الجنين الزرد هو نموذج ممتاز للبحوث البيولوجيا التطورية. خلال مرحلة التطور الجنيني، الزرد تطوير مع كتلة البيض، الذي يعرض التحديات ثلاثي الأبعاد للمراقبة العينة والتحليل. يصف هذا البروتوكول كيفية إنشاء ثنائي الأبعاد جبل الاستعدادات شقة من جبل بأكمله في الموقع (WISH) ملطخة العينات الجنين الزرد.
يتم الآن استخدام الأجنة الزرد عادة للبحوث الطبية الحيوية والأساسية للتحقيق في التحكم الجيني للعمليات التنموية ونموذج التشوهات الخلقية. خلال اليوم الأول من الحياة، وتقدم الجنين الزرد من خلال العديد من المراحل التنموية بما في ذلك التخصيب، الانقسام، تكون المعيدة، وتجزئة، وتوالد من هياكل مثل الكلى والقلب والجهاز العصبي المركزي. تشريح الجنين الزرد الشباب يقدم العديد من التحديات لتصور وتحليل الأنسجة المشاركة في العديد من هذه الأحداث لأن الجنين يطور بالتعاون مع صفار الشامل الجولة. وهكذا، على التحليل الدقيق والتصوير من الظواهر التجريبية في عينات الجنينية ثابتة بين tailbud و 20 الجسيدة مرحلة (ما بعد 10 و 19 ساعة الإخصاب (HPF)، على التوالي)، مثل تلك الملون باستخدام جبل بأكمله في الموقع التهجين (WISH) في، غالبا ما يكون من المرغوب فيه لإزالة الجنين من صفار بوجميع لوضعه مسطح على شريحة زجاجية. ومع ذلك، وأداء الإجراء جبل المسطحة يمكن أن تكون مملة. لذلك، ناجحة وفعالة شقة جبل وإعداد سهلت إلى حد كبير من خلال مظاهرة البصرية للتقنية التشريح، وساعد أيضا باستخدام الكواشف التي تساعد في التعامل مع الأنسجة الأمثل. هنا، ونحن نقدم بروتوكول WISH لدينا للكشف عن لون واحد أو اثنين من الجينات في الأجنة الزرد، وتوضح كيف يمكن تنفيذ الإجراء تركيب مسطحة على هذا المثال من عينة ثابتة الملون. هذا البروتوكول تركيب مسطحة قابلة للتطبيق على نطاق واسع لدراسة العديد من الهياكل الجنينية التي تنشأ أثناء التطور الزرد في وقت مبكر، ويمكن تنفيذها بالتعاون مع وسائل تلطيخ أخرى أجريت على عينات الأجنة ثابتة.
الزرد، دانيو rerio، وأصبح الحي تستخدم على نطاق واسع في دراسة البيولوجيا التطورية. الزرد هي الاستوائية، وأنواع الفقاريات في المياه العذبة تعود لعائلة Cyprinidae. واستخدمت الزرد أصلا للبحوث البيئية للحصول على معلومات حول مخاطر ملوثات المياه المحتملة، كما كانت يمكن الحصول عليها بسهولة، وغير مكلفة، وسهلة للحفاظ على 1. على مدى السنوات الثلاثين الماضية، أصبح الزرد المعترف بها كنظام نموذج الفقاريات لين العريكة وراثيا لمجموعة من الأسباب. الزرد تظهر على مستوى عال من الحفظ التشريحية والفسيولوجية مع الفقاريات العليا بما في ذلك الثدييات 2،3. وقد كشفت مؤخرا الشرح تسلسل الجينوم أن ما يقرب من 70٪ من الجينات البشرية واحد على الأقل الزرد نظيره 4. على سبيل المثال، تم تحديد العديد من الجينات orthologous أن تلعب دورا هاما أثناء التطور الكلى بين هذه الأنواع 5-7. هذه غرفة المعيشةوقد مكن درجة ماتيتش الحفظ فيما يتعلق البيولوجيا الخلوية والجزيئية الباحثين لخلق نماذج لمجموعة واسعة من الأمراض التي تصيب الإنسان في الزرد 8، وأصبحت الزرد أداة قيمة لتحديد العلاجات المخدرات المحتملة باستخدام شاشات الجينية الكيميائية 9.
