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Biology

Preparazione di montaggio schermo per l'osservazione e l'analisi di zebrafish campioni macchiato da Whole Monte Published: July 17, 2014 doi: 10.3791/51604
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, University of Notre Dame

Summary

L'embrione zebrafish è un ottimo modello per la ricerca biologia dello sviluppo. Durante l'embriogenesi, zebrafish sviluppare con una massa tuorlo, che presenta sfide tridimensionali per l'osservazione e l'analisi del campione. Questo protocollo descrive come creare bidimensionali montaggio preparazioni semplici di tutto il monte in situ (WISH) colorati esemplari embrioni di zebrafish.

Abstract

L'embrione zebrafish è oggi comunemente utilizzato per la ricerca di base e biomedica per studiare il controllo genetico dei processi di sviluppo e di modellare anomalie congenite. Durante il primo giorno di vita, l'embrione di zebrafish progredisce attraverso molte fasi di sviluppo, tra cui la fecondazione, segmentazione, gastrulazione, la segmentazione, e l'organogenesi di strutture come il rene, cuore e sistema nervoso centrale. L'anatomia di un giovane embrione di zebrafish presenta diverse sfide per la visualizzazione e l'analisi dei tessuti coinvolti in molti di questi eventi, perché l'embrione si sviluppa in associazione con una massa tuorlo round. Così, per l'analisi accurata e di imaging di fenotipi sperimentali in campioni embrionali fissi tra il tailbud e 20 somiti stadio (10 e 19 ore dopo la fecondazione (HPF), rispettivamente), come quelli colorati con tutta montare ibridazione in situ (WISH), essa è spesso desiderabile rimuovere l'embrione dal tuorlo besaurito e posizionarlo piatto su un vetrino. Tuttavia, l'esecuzione di una procedura piatto di montaggio può essere noioso. Pertanto, efficace ed efficiente piano di montaggio preparazione è notevolmente facilitata attraverso la dimostrazione visiva della tecnica dissezione, e anche aiutato da utilizzando reagenti che aiutano nella gestione ottimale dei tessuti. Qui, forniamo il nostro protocollo augurio per il rilevamento di uno o due colori dell'espressione genica nell'embrione zebrafish, e dimostrare come la procedura di montaggio piatta può essere eseguita su questo esempio di un campione fisso colorato. Questo protocollo di montaggio piatta è ampiamente applicabile allo studio di molte strutture embrionali che emergono durante primo sviluppo zebrafish, e può essere implementata in combinazione con altri metodi di colorazione eseguite su campioni embrionali fissi.

Introduction

Il zebrafish, Danio rerio, è diventata un organismo ampiamente utilizzato nello studio della biologia dello sviluppo. Zebrafish sono un tropicali, specie d'acqua dolce vertebrati appartenenti alla famiglia dei ciprinidi. Zebrafish sono stati inizialmente utilizzati per la ricerca ambientale per ottenere informazioni sui pericoli di potenziali sostanze inquinanti dell'acqua, come erano facilmente reperibili, poco costoso e facile da mantenere 1. Negli ultimi 30 anni, il pesce zebra è stato riconosciuto come un docile geneticamente sistema modello vertebrato per una serie di motivi. Zebrafish mostrano un alto livello di conservazione anatomica e fisiologica con vertebrati superiori inclusi mammiferi 2,3. Recenti sequenza annotazione del genoma ha rivelato che circa il 70% dei geni umani hanno almeno una controparte zebrafish 4. Ad esempio, molti geni ortologhi che svolgono un ruolo importante durante lo sviluppo renale sono state riscontrate tra queste specie 5-7. Questo dramatic grado di conservazione per quanto riguarda la biologia cellulare e molecolare ha permesso ai ricercatori di creare modelli per una vasta gamma di malattie umane in zebrafish 8, e zebrafish sono diventati uno strumento prezioso per identificare potenziali terapie farmacologiche utilizzando schermi genetici chimiche 9.

Inoltre, il modello zebrafish è in grado non solo di ricapitolare una serie di complessi processi di sviluppo e stati di malattia che si vedono negli esseri umani, ma diversi attributi aggiuntivi anche aumentare il suo appeal come organismo modello per gli studi embriologici. Zebrafish sono ovipari e si riproducono attraverso la deposizione delle uova di trasmissione, che fornisce ai ricercatori un facile accesso agli embrioni dall'inizio della fecondazione 10. Altri vantaggi includono la dimensione dell'embrione, la trasparenza, e rapido, sviluppo esterno 10. Inoltre, gli adulti di zebrafish possesso di elevata fecondità e di solito producono relativamente grandi dimensioni della covata che può variare tra 200-500a settimana, in ultima analisi, consentendo ai ricercatori di condurre esperimenti di throughput elevato, come ad esempio gli schermi chimici fenotipo based, con facilità 9.

Anche così, nonostante la pletora di vantaggi che vengono esposti dal modello zebrafish, ci sono sfide che riguardano l'analisi e la comunicazione dei risultati sperimentali ottenuti da primi stadi di sviluppo. In alcuni casi, l'anatomia intrinseca del zebrafish potrebbe oscurare la visualizzazione dei dati propri. Dopo la fecondazione, la cellula iniziale subisce più eventi scissione progredire dello sviluppo 11. Seguendo gastrulation, l'asse embrionale emerge nella fase tailbud (10 HPF) tale che è avvolto intorno al tuorlo 11. Come successivo sviluppo procede attraverso il periodo di segmentazione, il tronco crescerà in massa e anche allungare da allungamento assiale tale che una coda con una porzione del sacco vitellino si estendono dalla massa tuorlo centrale11. Tra il tailbud e 20 stage somite (19 HPF), i tentativi di osservare le caratteristiche specifiche di sviluppo dopo l'utilizzo di diversi protocolli di colorazione, come WISH, può essere difficile sia per visualizzare e fotografare a causa della geometria dell'embrione e l'opacità del il sacco vitellino. Un modo per eliminare questi problemi è quello di rimuovere il tuorlo e poi appiattire l'embrione in un campione bidimensionale che può essere analizzato in modo più semplice.

Le seguenti risorse di protocollo e video, forniscono una guida per come deyolk successo e TV montare un embrione seguente fissazione e colorazione, utilizzando l'esempio di uno o due colori WISH colorazione. WISH è una tecnica largamente usata che consente il rilevamento di specifici acidi nucleici in campioni conservati e permette per il sito (s) di espressione genica da rilevare all'interno dei tessuti così. Tecniche WISH sono state ampiamente descritte, e può essere eseguita con vari substrati colori nonché l'influenzasistemi di rilevamento orescent 12-20. Qui forniamo il nostro protocollo WISH modificato utilizzato per gli embrioni di zebrafish tra le tailbud e segmentazione fasi di sviluppo. Protocolli WISH alternativi, tuttavia, sono compatibili con la procedura di montaggio piatto qui descritto, come rilevato in via preliminare del protocollo di seguito. Inoltre, montaggio piatto potrebbe essere utilizzato in combinazione con qualsiasi numero di tecniche di visualizzazione esistenti, come tutta la immunoistochimica mount, o linea cellulare etichette di monitoraggio, che non sono descritti in questo protocollo. Nel complesso, la tecnica di montaggio flat può consentire una migliore analisi superiore e la presentazione dei dati ottenuti da esperimenti con le prime fasi di sviluppo embrionale in zebrafish.

