأجنة متحولة ليب، والأجنة تعامل مع ALDH مثبط انزيم الكيميائية، DEAB (الشكل 5). أظهرت الأجنة مع نقص التعبير aldh1a2 انخفاض التعبير wt1a مقارنة مع الأجنة النوع البري، في حين أظهرت الأجنة DEAB المعاملة وإلغاء النصوص wt1a (الشكل 5، العمود الأيمن). أخذت معا، تثبت هذه النتائج ممثل كيف يمكن استخدام هذه التقنية جبل مسطح لتحليل وتوثيق الاختلافات التشريحية بدقة في الجنين في وقت مبكر، وبالتالي تنفذ للدراسات التنموية قيمة.
الشكل 1. نظرة عامة على جبل استعدادات شقةالتموينية للالأجنة الزرد. أ) إجراءات تركيب مسطحة تمكن عرض في وقت واحد من الأنسجة الجنينية على طول المحور بسبب إزالة كتلة صفار المركزية والجنين وضعه مستقر على سطح مستو. B) صور لجبل بأكمله أتمنى الجنين الملون في وجهات النظر الجانبي والظهرية، ثم بعد أجري إعداد جبل مسطح. كانت ملطخة الجنين مع تحقيقات للكشف عن العقاقير النصوص الجينات ترميز irx3b (البنفسجية) وmyod1 (الحمراء).
الشكل 2. تخطيطي لإجراء جبل شقة للالأجنة الزرد. أ) يتم deyolked الجنين الأولى صارخ لإزالة غالبية كتلة صفار، ثم (B) وdeyolked السطح البطني بدقة لإزالة ما تبقى حبيبات الصفار، وبعد غسل الجنين هو (C) التي شنت الجانب الظهري حتى على شريحة زجاجية للتحليل البصري و / أو التصوير الفوتوغرافي.
الرقم 3. صور من أدوات السوط سبيل المثال مقارنة ملقط غرامة. أ) تم تصويرها أدوات السوط محلية الصنع جنبا إلى جنب مع زوج من ملقط غرامة قياسية المتمركزة المتاخمة للحاكم متري إلى توفير مرجع. B) عرض مكبر للأدوات السوط بجانب ملقط غرامة، مع الإشارة المقدمة ملليمتر على طول الجزء العلوي من رأي . وتظهر أداتين السوط مختلفة، مع النجمة (*) الذي يستخدم في تحديد الرموش الحصول عليها من تسليط طبيعي رمش الإنسان، والنجمة المزدوجة (**) تستخدم لوضع علامة على الرموش التي تم الحصول عليها من تسليط القطط طبيعي الطولي وقلص ل جعل نهاية حادة نوعا ما. في كل كاليفورنياحد ذاتها، والخيوط السوط من خلال طرف ماصة واضافته مع عدة طبقات من superglue لخلق تدريجيا ختم قوية لتحقيق الاستقرار / ترسيخ السوط إلى ماصة المرفقة إلى جهاز المناولة.
الشكل 4. توصيف التغييرات التنموية في مجال السلف الكلوي في نوع الجنين الزرد البرية. A) حرك التخطيطي مشيرا منطقة تصويرها للتحليل في (B، C). B) نوع البرية الأجنة في 1، 3، 5 وكانت ملطخة مرحلة الجسيدة بواسطة اللونين WISH لتقييم تكوين مجال السلف الكلوي الذي يعطي ترتفع إلى الكلى الجنينية، أو سليفة الكلوة. (يسار العمود) ترميز النصوص عامل pax2a النسخ (الملون باللون الأرجواني) احتفالا العديد من السكان في الجنين، بما في ذلك ع الكلويمجال rogenitor أن يخرج من الأديم المتوسط وسيطة. ترميز النصوص الشق يجند بمناسبة DLC و somites التي تشكل من الأديم المتوسط مجاور للمحور (الملون باللون الأحمر). (العمود الأيمن) عندما يتم فحص التعبير النصوص DLC (الملون باللون الأرجواني) والدماغ المؤخر قسيم معيني علامة krox20 (الملون باللون الأحمر) في نفس الأجنة والتعبير DLC يمكن ملاحظتها في مجال فرعي منقاري من الأسلاف الكلوي تقع في جوار somites 1-5، التي كانت تحجب خلال التعاون تلطيخ DLC مع pax2a. C) الأجنة النوع البري في المرحلة 14 الجسيدة كانت مزدوجة أو ثلاثية مع الملون ومزيج من علامة الكلوي (اللون الأرجواني)، وعلامة smyhc1 الجسيدة (الأحمر) ، والدماغ المؤخر قسيم معيني علامة krox20 (الأحمر أيضا). (لوحة الأعلى) وفي هذه المرحلة، لا تزال محاضر pax2a لترسيم الأسلاف الكلوي. (الشرق، والألواح السفلى) داخل الأراضي السلف الكلوي، ويتميز نطاق فرعي منقاريبواسطة slc4a4 والنصوص التي تكود slc12a3 بمناسبة فرعي الذيلية.