وعلاوة على ذلك، فإن النموذج الزرد ليست فقط قادرة على تلخيص مجموعة متنوعة من العمليات التنموية المعقدة والحالات المرضية والتي ينظر اليها في البشر، ولكن عدة سمات إضافية أيضا زيادة جاذبيتها باعتبارها كائن نموذج للدراسات الجنينية. الزرد هي بيوض وتتكاثر عن طريق وضع البيض البث، التي تنص على الباحثين مع سهولة الوصول إلى الأجنة من بداية الإخصاب 10. وتشمل المزايا الأخرى حجم الجنين، والشفافية، وتطوير الخارجية السريع 10. بالإضافة إلى ذلك، تمتلك البالغين الزرد الخصوبة العالية وعادة إنتاج أحجام مخلب كبير نسبيا التي يمكن أن تتراوح بين 200-500في الأسبوع، مما يتيح في نهاية المطاف الباحثين لإجراء تجارب إنتاجية عالية، مثل شاشات الكيميائية النمط الظاهري القائم، مع سهولة 9.
وحتى مع ذلك، على الرغم من عدد كبير من المزايا التي أظهرتها نموذج الزرد، وهناك التحديات التي تتعلق التحليل والإبلاغ عن النتائج التجريبية التي تم الحصول عليها من مراحل النمو المبكرة. في بعض الحالات، يمكن تشريح المتأصلة في الجنين الزرد تحجب التصور بيانات واحد. بعد الإخصاب، الخلية الأولي يخضع الأحداث الانقسام متعددة كما تقدم التنمية 11. تكون المعيدة التالية، يظهر محور الجنينية في مرحلة tailbud (10 HPF) بحيث يتم لفه حول صفار البيض 11. كما تقدم تطور لاحق خلال الفترة تجزئة، والجذع تنمو في الشامل وكذلك إطالة بواسطة استطالة المحوري بحيث ذيل جنبا إلى جنب مع جزء من الكيس المحي نفسها تمتد خارج من الكتلة صفار المركزية11. بين tailbud و 20 مرحلة الجسيدة (19 HPF)، يحاول أن نلاحظ الميزات التنموية محددة بعد الاستفادة من مختلف البروتوكولات تلطيخ، مثل WISH، يمكن أن يكون تحديا على حد سواء لتصور وصورة نظرا لهندسة الجنين وغموض الكيس المحي. طريقة واحدة للقضاء على هذه التحديات هو إزالة صفار ثم تتسطح الجنين في عينة ثنائية الأبعاد التي يمكن تحليلها بطريقة أكثر وضوحا.
توفير الموارد البروتوكول والفيديو التالية دليلا لكيفية deyolk بنجاح ومسطحة جبل الجنين بعد تثبيت وتلوين، وذلك باستخدام مثال واحد أو اثنين من لون WISH تلطيخ. WISH هو أسلوب يستخدم على نطاق واسع التي تمكن من الكشف عن الأحماض النووية محددة في العينات المحفوظة، وبالتالي يسمح لموقع (ق) في التعبير الجيني ليتم الكشف داخل الأنسجة. وقد وصفت على نطاق واسع تقنيات WISH، ويمكن أن يؤديها مع ركائز لون مختلف وكذلك الانفلونزاأنظمة الكشف عن orescent 12-20. ونحن هنا نقدم لبروتوكول WISH تعديل المستخدمة لأجنة الزرد بين tailbud وتجزئة مراحل التنمية. بروتوكولات WISH البديلة، ومع ذلك، متوافقة مع الإجراء جبل مسطح وصفها هنا، كما لوحظ في بداية البروتوكول أدناه. بالإضافة إلى ذلك، يمكن الاستفادة تركيب مسطحة جنبا إلى جنب مع أي عدد من تقنيات التصوير الحالية، مثل جبل بأكمله المناعية، أو التسميات تتبع نسب الخلايا، والتي لا توصف في هذا البروتوكول. وعموما، فإن تقنية تركيب مسطحة تمكن أفضل تحليل متفوقة وعرض البيانات التي تم الحصول عليها من التجارب مع المراحل الأولى من التطور الجنيني في الزرد.