Protocol

Le procedure per l'utilizzo di embrioni di zebrafish descritte in questo protocollo è stato approvato dal Comitato Istituzionale cura degli animali ed uso presso l'Università di Notre Dame. Nota: Le procedure descritte nelle parti 1-5 sono stati usati per generare le immagini embrione qui forniti nei risultati rappresentativi. Le procedure descritte nelle Parti 1-5 potrebbero essere sostituiti, se lo desideri con procedure alternative WISH 12-16 o altre tecniche di visualizzazione come l'etichettatura immunoistochimica per le proteine ​​specifiche utilizzando anticorpi specifici. Nello svolgimento monta piatti sul WISH embrioni di zebrafish con il protocollo descritto nelle parti 1-5, la fissazione embrione iniziale e finale passaggi di fissaggio colorazione sono le principali manipolazioni che influiscono sulla capacità di rimuovere granuli tuorlo dal campione per il montaggio piatta. I migliori risultati montaggio piatta si ottengono quando la determinazione iniziale viene eseguita con ghiaccio appena scongelati freddo 4% paraformaldeide (PFA) / PBS 1x e la fissazione deiil WISH reazione di colorazione finale con ghiaccio freddo 4% PFA/1x PBS (che non ha bisogno di essere appena scongelati), e si consiglia che i lettori di considerare questo quando si sostituiscono i metodi di colorazione alternativi in ​​combinazione con parti 6-8.

1. Embrione Collection, Fissazione e bagagli

  1. Preparare gabbie accoppiamento mettendo maschio adulto zebrafish (s) e femmina (s) in camere di acqua sistema in modo che essi sono separati da un divisore notte.
  2. Rimuovere i divisori tra adulti e raccogliere le uova fecondate con un filo sottile maglia di tè filtro all'interno ~ 15-30 min di accoppiamento per raccogliere frizioni che hanno stadi embrionali equivalenti.
  3. Girare il filtro a testa in giù e risciacquare la superficie con un flusso di E3 erogato da uno spruzzatore per trasferire gli embrioni in piatti di incubazione contenente circa 25 ml di soluzione E3.
  4. Dopo aver raccolto le frizioni, dividerli in diversi piatti in modo tale che circa 50-60 embrioni vengono incubatiin ogni piatto di 25 ml di soluzione E3. Nota: Il sovraffollamento degli embrioni può portare a drammatiche asincronia di sviluppo all'interno della frizione e la cura devono essere prese per evitare questo per consentire tempestiva raccolta del palco (s) lo desideri.
  5. Incubare gli embrioni a 28,5 ° C per consentire la valutazione dello sviluppo secondo il zebrafish serie messa in scena di serie 11.
  6. Utilizzare una pipetta di trasferimento di plastica per posizionare con cura il numero desiderato di embrioni al timepoint selezionato, fino alla fase 20 somite (19 HPF), in una provetta fondo piatto. Nota: Fare attenzione nella gestione di giovani embrioni, in quanto sono fragili e possono essere facilmente danneggiati da schiacciamento o manipolazione aggressiva con pipette. In alternativa, fiale di vetro possono essere utilizzati per il fissaggio e il trattamento degli embrioni. Per tutti i successivi lavaggi protocollo di pipette di plastica possono essere utilizzati, con l'eccezione di riboprobe aggiunta e la rimozione (passaggi 3.11, 3.14).
  7. Sostituire la E3 con ghiaccio freddo 4% PFA/1x PBS, efissare gli embrioni nelle loro chorions nel 4% PFA/1x PBS per 4 ore a temperatura ambiente o in una notte a 4 ° C. Nota di cautela: PFA è tossico e soluzioni PFA deve essere gestita in una cappa chimica indossando dispositivi di protezione individuale idonei, compresi i guanti ed un camice da laboratorio. Inoltre, polvere PFA deve essere maneggiato con cura eccezionale momento della soluzione di riserva, come anche il granulato PFA può tendere a disperdersi attraverso la carica statica. Tipicamente PFA è preparato riscaldando il PBS 1x a ebollizione per sciogliere la polvere PFA, e poi la soluzione viene conservata in aliquote a -20 ° C. Se sedimenti fini sono presenti nel 4% PFA/1x PBS volta la soluzione viene raffreddata, filtro sterilizzare la soluzione raffreddata prima aliquotando di conservazione in congelatore facendola passare attraverso un filtro da 0,45 micron. Solo preparato fresco o appena scongelati PFA è usato per questo iniziale (cioè primario) fissazione dell'embrione.
  8. Togliere la correzione e lavare gli embrioni due volte con 1x PBST, poi il trasferimento inun piatto di incubazione.
  9. Guarda gli embrioni allo stereomicroscopio e usare due paia di pinze sottili per rimuovere le chorions che circondano gli embrioni, in modo tale che una coppia viene utilizzata per sfruttare delicatamente l'embrione, mentre la seconda coppia è utilizzata per strappare aperto il corion.

2. Permeablization Embryo

  1. Trasferire gli embrioni dechorionated indietro nella provetta di vetro o fiala, quindi risciacquare due volte con 1x PBST per rimuovere ogni residuo di detriti corion.
  2. Rimuovere la 1x PBST e lavare gli embrioni due volte con il 100% di metanolo (MeOH).
  3. Mettere gli embrioni a -20 ° C per almeno 20 min. Nota: Gli embrioni possono essere conservati a -20 ° C in MeOH per un anno o più. Metanolo rende i chorions appiccicoso, quindi non procedere a questa fase a meno che i chorions sono stati rimossi.
  4. Reidratare gli embrioni rimuovendo il MeOH 100% e lavarli a temperatura ambiente per 5 min ciascuna nel 50% MeOH/1x PBST, 30% MeOH/1x PBST, poi due volte con PBST 1x. </ Li>
  5. Preparare una soluzione fresca proteinasi K di lavoro (5 mg / ml), con l'aggiunta di 25 ml di proteinasi appena scongelato K stock (10 mg / ml) a 50 ml di 1x PBST.
  6. Rimuovere la 1x PBST dagli embrioni, quindi sostituire con la proteinasi K soluzione di lavoro e incubare a seconda della fase embrionale: <= 5 somiti per 1 min; 10-12 somiti per 1,5 min; 15 somiti per 2 min e 20 somiti per 3 min.
  7. Rimuovere la soluzione di lavoro proteinasi K e lavare gli embrioni due volte con 1x PBST.
  8. Rimuovere la 1x PBST e sostituirlo con ghiaccio freddo 4% PFA/1x PBS per almeno 20 minuti a temperatura ambiente.