تمت مقارنة الرقم 5. إن استعمال مستحضرات شنت شقة لتوصيف الظواهر التي تسببها طفرات وراثية أو اضطرابات وراثية الكيميائية التي تعدل الحيوي حمض الريتينويك. نمط WISH التعبير في المرحلة 15 من الجسيدة wt1a (البنفسجية) وsmyhc1/krox20 (الأحمر) بين أنواع البرية والأجنة مع النقص في حمض الريتينويك (RA) الإنتاج بسبب عيوب في ألدهيد نازعة 1A2 (NLS والطفرات ليب) أو تثبيط النشاط الكيميائي للريتينالديهيد نازعة مع diethylaminobenzaldehyde (DEAB). خفض الإنتاج RA في ليب قليلا أكثر شدة من NLS، مثلأن الأجنة ليب التعبير عن انخفاض طفيف تلطيخ النصوص wt1a من قام بالمثل NLS الأجنة متحولة، في حين يرتبط العلاج DEAB من أنواع البرية مع إلغاء كامل للwt1a التعبير.
Discussion
وقد أثبتت الزرد لتكون النموذج الحي قيمة للغاية في جميع أنحاء الأوساط البحثية خلال السنوات الأخيرة. الزرد يحمل درجة كبيرة من الحفظ الوراثية مع أن من الفقاريات العليا، والمزايا المتعلقة التشريح، والتربية، ودورة حياتها جعل هذه الأنواع قابلة جدا للالتحليلات التجريبية. علاوة على ذلك، تقدم التقنيات الجزيئية المطبقة على الزرد أدت إلى زيادة تعزيز استخدام هذا النموذج الحي في البحث العلمي. على سبيل المثال، تم إنشاء مجموعة كبيرة ومتنوعة من خطوط الزرد المعدلة وراثيا لدراسة تطور المرض والإجابة على العديد من الأسئلة الأساسية التي تقوم عليها آليات رئيسية للتنمية بما في ذلك توالد الأعضاء.