وقد أثبتت الزرد لتكون النموذج الحي قيمة للغاية في جميع أنحاء الأوساط البحثية خلال السنوات الأخيرة. الزرد يحمل درجة كبيرة من الحفظ الوراثية مع أن من الفقاريات العليا، والمزايا المتعلقة التشريح، والتربية، ودورة حياتها جعل هذه الأنواع قابلة جدا للالتحليلات التجريبية. علاوة على ذلك، تقدم التقنيات الجزيئية المطبقة على الزرد أدت إلى زيادة تعزيز استخدام هذا النموذج الحي في البحث العلمي. على سبيل المثال، تم إنشاء مجموعة كبيرة ومتنوعة من خطوط الزرد المعدلة وراثيا لدراسة تطور المرض والإجابة على العديد من الأسئلة الأساسية التي تقوم عليها آليات رئيسية للتنمية بما في ذلك توالد الأعضاء.
وفقا لذلك، على أساس استخدام ديناميكية من الزرد في كل من المرض والبحوث التنموية ومنهجيات وضع العلامات والإشارات الخلية الكمي هي جانب هام من تحليل البيانات. بينما الأساليب التي توظف الفلورسنت وtibodies يمكن استخدامها للكشف عن البروتين التعبير في الزرد المعدلة وراثيا، يعتمد الباحثون عادة على الإجراءات القياسية مثل WISH 12-16 لدراسة توطين الزمانية المكانية من النصوص الجينات في عينة الزرد المعدلة وراثيا غير ثابتة. في الواقع، WISH هي واحدة من أكثر التقنيات المستخدمة على نطاق واسع في علم الأحياء 16، وأداة حيوية تستخدم لتوصيف النمط الظاهري من الطفرات الجينية والاضطرابات الوراثية الكيميائية. ومع ذلك، ويرتبط WISH مع عدد من المزالق والتحديات المحتملة. لتأكيد خصوصية ribroprobe العقاقير، بمعنى riboprobes يمكن استخدامها كوسيلة لمراقبة لتقييم خصوصية أنماط تلطيخ العقاقير riboprobe. في حين يتم عرض القسمين 4 و 5 في ترتيب وضع العلامات وكشف التحقيق المسمى digoxygenin تليها المسمى فلوريسئين التحقيق، يمكن عكس هذا الترتيب. عادة، وإشارات أضعف (الجينات مع انخفاض مستويات التعبير) والكشف عن أفضل مع تحقيقات المسمى digoxygenin وهذا وصمة عارأول من طور مع الركيزة الأرجواني، تليها الكشف وتلطيخ للإشارة أقوى (الجينات أعرب بزخم اكبر) باستخدام الركيزة الحمراء. ومع ذلك، إذا ردود الفعل اللونين ذاهبون إلى القيام بها، فمن المستحسن أن يتم اختبار توليفات مختلفة من التسميات وركائز للعثور على الإجراء الذي هو الأكثر ملاءمة لجمع البيانات وتحليلها. بالإضافة إلى ذلك، الأوقات المنصوص عليها حظر، حضانة الأجسام المضادة وغسل المقدمة في أقسام 4-5 مصممة للأجنة الذين تقل أعمارهم عن 24 التسميد آخر ساعة؛ فترات طويلة من هذه الخطوات نفسها مع أجنة كبار السن يمكن أن يؤدي إلى تراكم الملح على العينة. وقد تم بالفعل توثيق نصائح واسعة لاستكشاف القياسية الزرد الجنين WISH في الأدب 12-16. يمكن القول إن المعضلة الأكثر شيوعا هو خلفية عالية. نوصي زيادة عدد يغسل MABT في الخطوة 4.7 إلى 15-20 يغسل إذا لزم الأمر، على الرغم من تجربتنا في إضافة لMABT بين عشية وضحاها "فائقة غسل 'يعطي نتائج باهرة عندما تستخدم بالاقتران مع 10 أو أكثر يغسل MABT قصيرة قبل الانتقال إلى الخطوة 4.8. مثال آخر هو المعضلة الفقراء تسلل التحقيق، والتي يمكن أن تحدث مع riboprobes طويلة. يمكن قص riboprobe التالية الخطوة 3.6 من خلال التحلل القلوي تصدي لهذا. في تجربتنا مع عينات من الشباب، غير مطلوب عادة التحقيق القص. ومع ذلك، ينبغي للمرء أن نضع في اعتبارنا أن المعلمات مثل هذا يمكن العوامل المساهمة في نتائج تجربة WISH، ونقترح النظر في هذه التعليمات استكشاف الأخطاء وإصلاحها مفيدة بالفعل متاحة للجمهور في المجتمع حسب الحاجة لتحسين المعلمات التجريبية لWISH في بنفسك البحوث 12.