3. Riboprobe Synthesis, preibridazione, ibridazione, e rimozione della sonda

  1. Assemblare il antisenso riboprobe reazione di trascrizione in vitro a temperatura ambiente in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga, mantenendo enzimi su ghiaccio, combinando uno stampo di DNA contenente la sequenza corrispondente al gene di interesse (sia 100-200 ng di PCRprodotto o 1.5 pg di DNA plasmidico linearizzato, preparato come descritto 12,13), 2 microlitri di digossigenina o fluoresceina ribonucleotidi etichettati, 2 microlitri del caso polimerasi RNA (SP6, T3, T7 seconda di quale sequenza è incorporato nel prodotto PCR o presente sul plasmide DNA), 2 microlitri di tampone 10x trascrizione, 0,5 ml di inibitore della RNasi, e portare ad un volume totale di 20 ul di acqua distillata grado molecolare (DNasi, RNasi libero). Nota: Il tampone 10x trascrizione deve essere preriscaldata ponendo la provetta in un bagno d'acqua 37 ° C per 10-20 min, e poi in agitazione per assicurare che tutti i componenti siano in soluzione. Se fiocchi bianchi sono presenti, incubare la provetta per un altro 5-10 minuti e vortice di nuovo. Le reazioni di trascrizione possono fallire o di avere scarsa resa se il buffer di trascrizione non è completamente sciolto e accuratamente miscelati.
  2. Miscelare i componenti e incubare ciascuna reazione a 37 ° C per 2 ore in un bagno d'acqua.
  3. Rimuovere la reazione tuessere (s) dal bagnomaria, e distruggere il modello di DNA in ogni campione con l'aggiunta di 5 ml di 10x DNasi I buffer, 2 ml di DNasi I Enzyme, e 23 ml di acqua distillata grado molecolare per portare il volume totale di 50 microlitri, e poi incubare ogni tubo a 37 ° C per 20 minuti in un bagno d'acqua.
  4. Eseguire una precipitazione in etanolo in ogni provetta aggiungendo 5 ml di 3 M acetato di sodio, pH 5,2 e 110 ml di ghiaccio freddo 100% etanolo, seguito da 1 ml di glicogeno magazzino per facilitare la visualizzazione pellet di RNA in fasi successive, e poi incubare la tubo a -20 ° C per almeno 1 ora o durante la notte.
  5. Centrifugare ogni provetta alla massima velocità di 4 ° C per 20 minuti, quindi rimuovere il 100% di etanolo surnatante e sostituire con 100 ml di 70% etanolo freddo ghiaccio.
  6. Centrifugare ogni provetta per microcentrifuga a 4 ° C per 5 min, quindi rimuovere il surnatante e aria etanolo 70% asciugare il pellet per 5 minuti, infine aggiungere 100 ml di mograde lecular acqua distillata per risospendere il pellet e quantificare la concentrazione di magazzino riboprobe utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop. Nota: Una volta che il pellet è andato in soluzione, la riboprobe magazzino deve essere tenuto in ghiaccio e conservato a -20 ° C.
  7. Per preparare gli embrioni fissati per il processo prehybridization, rimuovere il 4% PFA/1x PBS da ogni campione e lavare gli embrioni due volte con 1x PBST.
  8. Trasferimento tra 25-40 embrioni in 1x PBST in ogni singola provetta fondo piatto. Nota: Il sovraffollamento degli embrioni porterà a macchie irregolari più tardi, e la cura dovrebbe essere presa per limitare la dimensione del campione in ogni provetta di circa 40 embrioni.
  9. Sostituire la 1x PBST in ogni tubo con 500-1000 ml di HYB +.
  10. Posizionare il tubo (s) di embrioni in un forno a 70 ° C, e incubare a questa temperatura per 4 ore per eseguire prehybridization.
  11. Preparare il riboprobe / HYB + soluzione con l'aggiunta di 100-500 ng di riboprobe (digossigenina e / o flein marcato) a 500 ml di fresco HYB + e poi incubare questa soluzione a 70 ° C per almeno 20 minuti prima del punto 3.11 per preriscaldare esso. Nota: Per rilevare più trascritti genici, utilizzando l'etichettatura colorimetrica singola e / o doppia, ciascuna delle riboprobes corrispondenti a questi geni devono essere combinati in un unico riboprobe / HYB + cocktail.
  12. Rimuovere il HYB prehybridization + da ciascuna provetta di embrioni e sostituirlo con sufficiente riboprobe / HYB + a coprire gli embrioni. Nota: in genere, è necessario per coprire gli embrioni in una provetta a fondo piatto 200-250 ml di riboprobe / HYB +. Riboprobe / HYB + aggiunta e la rimozione è in genere eseguita utilizzando un puntali per pipette e di barriera per evitare la contaminazione incrociata tra i campioni.
  13. Incubare gli embrioni a 70 ° C per una notte con ribroprobe / HYB +.
  14. Preparare la seguente serie di soluzioni di lavaggio e di pre-riscaldamento durante la notte a 70 ° C: 50% formamide/2x SSCT, 2x SSCT e 0.2x SSCT. Nota: E 'necessario per preparare 50 ml aliquots di ciascuna soluzione di lavaggio, perché l'eccesso può essere conservato a temperatura ambiente e successivamente riscaldato per un uso futuro.
  15. Rimuovere il riboprobe / HYB + utilizzando una pipetta e barriera suggerimenti e conservare a -20 ° C. Nota: in genere ogni riboprobe / HYB + miscela possono essere utilizzati più volte (ad esempio, 3 o più) senza diminuzione di segnale. Mentre riutilizzati riboprobe / HYB + è associato con sfondo più basso, tuttavia, tenere presente che riutilizzati miscele riboprobe possono essere soggetti a degrado.
  16. Lavare gli embrioni due volte con 50% SSCT formamide/2x per 30 min a 70 ° C.
  17. Lavare gli embrioni una volta con 2x SSCT per 15 min a 70 ° C.
  18. Lavare gli embrioni due volte con 0.2x SSCT per 30 min a 70 ° C.
  19. Rimuovere il SSCT 0.2x e lavare gli embrioni due volte con MABT a temperatura ambiente.

4. Anti-digossigenina Incubazione e rilevamento

  1. Preparare la soluzione del blocco fresca.
  2. Rimuovere il MABT e sostituirlo con il blocco soluzionezione.
  3. Incubare gli embrioni in soluzione di blocco per 2-4 ore a temperatura ambiente. Nota: incubazione blocchi più lunghi di risultati ottimali con i giovani embrioni fasi di zebrafish (<15 somiti). Per effettuare la procedura di blocco lungo, eseguire il blocco incubazione per 8-12 ore a temperatura ambiente o una combinazione di temperatura ambiente più (fino a ~ 8 ore) una successiva 4 ° C notte di incubazione.
  4. Preparare la soluzione di anticorpi anti-digossigenina facendo una piega diluizione 5.000 in soluzione fresca blocco (ad esempio, 1 pl per 5 ml di blocco).
  5. Rimuovere il blocco e aggiungere la soluzione di anticorpi / blocco.
  6. Coprire il campione in strisce e incubare una notte a 4 ° C o per 4 ore a temperatura ambiente.
  7. Rimuovere il anti-digoxygenin/block e lavare gli embrioni almeno 10 volte con MABT. Nota: Il trasferimento degli embrioni ai piatti da 12 pozzetti per i lavaggi MABT. Questo aumenta la velocità con cui gli embrioni possono essere lavati, che è utile quando si elaborano grandi quantità di campione, unnd rende facile monitorare l'andamento della reazione di colorazione (punto 4.11) sotto uno stereomicroscopio. Nota: a questo punto gli embrioni possono essere 'super-washed' incubando durante la notte in MABT a 4 ° C prima di procedere alla fase 4.8, che è un trattamento utile per le sonde che tendono a dare alta priorità bassa o macchie che richiedono una lunga monitoraggio durante l' lavorare giorno.
  8. Preparare il buffer di pre-colorazione e la soluzione colorante desiderato (substrato viola o rosso).
  9. Rimuovere il MABT e lavare gli embrioni in tampone pre-colorazione per 5 min a temperatura ambiente.
  10. Rimuovere il buffer di pre-colorazione e aggiungere la soluzione colorante.
  11. Monitorare l'andamento della temperatura di reazione di colorazione camera ogni 15-30 min controllando l'aspetto degli embrioni allo stereomicroscopio. Nota: La velocità della reazione di colorazione può essere rallentato trasferendo i campioni a 4 ° C, se è necessario dare più tempo per il completamento della macchia. Una volta raffreddato a 4° C, tuttavia, la reazione non può essere accelerata mediante riscaldamento a temperatura ambiente.
  12. Quando la reazione di colorazione, rimuovere la soluzione colorante e sostituirlo con 1x PBST.
  13. Lavare due volte con 1x PBST per 5 min. Nota: se non rilevare altri geni con un altro substrato, quindi fissare i campioni in ghiaccio freddo 4% PFA/1x PBS per almeno 20 minuti, e passare al punto 6.1. Altrimenti procedere al punto 5.1.

