斑马鱼的胚胎是发育生物学研究的一个很好的模型。胚胎发育过程中,斑马鱼发展与蛋黄质量,其中介绍的样品观察和分析,三维的挑战。本协议描述了如何创建原位 (WISH)染色斑马鱼胚胎标本整装二维平板安装的准备工作。
斑马鱼的胚胎是现在常用的基本和生物医学研究探讨发育过程的遗传控制和模拟先天性畸形。在生命的第一天,斑马鱼胚胎过程通过许多发展阶段,包括受精,卵裂,原肠胚形成,细分和结构,如肾脏,心脏和中枢神经系统的器官。一个年轻的斑马鱼胚胎的解剖结构呈现为参与许多活动的组织的可视化和分析一些挑战,因为胚胎在协会的发展具有圆形的蛋黄质量。因此,对于精确分析和实验的表型在tailbud和20体节阶段(10和19小时后受精(HPF),分别),例如那些使用染色之间固定的胚胎标本成像整体原位杂交(WISH),它通常希望从蛋黄B拆下胚胎所有的以及将它平放在载玻片上。但是,执行一台安装过程可能很乏味。因此,成功的和高效率的扁平安装准备通过剥离技术的视觉演示极大的便利,也有助于通过使用试剂,帮助在最佳的组织处理。在这里,我们为我们的愿望协议,用于一个或两个色检测在斑马鱼胚胎的基因表达,并演示如何在平坦的安装程序可以在一个固定染色标本的这个例子来进行。这种扁平的安装协议是广泛适用于在斑马鱼早期发育所出现的许多胚胎结构的研究,可以与固定胚胎样品进行染色等方法结合来实现。
斑马鱼, 斑马鱼 ,已成为发育生物学的研究中广泛使用的生物。斑马鱼是属于鲤科鱼类热带,淡水脊椎动物。最初用于斑马鱼进行环境研究,以便对潜在的水污染物危害的信息,因为他们很容易获得,价格低廉,易于维护1。在过去的三十年里,斑马鱼已成为公认的主机的原因基因听话脊椎动物模型系统。斑马鱼表现与高等脊椎动物包括哺乳动物2,3高水平的解剖和生理保护。最近的基因组序列的注释显示,人类基因的大约70%的具有至少一个对应的斑马鱼4。例如,许多同源基因中发挥肾发育过程中的重要作用已经鉴定这些物种5-7之间。这DRAMATIC程度保护的问候细胞和分子生物学使研究人员能够在斑马鱼8创建模型,适用范围广的人类疾病,和斑马鱼已成为一个有价值的工具使用化学遗传筛选9,以确定潜在的药物治疗。
此外,斑马鱼模型不仅能够复述各种复杂的发育过程,而且是出现在人类疾病状态,但有几个附加的属性也提高它的吸引力作为模式生物的胚胎学研究。斑马鱼是卵生繁殖和利用广播产卵,这为研究者提供了从受精10的发作容易获得的胚胎。其它优点包括胚胎大小,透明度,以及快速,外部发展10。此外,斑马鱼的成年人具有高繁殖力和通常会产生比较大的离合器的尺寸是200-500之间的范围每个星期,最终使研究人员能够进行高通量的实验,如基于表型化工屏幕,轻松9。
即使如此,尽管优点由该斑马鱼模型表现出过多,有一些涉及到的分析和从早期发育阶段中得到的实验结果的沟通挑战。在一些情况下,斑马鱼胚胎的固有解剖可能模糊1的数据的可视化。受精后,最初的细胞经历多个切割事件随着开发的进展11。以下原肠胚形成,胚胎轴出现在tailbud阶段(10 HPF),使得它绕在蛋黄11。随后的发展过程通过分割期间,中继线将生长在质量和也由轴向伸长延长,使得沿着与蛋黄的一部分的尾囊本身从中央蛋黄质量延伸出11,在tailbud和20体节期(19 HPF)之间,尝试各种染色方法,如希望利用后,观察具体的发展特点,可以挑战既可视化和照片由于胚胎和不透明的几何形状卵黄囊。消除这些问题的方法之一是除去卵黄,然后压平胚胎成2维采样,可以在一个更简单的方式来分析。
下面的协议和视频资源提供如何成功地deyolk和平板装载胚胎以下固定和染色,使用一种或两种颜色WISH染色的例子的指南。愿望是一种广泛使用的技术,使之在保存标本特异性核酸的检测,从而允许对基因表达的被组织中检测到的网站()。 WISH技术已被广泛描述,并且可以与各种颜色的基板以及进行感orescent检测系统12-20。在这里,我们提供我们用于发展的tailbud和分割阶段之间的斑马鱼胚胎修改WISH协议。另类WISH的协议,但是,与这里所描述的平坦安装程序兼容,如下面的协议一开始就指出。另外,平的安装可以利用在与任何数量的现有的可视化技术,如整装免疫组织化学,或细胞谱系跟踪标签,其未在此描述的协议一起使用。总体而言,平面安装的技术可以更好地使从实验的斑马鱼胚胎发育的早期阶段获得的数据的卓越分析和介绍。