وفقا لذلك، على أساس استخدام ديناميكية من الزرد في كل من المرض والبحوث التنموية ومنهجيات وضع العلامات والإشارات الخلية الكمي هي جانب هام من تحليل البيانات. بينما الأساليب التي توظف الفلورسنت وtibodies يمكن استخدامها للكشف عن البروتين التعبير في الزرد المعدلة وراثيا، يعتمد الباحثون عادة على الإجراءات القياسية مثل WISH 12-16 لدراسة توطين الزمانية المكانية من النصوص الجينات في عينة الزرد المعدلة وراثيا غير ثابتة. في الواقع، WISH هي واحدة من أكثر التقنيات المستخدمة على نطاق واسع في علم الأحياء 16، وأداة حيوية تستخدم لتوصيف النمط الظاهري من الطفرات الجينية والاضطرابات الوراثية الكيميائية. ومع ذلك، ويرتبط WISH مع عدد من المزالق والتحديات المحتملة. لتأكيد خصوصية ribroprobe العقاقير، بمعنى riboprobes يمكن استخدامها كوسيلة لمراقبة لتقييم خصوصية أنماط تلطيخ العقاقير riboprobe. في حين يتم عرض القسمين 4 و 5 في ترتيب وضع العلامات وكشف التحقيق المسمى digoxygenin تليها المسمى فلوريسئين التحقيق، يمكن عكس هذا الترتيب. عادة، وإشارات أضعف (الجينات مع انخفاض مستويات التعبير) والكشف عن أفضل مع تحقيقات المسمى digoxygenin وهذا وصمة عارأول من طور مع الركيزة الأرجواني، تليها الكشف وتلطيخ للإشارة أقوى (الجينات أعرب بزخم اكبر) باستخدام الركيزة الحمراء. ومع ذلك، إذا ردود الفعل اللونين ذاهبون إلى القيام بها، فمن المستحسن أن يتم اختبار توليفات مختلفة من التسميات وركائز للعثور على الإجراء الذي هو الأكثر ملاءمة لجمع البيانات وتحليلها. بالإضافة إلى ذلك، الأوقات المنصوص عليها حظر، حضانة الأجسام المضادة وغسل المقدمة في أقسام 4-5 مصممة للأجنة الذين تقل أعمارهم عن 24 التسميد آخر ساعة؛ فترات طويلة من هذه الخطوات نفسها مع أجنة كبار السن يمكن أن يؤدي إلى تراكم الملح على العينة. وقد تم بالفعل توثيق نصائح واسعة لاستكشاف القياسية الزرد الجنين WISH في الأدب 12-16. يمكن القول إن المعضلة الأكثر شيوعا هو خلفية عالية. نوصي زيادة عدد يغسل MABT في الخطوة 4.7 إلى 15-20 يغسل إذا لزم الأمر، على الرغم من تجربتنا في إضافة لMABT بين عشية وضحاها "فائقة غسل 'يعطي نتائج باهرة عندما تستخدم بالاقتران مع 10 أو أكثر يغسل MABT قصيرة قبل الانتقال إلى الخطوة 4.8. مثال آخر هو المعضلة الفقراء تسلل التحقيق، والتي يمكن أن تحدث مع riboprobes طويلة. يمكن قص riboprobe التالية الخطوة 3.6 من خلال التحلل القلوي تصدي لهذا. في تجربتنا مع عينات من الشباب، غير مطلوب عادة التحقيق القص. ومع ذلك، ينبغي للمرء أن نضع في اعتبارنا أن المعلمات مثل هذا يمكن العوامل المساهمة في نتائج تجربة WISH، ونقترح النظر في هذه التعليمات استكشاف الأخطاء وإصلاحها مفيدة بالفعل متاحة للجمهور في المجتمع حسب الحاجة لتحسين المعلمات التجريبية لWISH في بنفسك البحوث 12.
بالإضافة إلى التقنيات التقليدية WISH 12-16، كان هناك ظهور مستمر من التقدم في منهجيات WISH والبروتوكولات البديلة التي تم صياغتها. وتشمل هذه الطرق الجديدة للكشف عن إشارة، مثل من خلال استخدام الفلوريةcence 17-19، إلى الأساليب التي تمكن توطين microRNAs 20. وحتى مع ذلك، على الرغم من العديد من التحسينات التي أدخلت على طرق وضع العلامات الخلية الحالية، وتبطل فعالية هذه الإجراءات إذا كان وصمة عار (ق) لا يمكن تصور بسهولة داخل عينة من الفائدة في نقطة الوقت المطلوب. هذا القيد هو إشكالية للباحثين وخصوصا عندما تتعلق المراحل الجنينية المبكرة من تطور الجنين الزرد، والتي يمكن أن تؤدي إلى فجوات في فهمنا للعمليات التنموية المختلفة التي تنشأ في هذه الأوقات. أثناء تطوير الزرد العادية، وسوف الكيس المحي خفض تدريجي في حجم والجنين الأعمار 11. لذلك، في هذه المراحل التنموية في وقت لاحق (> آخر 24 ساعة الإخصاب)، WISH تلطيخ اضحة إلى حد ما لتحليل لأن الجنين أكبر مقارنة المجاورة لها الكيس المحي. ولكن هذا ليس هو الحال من مرحلة الذيل برعم إلى somitogenesis المبكر (عندما الجنينيةيتوضع الشامل حول صفار) حيث يمكن للالكيس المحي مبهمة أحيانا تحجب التصور من وصمة عار. بالتالي، لقد ابتكر طريقة تركيب مسطحة للمساعدة في تخفيف مشاكل التصوير وتحليل البيانات المرتبطة توصيف أوائل عينات الأجنة الزرد (schematized في الشكل 1 والشكل 2)، واستخدمت على نطاق واسع منذ phenotyping منهجية من الطفرات الوراثية معزولة من أول شاشات الوراثية على نطاق واسع 21.