5. Anti-fluoresceina Incubazione e rilevamento

  1. Rimuovere la 1x PBST e lavare gli embrioni due volte con 0,1 M glicina, pH 2,2 per 15 minuti ciascuno a temperatura ambiente. Nota: Il tempo per i lavaggi glicina è essenziale per disattivare completamente la prima reazione di colorazione.
  2. Rimuovere il 0,1 M glicina e lavare gli embrioni due volte con MABT per 5 min a temperatura ambiente.
  3. Preparare la soluzione di anticorpi anti-fluoresceina facendo una piega diluizione 5.000 in soluzione fresca blocco (ad esempio, 1 pl per 5 ml di blocco).
  4. Rimuovere il MABT e aggiungere la soluzione di anticorpi / blocco. Seguire i passaggi 4,6-4,13 per eseguire la rilevazione del ribroprobe con fluoresceina. Nota: Quando la reazione finale colorazione è completata, è essenziale che l'ultima fissazione del campione avviene in ghiaccio freddo 4% PFA/1X PBS. Fissazione con caldi soluzioni PFA tende ad essere associata con tuorlo appiccicoso che è difficile da rimuovere dall'embrione durante la dissezione e deyolking per la procedura di montaggio piatta.

6. Dissezione dell'embrione e Deyolking iniziale dell'embrione

  1. Selezionare un embrione macchiato fissato per il montaggio piatta.
  2. Utilizzare una pipetta di trasferimento per posizionare il campione embrione selezionato in un piatto di plastica o di vetro Petri contenente 1x PBST.
  3. Porre la capsula sotto uno stereomicroscopio, e rotolare l'embrione utilizzando un paio di pinze sottili o strumento di ciglia in modo da ottenere una vista laterale e le estremità testa e di coda sono visualizzati.
  4. Utilizzare un paio di pinze pregiati per fare un'incisione in the tuorlo in una posizione centrale tra la testa e la coda dell'embrione, e nel frattempo utilizzare una seconda coppia di pinza sottile per contenere l'embrione in modo da fornire leva per l'incisione tuorlo. Nota: In alternativa, fare due importanti incisioni nel tuorlo, uno vicino alla testa e l'altro vicino alla coda dell'embrione.
  5. Utilizzare una pinza sottile e / o di uno strumento di ciglia per raccogliere il tuorlo dalla cavità delle cellule tuorlo.
  6. Sciacquare l'embrione delicatamente con 1x PBST per rimuovere tuorlo randagi.

7. Fine Deyolking dell'embrione

  1. Trasferire l'embrione di un vetrino piano con 1-2 gocce di 1x PBST.
  2. Utilizzare uno strumento di ciglia e pinza sottile per posizionare delicatamente l'embrione con il ventrale (tuorlo) rivolto verso l'alto sul vetrino.
  3. Trascinare l'embrione al bordo della soluzione 1x PBST utilizzando lo strumento ciglia in modo che l'embrione rimane in posizione piatta contro il vetrino.
  4. Raschiare la superficie ventrale dell'embrione delicatamente con la frusta aolo per rimuovere i granuli di tuorlo senza strappare l'embrione. Contemporaneamente utilizzare un paio di pinze sottili per ancorare l'embrione, mentre raschiando con lo strumento di ciglia. Nota: La rimozione dei granuli di tuorlo può richiedere raschiatura ripetitivo per 5-10 min.
  5. Se la soluzione PBST diventa ingombra di eccesso di tuorlo o comincia ad evaporare, aggiungere 1-2 fresche gocce di 1x PBST alla diapositiva con una plastica o il trasferimento pipetta di vetro, e quindi trascinare l'embrione alla zona con la soluzione pulita per ulteriori tuorlo granuli rimozione.
  6. Quando il tuorlo è stato rimosso in modo soddisfacente, utilizzare una pipetta di trasferimento per spostare delicatamente l'embrione di nuovo in un piatto di plastica o di vetro Petri contenenti 1x PBST per un risciacquo finale per rimuovere granuli tuorlo randagi.
  7. Trasferire l'embrione deyolked utilizzando una pipetta di plastica o vetro in un piatto di plastica o di vetro Petri contenente 100% glicerolo.
  8. Incubare l'embrione in 100% glicerolo per ~ 5 minuti per ambientarsi l'embrione.

8. Montaggio su un vetrino

  1. Trasferire l'embrione deyolked ad un vetrino pulito in 1-2 gocce di 100% glicerolo.
  2. Posizionare l'embrione con la ventrale (tuorlo) rivolto verso il vetrino.
  3. Utilizzando uno strumento ciglia, trascinare l'embrione al bordo della goccia glicerolo modo che l'embrione rimane in posizione piatta contro il vetrino. Se l'asse embrionale è curvo, utilizzare i pinza sottile per rendere delicatamente molto piccole incisioni nella restante membrana cellulare tuorlo per alleviare la tensione in modo che l'embrione può essere posizionato piatto sul vetrino con un asse rettilineo.
  4. Mettere piccole zolle di plastilina sui quattro angoli di un 18 x 18 millimetri di vetro coprioggetto. Nota: In alternativa, piccole gocce di grasso per vuoto 15 può essere sostituito per plastilina.
  5. Posizionare il coprioggetto vetro piano sull'embrione, pesca il coprioggetto per minimizzare la formazione di bolle d'aria nel glicerolo attorno al campione.
  6. Aggiungere un ulteriore calo del 100% gliceroloal lato del vetrino di vetro per riempire lo spazio tra il vetrino e il vetrino.
  7. Premere lentamente e con attenzione sui quattro angoli del coprioggetto per posizionare saldamente l'embrione tra il vetro ed eliminare alla deriva. Nota: Fare attenzione a non schiacciare l'embrione.
  8. Se l'embrione non è posizionato come desiderato, utilizzare una pinza sottile per rimuovere il vetrino. Utilizzare lo strumento ciglia per riposizionare l'embrione e / o pinza sottile per praticare incisioni aggiuntive in modo che l'embrione può essere riposizionato. Ripetere i passaggi 8,4-8,7.
  9. Osservare e / o l'immagine del campione utilizzando sia un microscopio stereo o composto.
  10. Conservare il piatto montare preparazione piatta con un portavetrini cartone al buio a 4 ° C per diverse settimane o temporaneamente a temperatura ambiente. Nota: La macchia WISH svanirà progressivamente nel tempo, le reazioni substrato particolarmente rosse, e non può essere conservato in glicerolo a tempo indeterminato. Macchie viola anche sbiadiscono più facilmente se conservato in glicerolo rispetto alPFA (vedi punto 8.11). È interessante notare che è stato pubblicato che gli embrioni di montaggio in Permount anziché glicerolo può consentire lo stoccaggio a tempo indeterminato a temperatura ambiente 15.
  11. Per la conservazione a lungo termine del substrato viola campioni colorati, rimuovere il vetrino di vetro e sciacquare l'embrione risciacquato due volte in 1x PBST, poi il trasferimento in una provetta con il 4% PFA/1x PBS per l'archiviazione a lungo termine. Nota: In alternativa, embrioni in 1x PBST possono essere trattati per ulteriori analisi, come l'isolamento del DNA per la genotipizzazione.