بالإضافة إلى التقنيات التقليدية WISH 12-16، كان هناك ظهور مستمر من التقدم في منهجيات WISH والبروتوكولات البديلة التي تم صياغتها. وتشمل هذه الطرق الجديدة للكشف عن إشارة، مثل من خلال استخدام الفلوريةcence 17-19، إلى الأساليب التي تمكن توطين microRNAs 20. وحتى مع ذلك، على الرغم من العديد من التحسينات التي أدخلت على طرق وضع العلامات الخلية الحالية، وتبطل فعالية هذه الإجراءات إذا كان وصمة عار (ق) لا يمكن تصور بسهولة داخل عينة من الفائدة في نقطة الوقت المطلوب. هذا القيد هو إشكالية للباحثين وخصوصا عندما تتعلق المراحل الجنينية المبكرة من تطور الجنين الزرد، والتي يمكن أن تؤدي إلى فجوات في فهمنا للعمليات التنموية المختلفة التي تنشأ في هذه الأوقات. أثناء تطوير الزرد العادية، وسوف الكيس المحي خفض تدريجي في حجم والجنين الأعمار 11. لذلك، في هذه المراحل التنموية في وقت لاحق (> آخر 24 ساعة الإخصاب)، WISH تلطيخ اضحة إلى حد ما لتحليل لأن الجنين أكبر مقارنة المجاورة لها الكيس المحي. ولكن هذا ليس هو الحال من مرحلة الذيل برعم إلى somitogenesis المبكر (عندما الجنينيةيتوضع الشامل حول صفار) حيث يمكن للالكيس المحي مبهمة أحيانا تحجب التصور من وصمة عار. بالتالي، لقد ابتكر طريقة تركيب مسطحة للمساعدة في تخفيف مشاكل التصوير وتحليل البيانات المرتبطة توصيف أوائل عينات الأجنة الزرد (schematized في الشكل 1 والشكل 2)، واستخدمت على نطاق واسع منذ phenotyping منهجية من الطفرات الوراثية معزولة من أول شاشات الوراثية على نطاق واسع 21.
منذ ظهور تقنية تركيب مسطحة، وتحليل مراحل النمو المبكرة قد تعززت بشكل كبير. مرة واحدة تتم إزالة صفار من الجنين، فمن الممكن لوضع الجنين شقة على شريحة زجاجية في الاتجاه المطلوب للتصوير. هذا الموقف ثنائي الأبعاد تمكن من مشاهدة الجنين بأكمله في وقت واحد، مما يلغي الحاجة لتدوير العينة. وتقع العديد من الأنسجة في مجالات واسعة من الجنين، مثلالسلائف التي تشكل الدم والكلى. علاوة على ذلك، قد يحتاج المرء للمقارنة بين العديد من أنسجة نامية مختلفة في وقت واحد. تركيب مسطحة تمكن الباحث لعرض في وقت واحد على المجال بالكامل من هذه الجماعات الخلية، وبالتالي يمكن أن تساعد إلى حد كبير quantifications مثل قياس مساحة للنسيج أو خلية من التهم الموجهة إليه. وقد ساعدت هذه التقنية في نهاية المطاف تؤدي إلى العديد من الاكتشافات المتعلقة مجموعة متنوعة من الآليات التنموية الهامة الكامنة تكون الدم، الخلايا العصبية، وتوالد الأعضاء. وبالتالي، بمجرد يتقن، وطلبات الحصول على هذه التقنية بسيطة للباحثين هي كبيرة جدا.