منذ ظهور تقنية تركيب مسطحة، وتحليل مراحل النمو المبكرة قد تعززت بشكل كبير. مرة واحدة تتم إزالة صفار من الجنين، فمن الممكن لوضع الجنين شقة على شريحة زجاجية في الاتجاه المطلوب للتصوير. هذا الموقف ثنائي الأبعاد تمكن من مشاهدة الجنين بأكمله في وقت واحد، مما يلغي الحاجة لتدوير العينة. وتقع العديد من الأنسجة في مجالات واسعة من الجنين، مثلالسلائف التي تشكل الدم والكلى. علاوة على ذلك، قد يحتاج المرء للمقارنة بين العديد من أنسجة نامية مختلفة في وقت واحد. تركيب مسطحة تمكن الباحث لعرض في وقت واحد على المجال بالكامل من هذه الجماعات الخلية، وبالتالي يمكن أن تساعد إلى حد كبير quantifications مثل قياس مساحة للنسيج أو خلية من التهم الموجهة إليه. وقد ساعدت هذه التقنية في نهاية المطاف تؤدي إلى العديد من الاكتشافات المتعلقة مجموعة متنوعة من الآليات التنموية الهامة الكامنة تكون الدم، الخلايا العصبية، وتوالد الأعضاء. وبالتالي، بمجرد يتقن، وطلبات الحصول على هذه التقنية بسيطة للباحثين هي كبيرة جدا.
على سبيل المثال، في دراسة دراسة اختيار النسب أثناء تكون الدم، جبل الاستعدادات الأجنة الزرد شقة في المراحل الجسيدة 14 و 18 (اس اس) استخدمت لتوضيح التغييرات التي حدثت في نمط التعبير عن عامل النسخ إصبع الزنك بين PU.1 من النوع البري وgata1 morpholino حقن أجنة 22.تمكين هذه الطريقة في الكشف عن مجال PU.1 توسعت في 18 ق ق، مشيرا إلى أن gata1 هو الأكثر احتمالا تنظيم التعبير عن PU.1 في الكتلة الخلوية المتوسطة (ICM) حول هذه النقطة الوقت. أظهرت الأجنة شقة إضافية شنت الملون لمختلف الجينات محمر بما في ذلك gtpbp1 وepsin خسارة في التعبير عن هذه الجينات في المسوخ إل تي التي كانت gata1 - / -. وأظهرت التحليلات مزيد من أي تغيير في التعبير عن الجينات erythoid مثل biklf وtesthymin التي كانت معروفة لتكون مستقلة عن النشاط غاتا. لذلك، بالتزامن مع النتائج التجريبية الأخرى المترتبة عليها، تم الكشف عن أن gata1 أمر ضروري في تنظيم تمايز الخلايا ضمن النسب-myelo محمر. في دراسة للتنمية قمة العصبية، استخدمت يتصاعد شقة لدراسة crestin التعبير في مونت بلانك (الغوغاء M610) المسوخ في دراسةدراسة أدوار بلان مونت وظيفة الجين tfap2a 23. في 10 و 20 ق ق، ألغي crestin التعبير تماما في الرأس وانخفض في منطقة جذع الغوغاء المسوخ M610 بالمقارنة مع النوع البري العادي التعبير، والمساعدة في نهاية المطاف هذه المجموعة لإبرام حول أهمية مونت بلانك وtfap2a التنظيم خلال تشكيل قمة العصبية. بالإضافة إلى ذلك، من حيث توالد الأعضاء، مكنت يتصاعد شقة اكتشاف وجود مجالات متميزة في أوائل الحقل السلف الكلوي أثناء التطور الجنيني في الكلى الزرد، والمعروفة باسم سليفة الكلوة. يوفر الجنين الزرد نظام الحفظ واضحة حتى الآن تشريحيا لدراسة كيفية إعطاء الأسلاف الكلوي أدى إلى وحدات وظيفية نفرون التي تتألف منها سليفة الكلوة، وهي عملية تعرف باسم تكون الكلية 6،7 (الشكل 4). ظل ثابتا جبل التحليل المفيد المجالات ثيقة من وثائق إعادةالأسلاف ونال لتشريح نتائج التغييرات في إشارة RA خلال سليفة الكلوة الزخرفة 6،7 (الشكل 5)، والتي لم تكن معروفة سابقا. أخذت معا، هذه الأمثلة تشير إلى أن هناك بالفعل العديد من التطبيقات واسعة لهذا البروتوكول جبل شقة في دراسة العمليات المتنوعة التي تحدث أثناء التطور الطبيعي والدول المريضة.