Representative Results

La procedura di montaggio piatta protocollo comporta la trasformazione di zebrafish dalla sua anatomia normale, in cui l'asse del corpo è avvolto intorno ad un pallone tuorlo in posizione centrale, in una bidimensionale preparazione (Figura 1A). Montare tutto l'imaging del giovane zebrafish è limitata dalla natura di come l'asse embrionale è avvolto intorno al tuorlo. Come risultato, viste laterali o dorsali intero monte esemplari embrionali colorata possono acquisire solo una parte dell'asse o tessuti particolari oscuri (Figura 1B). In confronto, deyolking e appiattimento dell'embrione consente all'intera asse embrionale da visualizzare contemporaneamente (Figura 1B). Queste limitazioni sono dimostrate esaminando un desiderio embrione macchiato che è stato etichettato con riboprobes antisenso per rilevare irx3b (viola), che segna un sottoinsieme dei progenitori renali adiacenti ai metameri 7 a 13, e myod1 (rosso), che etichetta ilsomiti (figura 1b). Il campo di irx3b + progenitori renali è oscurata in tutto il monte vista laterale perché trascrizioni irx3b sono abbondanti nel sistema nervoso centrale, rendendo il campo renale praticamente impossibile da visualizzare con l'angolazione laterale; Inoltre, il campo di irx3b + progenitori renali è solo parzialmente visibile quando l'embrione viene ruotato in una telecamera dorsale perché il campo è avvolto intorno al tuorlo (Figura 1B). Tuttavia, una vista dorsale dello stesso embrione seguente montaggio piatta consente l'intero campo di irx3b + progenitori renali da analizzare in modo semplice rispetto ai somiti lungo il tronco e altre strutture embrionali (Figura 1B). Così, elaborati domini spaziali possono essere idealmente documentati con questo metodo.

Diversi passaggi importanti sono coinvolti nella corretta esecuzione della procedura piatto monte. Per eseguire questa technique, la palla tuorlo deve essere prima staccato dall'embrione corretta (Figura 2A), che può essere fatto con strumenti pregiati come un paio di pinze sottili mentre l'embrione è visualizzato utilizzando uno stereomicroscopio. Dopo la rimozione greggio della palla tuorlo, uno strumento di ciglia multa viene utilizzato per raschiare via granuli di tuorlo che sono rimasti attaccato per l'embrione (Figura 2B). La rimozione dei rimanenti granuli tuorlo contribuisce a facilitare la visualizzazione dei tessuti embrionali. Infine, l'embrione deyolked è manipolato per posizionarlo stabilmente su un vetrino (Figura 2C), che permette l'osservazione e aiuti documentazione del campione utilizzando software di imaging e una telecamera collegata al microscopio. Gli strumenti di ciglia sono dispositivi fatti in casa che possono essere costruiti mediante apposizione di una frustata adatto per un puntale utilizzando colla, che possono essere montati su un manico se lo si desidera (Figura 3A, tavolo Materials). Diversi campioni ciglia possono essere prelevati per produrrelash strumenti con caratteristiche leggermente diverse in termini di lunghezza e cono (Figura 3B), che ogni utente può avere diverse predilezioni per una volta che iniziano a sperimentare la procedura di piano di montaggio. Esempi di campioni ciglia sono naturalmente capannone ciglia umani, naturalmente capannone capelli o baffi ispidi animali, e, infine, di varietà sintetiche di ciglia disponibili in commercio trovati nei reparti di vendita al dettaglio di cosmetici.

La zona circostante e contenente il campione (s) posizionato su un (Figura 4A) vetrino può essere ripreso per l'analisi ad alta risoluzione. Una combinazione di sonde sono stati usati per etichettare i progenitori renali in via di sviluppo che danno origine al rene nel tipo di embrione selvaggio nelle prime fasi di sviluppo con due colori WISH, e poi pianeggiante montare i preparativi sono stati effettuati per visualizzare i campioni (figura 4B, 4C ). Durante le fasi iniziali somite, progenitori renali sono delimitate in un modello a forma di U da Th.EIR espressione dei trascritti (viola) pax2a circondano il mesoderma parassiale che esprime in concomitanza delta C (DLC) (red) (colonna di sinistra, Figura 4B) 6,7. In confronto, quando trascritti DLC sono stati rilevati con un substrato viola, e sono stati etichettati in combinazione con il Krox20 marcatore hindbrain (rosso), un sottodominio rostrale dei progenitori renali è stata visualizzata che esprime DLC (colonna destra, Figura 4B), come osservato in precedenza 6,7. Montare preparati piatti possono essere utilizzati in modo simile a studiare somitogenesis fasi successive. Nella fase somite 14, abbiamo analizzato l'espressione di marcatori renali pax2a, slc4a4, e SLC12A3 (viola) con smyhc1 (rosso), che segna i somiti (Figura 4C). Queste combinazioni consentono la mappatura dell'intero dominio progenitore renale con pax2a, mentre rivela che un sottogruppo di cellule in un sottodominio expr rostraleessed slc4a4a e si distinguevano per una caudale sottodominio non sovrapposizione dei progenitori renali che hanno espresso SLC12A3.

WISH due colori e la preparazione montare piatto sono anche utili per lo studio dei domini cellulari durante l'organogenesi in zebrafish con mutazioni genetiche o altre perturbazioni della esposizione ambientale a piccole molecole 6,7 (Figura 5). NLS zebrafish e mutanti lib presentano mutazioni in aldeide deidrogenasi 1a2 (aldh1a2, precedentemente noto come raldh2), che codifica un enzima necessario per la biosintesi dell'acido retinoico (RA). RA è essenziale per il corretto sviluppo di molti tipi di cellule renali tra cui la formazione di cellule podociti che contribuiscono a rendere il filtro sangue del rene embrionale, noto come glomerulo 6,7. WISH è stato eseguito per etichettare i progenitori podociti con wt1a in concomitanza con la delimitazione delle tha lo sviluppo di somiti con smyhc1 e hindbrain con Krox20 in embrioni di tipo selvatico, NLS embrioni mutanti, embrioni lib mutanti, e gli embrioni trattati con un inibitore chimico ALDH, DEAB (Figura 5). Embrioni con l'espressione aldh1a2 carente mostrato espressione wt1a ridotto rispetto al tipo di embrioni selvatici, mentre gli embrioni DEAB-trattati hanno mostrato una abrogazione delle trascrizioni wt1a (Figura 5, colonna di destra). Presi insieme, questi risultati rappresentativi dimostrano come la tecnica del piatto supporto può essere utilizzato per analizzare e documentare le differenze anatomiche con precisione in embrione, e quindi essere implementato per studi di sviluppo importanti.