على سبيل المثال، في دراسة دراسة اختيار النسب أثناء تكون الدم، جبل الاستعدادات الأجنة الزرد شقة في المراحل الجسيدة 14 و 18 (اس اس) استخدمت لتوضيح التغييرات التي حدثت في نمط التعبير عن عامل النسخ إصبع الزنك بين PU.1 من النوع البري وgata1 morpholino حقن أجنة 22.تمكين هذه الطريقة في الكشف عن مجال PU.1 توسعت في 18 ق ق، مشيرا إلى أن gata1 هو الأكثر احتمالا تنظيم التعبير عن PU.1 في الكتلة الخلوية المتوسطة (ICM) حول هذه النقطة الوقت. أظهرت الأجنة شقة إضافية شنت الملون لمختلف الجينات محمر بما في ذلك gtpbp1 وepsin خسارة في التعبير عن هذه الجينات في المسوخ إل تي التي كانت gata1 – / -. وأظهرت التحليلات مزيد من أي تغيير في التعبير عن الجينات erythoid مثل biklf وtesthymin التي كانت معروفة لتكون مستقلة عن النشاط غاتا. لذلك، بالتزامن مع النتائج التجريبية الأخرى المترتبة عليها، تم الكشف عن أن gata1 أمر ضروري في تنظيم تمايز الخلايا ضمن النسب-myelo محمر. في دراسة للتنمية قمة العصبية، استخدمت يتصاعد شقة لدراسة crestin التعبير في مونت بلانك (الغوغاء M610) المسوخ في دراسةدراسة أدوار بلان مونت وظيفة الجين tfap2a 23. في 10 و 20 ق ق، ألغي crestin التعبير تماما في الرأس وانخفض في منطقة جذع الغوغاء المسوخ M610 بالمقارنة مع النوع البري العادي التعبير، والمساعدة في نهاية المطاف هذه المجموعة لإبرام حول أهمية مونت بلانك وtfap2a التنظيم خلال تشكيل قمة العصبية. بالإضافة إلى ذلك، من حيث توالد الأعضاء، مكنت يتصاعد شقة اكتشاف وجود مجالات متميزة في أوائل الحقل السلف الكلوي أثناء التطور الجنيني في الكلى الزرد، والمعروفة باسم سليفة الكلوة. يوفر الجنين الزرد نظام الحفظ واضحة حتى الآن تشريحيا لدراسة كيفية إعطاء الأسلاف الكلوي أدى إلى وحدات وظيفية نفرون التي تتألف منها سليفة الكلوة، وهي عملية تعرف باسم تكون الكلية 6،7 (الشكل 4). ظل ثابتا جبل التحليل المفيد المجالات ثيقة من وثائق إعادةالأسلاف ونال لتشريح نتائج التغييرات في إشارة RA خلال سليفة الكلوة الزخرفة 6،7 (الشكل 5)، والتي لم تكن معروفة سابقا. أخذت معا، هذه الأمثلة تشير إلى أن هناك بالفعل العديد من التطبيقات واسعة لهذا البروتوكول جبل شقة في دراسة العمليات المتنوعة التي تحدث أثناء التطور الطبيعي والدول المريضة.