من الناحية النظرية، هذا الإجراء جبل شقة بسيطة إلى حد ما عموما. ومع ذلك، يمكن التلاعب ودرجة الجودة المطلوبة لإتقان هذه الطريقة تكون صعبة للغاية لدرجة الماجستير في غياب مظاهرة البصرية. وبالتالي، تم تجميع هذا البروتوكول لتمكين الباحثين، وخاصة تلك الجديدة إلى نموذج الزرد، مع فرصة لفهم أفضل لكيفية تنفيذ هذه التقنية وتبادل نصيحتنا على الكواشف التي يمكن تحسين التعامل مع الأنسجة. نحن نأمل ان يكون هذا البروتوكول سيسمح في نهاية المطاف الآخرين في المجتمع لتحسين ظروف العينة الأكثر مثالية لتكون شااا للتصوير قسط، وتحليل البيانات، والاتصالات نتائجها في المنشورات. في نهاية المطاف، وهذا ينبغي تمكين الباحثين من أجل التغلب على العقبات التشريحية للالزرد خلال مرحلة التطور الجنيني المبكر، والتي يمكن أن تحجب عرض النتائج التجريبية، ولحل هذه من خلال استخدام هذه التقنية بسيطة ولكنها هامة.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل جزئيا من خلال تمويل لRAW من كل مما يلي: منح المعاهد الوطنية للصحة K01 DK083512، DP2 OD008470، وR01 DK100237؛ مسيرة من مليم باسل أوكونور كاتب الباحث جائزة منحة # 5 FY12-75؛ بدء الأموال من جامعة نوتردام كلية العلوم وقسم العلوم البيولوجية. نود بصفة خاصة أن أشكر إليزابيث ومايكل غالاغر، جنبا إلى جنب مع كامل غالاغر الأسرة، الذين المنقولة هدية سخية للجامعة نوتردام لتعزيز أبحاث الخلايا الجذعية. كان الممولين أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتحليلها، قرار نشر أو إعداد المخطوطة. نشكر الموظفين من قسم العلوم البيولوجية لدعمهم، ومركز للبحوث اسماك الزرد في نوتردام لتفانيهم المتميز في رعاية ورفاه لدينا مستعمرة الزرد. أخيرا، نشكر أعضاء مختبر أبحاثنا على تعليقاتهم والمناقشات والافكار حول هذا العمل، وكذلك القطيفة (Maripooka) وزينيا ينغيرت لتوفير تسليط طبيعي شعيرات القطط لجعل أدوات السوط اكثر من ممتاز لأبحاثنا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 X E3 | 250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination. | ||
| 1 X E3 | Dilute 50 X E3 in distilled water. | ||
| Mesh tea strainer | English Tea Store | SKU #ASTR_KEN, MPN#1705 | |
| Embryo incubation dish | Falcon | 35-1005 | |
| Transfer pipette | Samco | 202, 204 | |
| Flat bottom microcentrifuge tube | VWR | 87003-300; 87003-298 | |
| Glass vial | Wheaton | 225012 | |
| 1x PBST | 0.1% Tween-20 detergent in 1x PBS, made by diluting 10x PBS in distilled water. | ||
| Tween-20 stock | American Bioanalytical | AB02038 | |
| 10x PBS | American Bioanalytical | AB11072 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 19210 | |
| 4% PFA/1X PBS | Dissolve 4% PFA (w/v) in 1x PBS, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze aliquots for storage at -20 °C. Thaw just before use and do not refreeze stocks. | ||
| Filter sterilization unit | Corning | 430516 | 1 L filter system, 0.45 μm CA |
| MeOH | Sigma | 34860-4L | |
| Proteinase K | Roche | 03-115-879-001 | Dissolve in distilled water to make proteinase K stock (10 mg/ml) and store aliquots at -20 °C. |
| HYB+ | 50% formamide, 5x SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/ml yeast torula RNA, 50 μg/μl heparin | ||
| DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents | Roche | 11175025910; 11685619910 | Refer to manufacturer instructions. |
| SP6 RNA polymerase | Roche | 11487671001 | |
| T7 RNA polymerase | Roche | 10881775001 | |
| T3 RNA polymerase | Roche | 11031171001 | |
| RNase 1 inhibitor | Roche | 3335399001 | |