Figura 1
Figura 1. Panoramica del montaggio preparazione piattarazione per gli embrioni di zebrafish. A) La procedura di montaggio piatta permette la visione simultanea dei tessuti lungo l'asse embrionale perché la massa tuorlo centrale viene rimosso e l'embrione stabilmente posizionato su una superficie piana. B) Immagini di un intero monte WISH embrione tinto in viste laterali e dorsali, e poi, dopo una preparazione piatto di montaggio è stata condotta. L'embrione è stato colorato con sonde antisenso per rilevare trascritti del gene che codifica per irx3b (viola) e myod1 (rosso).

Figura 2
Figura 2. Schema della procedura di montaggio appartamento in embrioni di zebrafish. A) L'embrione viene prima grossolanamente deyolked per rimuovere la maggior parte della massa tuorlo, poi (B) la superficie ventrale è finemente deyolked per rimuovere i rimanenti granuli tuorlo, edopo aver lavato l'embrione è (C) montato lato dorsale su un vetrino per l'analisi visiva e / o dell'immagine fotografica.

Figura 3
Figura 3. Fotografie di esempio strumenti di ciglia rispetto a pinza sottile. A) strumenti sferza fatti in casa sono stati ripresi insieme a un paio di serie di una pinza sottile, posizionato accanto a un righello metrico per fornire un riferimento. B) Visualizzazione ingrandita della sferza strumenti accanto alle belle pinze, con il riferimento millimetrica prevista lungo la parte superiore della vista . Due diversi strumenti di ciglia vengono mostrati, con l'asterisco (*) utilizzato per contrassegnare la sferza ottenuto da un capannone naturalmente ciglio umano, e doppio asterisco (**) utilizzato per contrassegnare una frustata che è stato ottenuto da un capannone naturalmente felino baffo e tagliata per fare una fine un po 'ottuso. In ogni case, la sferza è stato infilato attraverso la punta della pipetta e apposto con vari strati di colla per creare progressivamente una forte tenuta per stabilizzare / ancorare la sferza alla pipetta collegato a un dispositivo di movimentazione.

Figura 4
Figura 4. Caratterizzazione dei cambiamenti evolutivi in campo progenitore renale nel wild type embrione di zebrafish. A) Far scorrere schematica che indica l'area ripreso per analisi in (B, C). B) tipo selvatico embrioni a 1, 3, e 5 somiti fase erano macchiati da due colori WISH per valutare la composizione del campo progenitore renale che dà salire al rene embrionale, o pronephros. (Colonna a sinistra) trascrizioni di codifica il fattore di trascrizione pax2a (tinto in viola) segnano diverse popolazioni nell'embrione, tra cui il p renalecampo rogenitor che emerge dal mesoderma intermedio. Trascrizioni di codifica Notch legante dlc segnano i somiti che si formano dal mesoderma parassiale (tinto in rosso). (Colonna di destra) Quando l'espressione di trascritti DLC (colorati in viola) e hindbrain rhombomere marcatore Krox20 (tinto in rosso) sono esaminati negli stessi embrioni, espressione dlc può essere osservato in un sottodominio rostrale dei progenitori renali adiacenti ai somites 1-5, che è stato oscurato durante la co-colorazione di DLC con pax2a. C) embrioni di tipo selvatico allo stadio 14 somite erano doppia o tripla tinto con una combinazione di un marcatore renale (viola), il marcatore smyhc1 somite (red) , e il hindbrain rhombomere marcatore Krox20 (anche rosso). (Pannello superiore) In questa fase, le trascrizioni pax2a continuano a delimitare i progenitori renali. (Middle, pannelli inferiori) Nel territorio progenitore renale, un sottodominio rostrale è contrassegnatada slc4a4 e trascritti che codificano SLC12A3 segnare un sottodominio caudale.

Figura 5
Figura 5. L'uso di preparati montati piatti a caratterizzare i fenotipi causati da mutazioni genetiche o perturbazioni genetiche chimici che modulano la biosintesi dell'acido retinoico. WISH Il modello di espressione allo stadio 15 somite di wt1a (viola) e smyhc1/krox20 (rosso) è stato confrontato tra i tipi selvatici e gli embrioni con anomalie in acido retinoico (RA) la produzione a causa di difetti di aldeide deidrogenasi 1a2 (NLS e mutazioni lib) o l'inibizione chimica di retinaldehyde deidrogenasi con dietilaminobenzaldehide (DEAB). La riduzione della produzione di RA in lib è leggermente più grave di nls, taleche gli embrioni lib esprimono leggermente ridotta colorazione delle trascrizioni wt1a di simile in scena nls embrioni mutanti, mentre il trattamento DEAB dei tipi selvatici è associata a completa abrogazione di espressione wt1a.

Discussion

Zebrafish hanno dimostrato di essere un organismo modello estremamente prezioso per tutta la comunità di ricerca negli ultimi anni. Zebrafish esporre un notevole grado di conservazione genetica con quella dei vertebrati superiori, ed i vantaggi relativi alla loro anatomia, l'allevamento, e il ciclo di vita rendono questa specie molto suscettibili di analisi sperimentali. Inoltre, il progresso delle tecniche molecolari applicabili alla zebrafish ha ulteriormente promosso l'uso di questo organismo modello nella ricerca scientifica. Ad esempio, una grande varietà di linee di zebrafish transgenici sono stati generati per studiare la progressione della malattia e di rispondere a molte domande fondamentali che sono alla base dei meccanismi fondamentali dello sviluppo, tra cui organogenesi.

Pertanto, basato sull'uso dinamica di zebrafish sia malattia e ricerca evolutiva, metodologie di etichettatura cella e segnale quantificazione sono un aspetto cruciale di analisi dati. Mentre i metodi che utilizzano un fluorescentetibodies possono essere utilizzati per rilevare l'espressione proteica in zebrafish transgenico, ricercatori tipicamente si basano su procedure standard come WISH 12-16 per esaminare la localizzazione spazio-temporale dei trascritti genici in un campione zebrafish non transgenico fisso. Infatti, WISH è una delle tecniche più utilizzate in biologia 16, ed è uno strumento fondamentale utilizzato per caratterizzare il fenotipo di mutazioni genetiche e perturbazioni genetiche chimici. Tuttavia, WISH è associato a un numero di potenziali insidie ​​e sfide. Per confermare la specificità del ribroprobe antisenso, riboprobes senso possono essere usate come controllo per valutare la specificità di antisenso riboprobe pattern di colorazione. Mentre le sezioni 4 e 5 sono presentati nell'ordine di etichettatura e il rilevamento di una sonda marcata con digossigenina seguita dalla sonda marcato con fluoresceina, questo ordine può essere invertito. In genere, i segnali più deboli (geni con livelli di espressione più bassi) sono meglio rilevate con le sonde digossigenina marcato e questa macchiasviluppato prima con un substrato viola, seguito da rilevamento e colorazione del segnale più forte (gene più abbondantemente espressa) utilizzando il substrato rosso. Tuttavia, se le reazioni a due colori stanno per essere eseguita, si raccomanda di varie combinazioni di etichette e substrati sono testati per trovare la procedura che è più adatto per la raccolta e l'analisi dei dati. Inoltre, i tempi previsti il ​​blocco, l'incubazione degli anticorpi e lavaggio fornite nelle sezioni 4-5 sono su misura per gli embrioni di età inferiore a 24 ore dopo la fecondazione; lunghi intervalli di questi stessi passi con embrioni anziani possono portare a un accumulo di sale sul campione. Suggerimenti per la risoluzione Ampie embrione WISH zebrafish norma sono già stati documentati in letteratura 12-16. Probabilmente il dilemma più comune è elevato background. Si consiglia di aumentare il numero di lavaggi MABT nel passaggio 4,7 a 15-20 lavaggi in caso di necessità, però, nella nostra esperienza l'aggiunta del pernottamento MABT 'super-wash'dà ottimi risultati se usato in combinazione con 10 o più brevi lavaggi MABT prima di procedere al passaggio 4.8. Un altro esempio dilemma è scarsa infiltrazione sonda, che può verificarsi con riboprobes lunghe. Tosatura la riboprobe seguente Passo 3.6 tramite idrolisi alcalina può neutralizzare questo. Nella nostra esperienza con i giovani campioni, la sonda taglio non è in genere necessaria. Tuttavia, si dovrebbe tenere a mente che parametri come questo può essere fattori che contribuiscono al risultato di un esperimento WISH, e noi suggerire l'esame di queste istruzioni per la risoluzione dei problemi utili già a disposizione del pubblico nella comunità come necessario per affinare i parametri sperimentali per volontà nel proprio di ricerca 12.