من الناحية النظرية، هذا الإجراء جبل شقة بسيطة إلى حد ما عموما. ومع ذلك، يمكن التلاعب ودرجة الجودة المطلوبة لإتقان هذه الطريقة تكون صعبة للغاية لدرجة الماجستير في غياب مظاهرة البصرية. وبالتالي، تم تجميع هذا البروتوكول لتمكين الباحثين، وخاصة تلك الجديدة إلى نموذج الزرد، مع فرصة لفهم أفضل لكيفية تنفيذ هذه التقنية وتبادل نصيحتنا على الكواشف التي يمكن تحسين التعامل مع الأنسجة. نحن نأمل ان يكون هذا البروتوكول سيسمح في نهاية المطاف الآخرين في المجتمع لتحسين ظروف العينة الأكثر مثالية لتكون شااا للتصوير قسط، وتحليل البيانات، والاتصالات نتائجها في المنشورات. في نهاية المطاف، وهذا ينبغي تمكين الباحثين من أجل التغلب على العقبات التشريحية للالزرد خلال مرحلة التطور الجنيني المبكر، والتي يمكن أن تحجب عرض النتائج التجريبية، ولحل هذه من خلال استخدام هذه التقنية بسيطة ولكنها هامة.
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل جزئيا من خلال تمويل لRAW من كل مما يلي: منح المعاهد الوطنية للصحة K01 DK083512، DP2 OD008470، وR01 DK100237؛ مسيرة من مليم باسل أوكونور كاتب الباحث جائزة منحة # 5 FY12-75؛ بدء الأموال من جامعة نوتردام كلية العلوم وقسم العلوم البيولوجية. نود بصفة خاصة أن أشكر إليزابيث ومايكل غالاغر، جنبا إلى جنب مع كامل غالاغر الأسرة، الذين المنقولة هدية سخية للجامعة نوتردام لتعزيز أبحاث الخلايا الجذعية. كان الممولين أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتحليلها، قرار نشر أو إعداد المخطوطة. نشكر الموظفين من قسم العلوم البيولوجية لدعمهم، ومركز للبحوث اسماك الزرد في نوتردام لتفانيهم المتميز في رعاية ورفاه لدينا مستعمرة الزرد. أخيرا، نشكر أعضاء مختبر أبحاثنا على تعليقاتهم والمناقشات والافكار حول هذا العمل، وكذلك القطيفة (Maripooka) وزينيا ينغيرت لتوفير تسليط طبيعي شعيرات القطط لجعل أدوات السوط اكثر من ممتاز لأبحاثنا.
50 X E3 | 250 mM NaCl, 8.5 mM KCL, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination. | ||
1 X E3 | Dilute 50 X E3 in distilled water. | ||
mesh tea strainer | English Tea Store | SKU #ASTR_KEN, MPN#1705 | |
embryo incubation dish | Falcon | 35-1005 | |
transfer pipet | Samco | 202, 204 | |
flat-bottom microcentrifuge tube | VWR | 87003-300; 87003-298 | |
glass vial | Wheaton | 225012 | |
1 X Pbst | 0.1% Tween-20 detergent in 1 X Pbs, made by diluting 10 X Pbs in distilled water. | ||
Tween-20 stock | American Bioanalytical | AB02038 | |
10X Pbs | American Bioanalytical | AB11072 | |
paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 19210 | |
4% PFA/1X Pbs | Dissolve 4% PFA (w/v) in 1 X Pbs, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze aliquots for storage at -20 °C. Thaw just before use and do not refreeze stocks. | ||
filter sterilization unit | Corning | 430516 | 1L filter system, 0.45 um CA |
MeOH | Sigma | 34860-4L | |
proteinase K | Roche | 03-115-879-001 | Dissolve in distilled water to make proteinase K stock (10 mg/mL) and store aliquots at -20 °C. |
HYB+ | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/mL yeast torula RNA, 50 ug/ul heparin | ||
DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents | Roche | 11175025910; 11685619910 | Refer to manufacturer instructions. |
SP6 RNA polymerase | Roche | 11487671001 | |
T7 RNA polymerase | Roche | 10881775001 | |
T3 RNA polymerase | Roche | 11031171001 | |
RNase 1 inhibitor | Roche | 3335399001 | |
DNase 1 inhibitor, 10 X DNase 1buffer | Roche | 4716728001 | |
glycogen | Roche | 10901393001 | |