| DNase 1 inhibitor, 10x DNase 1 buffer | Roche | 4716728001 | |
| Glycogen | Roche | 10901393001 | |
| Ethanol (EtOH) | Sigma | E7023 | Aliquot 50 ml aliquots of 100% EtOH and 70% EtOH (diluted with molecular grade water) and store at -20 °C. |
| Molecular grade distilled water | Mediatech | 25-055-CM | |
| Waterbath | Thermo | 51221073 | Model 2831 |
| Nanodrop | Thermo | ND-2000c | |
| Formamide | American Bioanalytical | AB00600 | Store at -20 °C. |
| 20x SSC | American Bioanalytical | AB13156 | |
| MAB | 2 L formula: Into 1.5 L of distilled water, mix 23.2 g maleic acid, 17.5 g NaCl, 55.0 g Trisma base, then add 8 ml of 1M Tris-HCl pH 9.5, and then fill to 2 L. Autoclave. | ||
| MABT | MAB + 0.1% (v/v) Tween-20 | ||
| Block solution | We make in 50 ml fresh aliquots: 10 ml of BSA (from 10% lab stock), 5 ml of FCS (from stock), and 35 ml of MABT. Save unused block at 4 °C to use for antibody solution. Note: Thaw the BSA and FCS stocks at 37 °C–if you thaw at a higher temperature they become a thick gel (do not use). | ||
| FCS (fetal calf serum) stock | Invitrogen | 16140089 | Aliquot in 5 or 10 ml portions and store at -20 °C. |
| BSA (bovine serum albumin) stock | American Bioanalytical | AB00448 | Make a 10% stock diluted in MAB by dissolving the BSA flakes at room temperature with rapid stirring, then store 10 ml aliquots at -20 °C. Store undissolved BSA flakes at 4 °C. |
| Anti-digoxigenin antibody | Roche | 11-093-274-910 | Store at 4 °C. |
| Anti-fluorescein antibody | Roche | 11-426-338-910 | Store at 4 °C. |
| 12-well staining dish | BD-Falcon | 35-3225 | |
| Pre-staining buffer | 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% (v/v) Tween-20. Always make fresh: it will precipitate in the course of a few days. | ||
| Staining solution-purple | For every 10 ml needed: add 45 μl of NBT and 35 μl of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples). | ||
| Staining solution-red | For every 10 ml needed: add 31.5 μl of INT and 35 μl of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples). | ||
| NBT stock | Sigma | N6876 | Stored at -20 °C; powder diluted 50 mg/ml in 70% DMF, 30% water. |
| INT stock | Sigma | I8377 | Stored at -20 °C; powder diluted 55 mg/ml in 70% DMF, 35% water. |
| BCIP stock | Sigma | B8503 | Stored at -20 °C; powder diluted 50 mg/ml in 100% DMF. |
| DMF (dimethylformaldehyde) | American Bioanalytical | AB00450 | |
| Glycine | Sigma | G8898 | 0.1 M glycine, pH 2.2 |
| Small plastic Petri dish | Corning | 430589, 430588 | |
| Glycerol | Sigma | G7893 | |
| Fine forceps | Roboz | RS-1050 | Dumont Tweezers Pattern #55 |
| Lash tool | Constructed by affixing a suitable lash to a pipette tip (sizes ranging from P10-P1000 can be used) using superglue. We use a naturally shed human eyelash, a naturally shed animal whisker or wiry fur coat hair, or a natural or synthetic lash purchased from the beauty department at a pharmaceutical or retail store (extra long lashes are most amenable to stable mounting on the pipette tip). The pipette tip is affixed onto a straight rod (8-10 cm in length) such as a needle holder (e.g., Fisher 08-965-A) for easy handling. See Figure 3 for images of these homemade tools. | ||