Oltre alle tecniche tradizionali WISH 12-16, vi è stato un continuo emergere di progressi nelle metodologie desiderio e protocolli alternativi che sono stati formulati. Questi includono nuovi modi di rilevazione del segnale, ad esempio attraverso l'uso di fluorescenza 17-19, a metodi che consentono la localizzazione dei microRNA 20. Anche così, nonostante i molti miglioramenti che sono stati fatti per i metodi di etichettatura cella corrente, l'efficacia di queste procedure sono negato se la macchia (s) non può essere facilmente visualizzato all'interno del campione di interesse in un punto desiderato. Questa limitazione è problematico per i ricercatori soprattutto quando si riferisce alle prime fasi embrionali di ontogenesi zebrafish, che potrebbe potenzialmente portare a lacune nella nostra comprensione dei vari processi di sviluppo che si presentano in questi periodi. Durante il normale sviluppo zebrafish, il sacco vitellino progressivamente diminuire di dimensioni come le età embrioni 11. Pertanto, in queste fasi di sviluppo successive (> 24 ore dopo la fecondazione), WISH colorazione è abbastanza semplice da analizzare perché l'embrione è più grande rispetto al suo adiacente sacco vitellino. Tuttavia, questo non è il caso dalla fase di gemma coda ai primi somitogenesis (quando l'embrionalemassa è posizionato intorno al tuorlo) dove il sacco vitellino opaco volte può oscurare la visualizzazione della macchia. Di conseguenza, il metodo di montaggio piatto è stato concepito per contribuire ad alleviare i problemi di imaging e di analisi dei dati associati alla caratterizzazione dei campioni iniziali zebrafish (schematizzate in Figura 1 e Figura 2), ed è stato ampiamente utilizzato in quanto la fenotipizzazione sistematica di mutazioni genetiche isolate dai primi larga scala schermi genetici 21.

Dal momento che l'avvento della tecnica di montaggio piatta, l'analisi dei primi stadi di sviluppo è stato notevolmente migliorato. Una volta che il tuorlo viene rimosso dall'embrione, è possibile appoggiare la embrione su un vetrino con l'orientamento desiderato per l'imaging. Questa posizione bidimensionale permette di visualizzare l'intero embrione in una volta, che elimina la necessità di ruotare il campione. Numerosi tessuti sono situati in ampi settori dell'embrione, comei precursori che formano il sangue e reni. Inoltre, uno può avere bisogno di confrontare i diversi tessuti in via di sviluppo diversi in una sola volta. Montaggio piatta consente al ricercatore di visualizzare contemporaneamente l'intero dominio di questi gruppi di cellule, e, quindi, può essere di grande aiuto quantificazioni come una misura zona per un tessuto o di cellule conteggi. Questa tecnica ha infine contribuito a portare a molte scoperte riguardanti una serie di importanti meccanismi di sviluppo alla base emopoiesi, neurogenesi e organogenesi. Così, una volta padroneggiato, le applicazioni di questa semplice tecnica per i ricercatori sono abbastanza sostanziali.

Ad esempio, in uno studio che analizza scelta lignaggio durante emopoiesi, pianeggiante montare le preparazioni di embrioni di zebrafish nelle fasi somite 14 e 18 (ss) sono stati utilizzati per illustrare i cambiamenti che si sono verificati nel modello di espressione del fattore di trascrizione PU.1 dito di zinco tra wild-type e GATA1 morpholino iniettato embrioni 22.Questo metodo ha permesso la rilevazione di un dominio PU.1 espanso a 18 ss, indicando che GATA1 è più probabile regolazione dell'espressione di PU.1 nella massa cellulare intermedia (ICM) intorno a questo punto di tempo. Embrioni montati forfettaria aggiuntiva colorate per i diversi geni eritroidi tra cui gtpbp1 e epsin dimostrato una perdita di espressione di questi geni in mutanti VLT che erano GATA1 - / -. Ulteriori analisi hanno mostrato alcun cambiamento nell'espressione dei geni erythoid come biklf e testhymin che erano noti per essere indipendente dall'attività gata. Pertanto, in combinazione con altri loro risultati sperimentali, è stato rivelato che GATA1 è essenziale nella regolazione del differenziamento delle cellule all'interno lineage mielo-eritroide. In uno studio di sviluppo della cresta neurale, monta piatti sono stati usati per esaminare l'espressione Crestin in mont blanc (mob M610) mutanti in uno studioesaminando i ruoli di mont blanc e la funzione del gene tfap2a 23. Alle 10 e 20 ss, espressione Crestin è stato interamente abrogato in testa ed era diminuita nella regione del tronco di mob mutanti M610 rispetto al normale espressione wild-type, in ultima analisi aiutare questo gruppo per concludere sull'importanza del Monte Bianco e tfap2a regolamento durante la formazione cresta neurale. Inoltre, in termini di organogenesi, supporti piane hanno permesso la scoperta della presenza di domini distinti nel campo progenitore renale fase iniziale dello sviluppo del rene embrionale zebrafish, noto come i pronephros. L'embrione zebrafish fornisce un sistema conservati e ancora anatomicamente semplice per studiare come progenitori renali provocano le unità funzionali nefrone che compongono i pronephros, un processo noto come nefrogenesi 6,7 (Figura 4). Appartamento analisi montare è stata utile per domini dei documenti di riprogenitori nali e per analizzare l'esito delle variazioni del segnalamento RA durante pronephros patterning 6,7 (Figura 5), che in precedenza era sconosciuto. Presi insieme, questi esempi suggeriscono che ci sono davvero molte applicazioni di massima per questo appartamento montare protocollo nello studio dei diversi processi che si verificano durante il normale sviluppo e gli stati malati.