Ethanol (EtOH) | Sigma | E7023 | Aliquot 50 ml aliquots of 100% EtOH and 70% EtOH (diluted with molecular grade water) and store at -20 °C. |
molecular grade distilled water | Mediatech | 25-055-CM | |
waterbath | Thermo | 51221073 | Model 2831 |
nanodrop | Thermo | ND-2000c | |
formamide | American Bioanalytical | AB00600 | Store at -20 °C. |
20X SSC | American Bioanalytical | AB13156 | |
MAB | 2L formula: Into 1.5 L of distilled water, mix 23.2 g maleic acid, 17.5 g NaCl, 55.0 g Trisma base, then add 8 mLs of 1M Tris-HCl pH 9.5, and then fill to 2 L. Autoclave. | ||
MABT | MAB + 0.1% Tween-20 | ||
block solution | We make in 50 ml fresh aliquots: 10 mLs of BSA (from 10% lab stock), 5 mls of FCS (from stock), and 35 mLs of MABT. Save unused block at 4 °C to use for antibody solution. Note: Thaw the BSA and FCS stocks at 37 °C—if you thaw at a higher temperature they become a thick gel (do not use). | ||
FCS (fetal calf serum) stock | Invitrogen | 16140089 | Aliquot in 5 or 10 ml portions and store at -20 °C. |
BSA (bovine serum albumin) stock | American Bioanalytical | AB00448 | Make a 10% stock diluted in MAB by dissolving the BSA flakes at room temperature with rapid stirring, then store 10 ml aliquots at -20 °C. Store undissolved BSA flakes at 4 °C. |
anti-digoxigenin antibody | Roche | 11-093-274-910 | Store at 4 °C. |
anti-fluorescein antibody | Roche | 11-426-338-910 | Store at 4 °C. |
12-well staining dish | BD-Falcon | 35-3225 | |
pre-staining buffer | 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20. Always make fresh: it will precipitate in the course of a few days. | ||
staining solution-purple | For every 10mLs needed: add 45 uL of NBT and 35 uL of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples). | ||
staining solution-red | For every 10mLs needed: add 31.5 uL of INT and 35 uL of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples).. | ||
NBT stock | Sigma | N6876 | Stored at -20 °C; powder diluted 50mg/mL in 70% DMF, 30% water. |
INT stock | Sigma | I8377 | Stored at -20 °C; powder diluted 55mg/mL in 70% DMF, 35% water. |
BCIP stock | Sigma | B8503 | Stored at -20 °C; powder diluted 50mg/mL in 100% DMF. |
DMF (dimethylformaldehyde) | American Bioanalytical | AB00450 | |
glycine | Sigma | G8898 | 0.1 M glycine, pH 2.2 |
small plastic Petri dish | Corning | 430589, 430588 | |
glycerol | Sigma | G7893 | |
fine forceps | Roboz | RS-1050 | Dumont Tweezers Pattern #55 |
lash tool | Constructed by affixing a suitable lash to a pipet tip (sizes ranging from P10-P1000 can be used) using superglue. We use a naturally shed human eyelash, a naturally shed animal whisker or wiry fur coat hair, or a natural or synthetic lash purchased from the beauty department at a pharmaceutical or retail store (extra long lashes are most amenable to stable mounting on the pipet tip). The pipet tip is affixed onto a straight rod (8-10 cm in length) such as a needle holder (e.g. Fisher 08-965-A) for easy handling. See Figure 3 for images of these homemade tools. | ||
glass slide | Thermo-Fisher | 4445 | White Frost |
glass coverslip | Thermo-Fisher | 12-540A | 18 x 18 mm |
modeling clay | Hasbro | Playdoh | Other craft modeling clay products can be substituted |
slide holder | Thermo-Fisher | 12-587-10 | Cardboard tray to store slides flat |
stereomicroscope | Nikon | SMZ645, SMZ1000 | |
compound microscope | Nikon | 80i, 90i |