| Glass slide | Thermo-Fisher | 4445 | White Frost |
| Glass coverslip | Thermo-Fisher | 12-540A | 18 x 18 mm |
| Modeling clay | Hasbro | Playdoh | Other craft modeling clay products can be substituted. |
| Slide holder | Thermo-Fisher | 12-587-10 | Cardboard tray to store slides flat. |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ645, SMZ1000 | |
| Compound microscope | Nikon | 80i, 90i |
References
- Laale, H. W. The biology and use of zebrafish, Brachydanio rerio in fisheries research. A literature review. J Fish Biol. 10, 121-173 (1977).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
- Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J Biomed Biotechnol. 2012, (2012).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).
- Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. J Am Soc Nephrol. 16, 299-304 (2005).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet 3. , (1922).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals form retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).
- Tamplin, O. J., et al. Small molecule screening in zebrafish: swimming in potential drug therapies. WIREs Dev Biol. 1, 459-468 (2012).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. 3rd ed. , University of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Kimmel, C. B., et al. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nat Protoc. 3, 59-69 (2008).
- Moens, C. Whole mount RNA in situ hybridization on zebrafish embryos: probe synthesis. CSH Protoc. 3, DOI: 10.1101/pdb.prot5036. , (2008).
- Moens, C. Whole mount RNA in situ hybridization on zebrafish embryos: hybridization. CSH Protoc. 3, DOI: 10.1101/pdb.prot5037. , (2008).
- Moens, C. Whole mount RNA in situ hybridization on zebrafish embryos: mounting. CSH Protoc. 3, DOI: 10.1101/pdb.prot5038. , (2008).
- Machluf, Y., Levkowitz, G. Visualization of mRNA expression in the zebrafish embryo. Methods Mol Biol. 714, 83-102 (2011).
- Brend, T., Holley, S. A. Zebrafish whole mount high-resolution double fluorescent in situ hybridization. J Vis Exp. 25 (25), (2009).
- Lauter, G., et al. Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems. BMC Dev Biol. 11 (43), 1-11 (2011).
- Lauter, G., et al. Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain. Neural Dev. 6 (10), 1-13 (2011).
- Lagendijk, A. K., et al. Revealing details: whole mount microRNA in situ hybridization protocol for zebrafish embryos and adult tissues. Biol Open. 1, 566-569 (2012).
- Haffter, P., Nüsslein-Volhard, C. Large scale genetics in a small vertebrate, the zebrafish. Int J Dev Biol. 40, 221-227 (1996).
- Galloway, J. L., et al. Loss of Gata1 but not Gata2 converts erythropoiesis to myelopoiesis in zebrafish embryos. Dev Cell. 8, 109-116 (2005).
- Barrallo-Gimeno, A., et al. Neural crest survival and differentiation in zebrafish depends on mont blanc/tfap2a gene function. Development. 131, 1463-1477 (2003).