Concettualmente, questa procedura piatto di montaggio è abbastanza semplice nel complesso. Tuttavia, le manipolazioni e il grado di finezza necessarie per padroneggiare questo metodo può essere molto impegnativo da padroneggiare, in assenza di dimostrazione visiva. Pertanto, questo protocollo è stato compilato per consentire ai ricercatori, soprattutto quelli nuovi al modello di zebrafish, con la possibilità di capire meglio come eseguire questa tecnica e condividere i nostri consigli sui reattivi in ​​grado di ottimizzare la gestione dei tessuti. Ci auguriamo che questo protocollo consentirà in ultima analisi altri nella comunità per perfezionare le condizioni del campione più ideale per essere used per il premio di imaging, analisi dei dati e la comunicazione dei loro risultati nelle pubblicazioni. In definitiva, questo dovrebbe consentire ai ricercatori di superare gli ostacoli anatomici del zebrafish durante l'embriogenesi iniziale, che può oscurare la presentazione dei risultati sperimentali, e risolvere questi attraverso l'uso di questa tecnica semplice ma significativo.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato in parte sostenuto da un finanziamento a RAW da ciascuno dei seguenti: sovvenzioni NIH K01 DK083512, DP2 OD008470 e R01 DK100237; March of Dimes Basil O'Connor Starter Scholar concessione di una sovvenzione # 5-FY12-75; avvio di fondi presso l'Università di Notre Dame College of Science e del Dipartimento di Scienze Biologiche. Vorremmo in particolare ringraziare Elizabeth e Michael Gallagher, insieme con tutta la famiglia Gallagher, che ha impartito un dono generoso alla University of Notre Dame di promuovere ricerca sulle cellule staminali. I finanziatori hanno avuto alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto. Ringraziamo il personale del Dipartimento di Scienze Biologiche per il loro supporto, e il Centro per la Ricerca Zebrafish a Notre Dame per la loro straordinaria dedizione nella cura e nel benessere della nostra colonia zebrafish. Infine, ringraziamo i membri del nostro laboratorio di ricerca per i loro commenti, discussioni e approfondimenti su questo lavoro, comecosì come Marigold (Maripooka) e Zinnia Wingert per fornire naturalmente capannone baffi felini per rendere più eccellenti strumenti sferza per la nostra ricerca.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 X E3 250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination.
1 X E3 Dilute 50 X E3 in distilled water.
Mesh tea strainer English Tea Store SKU #ASTR_KEN, MPN#1705
Embryo incubation dish Falcon 35-1005
Transfer pipette Samco 202, 204
Flat bottom microcentrifuge tube VWR 87003-300; 87003-298
Glass vial Wheaton 225012
1x PBST 0.1% Tween-20 detergent in 1x PBS, made by diluting 10x PBS in distilled water.
Tween-20 stock American Bioanalytical AB02038
10x PBS American Bioanalytical AB11072
Paraformaldehyde Electron Microscopy Services 19210
4% PFA/1X PBS Dissolve 4% PFA (w/v) in 1x PBS, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze aliquots for storage at -20 °C. Thaw just before use and do not refreeze stocks.
Filter sterilization unit Corning 430516 1 L filter system, 0.45 μm CA
MeOH Sigma 34860-4L
Proteinase K Roche 03-115-879-001 Dissolve in distilled water to make proteinase K stock (10 mg/ml) and store aliquots at -20 °C.
HYB+ 50% formamide, 5x SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/ml yeast torula RNA, 50 μg/μl heparin
DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents Roche 11175025910; 11685619910 Refer to manufacturer instructions.
SP6 RNA polymerase Roche 11487671001
T7 RNA polymerase Roche 10881775001
T3 RNA polymerase Roche 11031171001
RNase 1 inhibitor Roche 3335399001
DNase 1 inhibitor, 10x DNase 1 buffer Roche 4716728001
Glycogen Roche 10901393001
Ethanol (EtOH) Sigma E7023 Aliquot 50 ml aliquots of 100% EtOH and 70% EtOH (diluted with molecular grade water) and store at -20 °C.
Molecular grade distilled water Mediatech 25-055-CM
Waterbath Thermo 51221073 Model 2831
Nanodrop Thermo ND-2000c
Formamide American Bioanalytical AB00600 Store at -20 °C.
20x SSC American Bioanalytical AB13156
MAB 2 L formula: Into 1.5 L of distilled water, mix 23.2 g maleic acid, 17.5 g NaCl, 55.0 g Trisma base, then add 8 ml of 1M Tris-HCl pH 9.5, and then fill to 2 L. Autoclave.
MABT MAB + 0.1% (v/v) Tween-20
Block solution We make in 50 ml fresh aliquots: 10 ml of BSA (from 10% lab stock), 5 ml of FCS (from stock), and 35 ml of MABT. Save unused block at 4 °C to use for antibody solution. Note: Thaw the BSA and FCS stocks at 37 °C–if you thaw at a higher temperature they become a thick gel (do not use).
FCS (fetal calf serum) stock Invitrogen 16140089 Aliquot in 5 or 10 ml portions and store at -20 °C.
BSA (bovine serum albumin) stock American Bioanalytical AB00448 Make a 10% stock diluted in MAB by dissolving the BSA flakes at room temperature with rapid stirring, then store 10 ml aliquots at -20 °C. Store undissolved BSA flakes at 4 °C.
Anti-digoxigenin antibody Roche 11-093-274-910 Store at 4 °C.
Anti-fluorescein antibody Roche 11-426-338-910 Store at 4 °C.
12-well staining dish BD-Falcon 35-3225
Pre-staining buffer 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% (v/v) Tween-20. Always make fresh: it will precipitate in the course of a few days.
Staining solution-purple For every 10 ml needed: add 45 μl of NBT and 35 μl of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples).
Staining solution-red For every 10 ml needed: add 31.5 μl of INT and 35 μl of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples).
NBT stock Sigma N6876 Stored at -20 °C; powder diluted 50 mg/ml in 70% DMF, 30% water.
INT stock Sigma I8377 Stored at -20 °C; powder diluted 55 mg/ml in 70% DMF, 35% water.
BCIP stock Sigma B8503 Stored at -20 °C; powder diluted 50 mg/ml in 100% DMF.
DMF (dimethylformaldehyde) American Bioanalytical AB00450
Glycine Sigma G8898 0.1 M glycine, pH 2.2
Small plastic Petri dish Corning 430589, 430588
Glycerol Sigma G7893
Fine forceps Roboz RS-1050 Dumont Tweezers Pattern #55
Lash tool Constructed by affixing a suitable lash to a pipette tip (sizes ranging from P10-P1000 can be used) using superglue. We use a naturally shed human eyelash, a naturally shed animal whisker or wiry fur coat hair, or a natural or synthetic lash purchased from the beauty department at a pharmaceutical or retail store (extra long lashes are most amenable to stable mounting on the pipette tip). The pipette tip is affixed onto a straight rod (8-10 cm in length) such as a needle holder (e.g., Fisher 08-965-A) for easy handling. See Figure 3 for images of these homemade tools.
Glass slide Thermo-Fisher 4445 White Frost
Glass coverslip Thermo-Fisher 12-540A 18 x 18 mm
Modeling clay Hasbro Playdoh Other craft modeling clay products can be substituted.
Slide holder Thermo-Fisher 12-587-10 Cardboard tray to store slides flat.
Stereomicroscope Nikon SMZ645, SMZ1000
Compound microscope Nikon 80i, 90i

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References

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Preparazione di montaggio schermo per l&#39;osservazione e l&#39;analisi di zebrafish campioni macchiato da Whole Monte<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione
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Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N.,… More

Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization. J. Vis. Exp. (89), e51604, doi:10.3791/51604 (2014).

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