斑马鱼已被证明是近年来整个研究界一个极有价值的模式生物。斑马鱼表现出遗传保护相当程度与高等脊椎动物,以及有关他们的解剖结构,繁殖和生命周期优势使得这个物种非常适合进行实验分析。此外,适用于斑马鱼的分子生物学技术的进步,进一步推广使用在科学研究这一模式生物。例如,已经产生了大量的各种转基因斑马鱼线来研究疾病的进展,并回答背后发展的关键机制,包括器官的许多根本性的问题。
因此,根据在这两个疾病和发育的研究动态使用斑马鱼,细胞标记方法和信号量化为数据分析的重要方面。而采用荧光的方法tibodies可以用来检测蛋白表达的转基因斑马鱼中,研究人员通常依靠像WISH 12-16标准程序,以检查基因转录物在一个固定的,非转基因斑马鱼样品的时空定位。事实上,愿望是在生物学16使用最广泛的技术之一,是用来描述基因突变和化学基因扰动的表型的重要工具。然而,愿望是与一些潜在的隐患和挑战有关。为了证实该反义ribroprobe的特异性,义的核糖核酸探针可以被用作一个控制,以评估的反义核糖核酸探针染色模式的特异性。而第4和第5的标记和检测地高辛标记的探针其次是荧光素标记探针的顺序呈现,这个顺序可以颠倒。通常情况下,较弱的信号(与基因表达水平较低)最好与地高辛标记的探针和这个污点检测用紫色基底,随后检测与使用红色衬底更强的信号(更丰富地表达的基因)的染色开发的第一个。然而,如果两色反应将要进行的,因此建议标签和基片的各种组合进行测试,以发现最适合于数据采集和分析的过程。此外,所提供的时间封锁,在4-5节是专为胚胎年龄小于24小时受精后提供抗体孵育和洗涤;漫长的间隔与旧的胚胎这些相同的步骤可能会导致在样品盐分积累。用于故障排除的标准斑马鱼胚胎WISH广泛的技巧已经记载在文献12-16。可以说是最常见的困境是高背景。我们建议,如果需要增加MABT清洗的步骤4.7至15-20洗涤次数,不过,在我们的经验中除了隔夜MABT“超级洗”的给出了优异成绩进入步骤4.8前10名或以上短MABT清洗一起使用时。另一个例子困境差探头渗透,它可以发生与漫长的核糖核酸探针。剪切的riboprobe以下步骤3.6通过碱性水解可以抵消这一点。在我们年轻的样本经验,剪切探头通常不必需的。然而,人们应该记住,参数这样可以在WISH实验的结果是导致因素,我们建议检查已经在社会上公开提供根据需要细化自己的实验参数,希望对这些有用的故障排除说明研究12。
除了 传统的WISH技术12-16,出现了在WISH的方法和已制定的备用贷款协议的不断出现。这些包括信号检测的新方法,如通过使用荧光的cence 17-19,给方法,使小分子RNA 20的定位。即使如此,尽管已对当前小区标识的方法的许多改进,这些程序的有效性被否定,如果污渍(次)不能轻易感兴趣的样品中在期望的时间点显示。这种限制是有问题的研究者,特别是当它涉及到斑马鱼个体发育的早期胚胎阶段,这有可能导致差距在我们这出现在这些时间不同发育过程的理解。在正常的斑马鱼发育,卵黄囊将逐步在尺寸减小的胚胎年龄11。因此,在这些后来的发育阶段(> 24小时受精后),WISH染色是相当简单的分析,因为胚胎较大相比,其毗邻的卵黄囊。然而,这不是从尾芽期的情况下,以早期体节形成(当胚胎质量被定位围绕蛋黄),其中所述不透明卵黄囊有时可以掩盖染色的可视化。因此,平面安装的方法被设计来帮助减轻与早期的斑马鱼胚胎的样品(图式于图1和图2)的特征相关联的成像和数据分析的问题,并从此基因突变孤立的系统的表型被广泛地用于从第一次大规模遗传筛选21。
由于平面安装技术的出现,早期发育阶段的分析已经显著提高。一旦蛋黄是从胚胎取出,因此能够打好胚胎平面上的成像所需的方向载玻片。此二维位置能够观察整个胚胎的一次,这消除了需要旋转样本。许多组织都位于胚胎的广阔领域,如形成血液和肾脏的前体。此外,一个可能需要在同一时间,以比较几种不同的开发组织。平面安装使研究者能够同时查看这些细胞群的整个域,从而可以极大地帮助量化,如面积测量的组织或细胞计数。这种技术已最终帮助导致有关的各种相关造血,神经,器官和重要的发展机制的许多发现。因此,一旦掌握了,对于这个简单的技术研究人员的应用已相当可观。
例如,在一项研究造血过程中检查谱系选择,平板装载斑马鱼胚胎的制剂在14和18体节阶段(β)用于说明发生在之间的PU.1锌指转录因子的表达模式的变化野生型和GATA1啉注射的胚胎22。这种方法使一个扩大PU.1结构域的18 SS的检测,表明GATA1是最有可能调节PU.1的表达在中间细胞团(ICM)围绕该时间点。染色不同红细胞基因,包括gtpbp1和底物蛋白的其他平面安装的胚胎表明这些基因的表达的损失在VLT突变体,分别为GATA1 – / – 。进一步的分析显示,erythoid基因像biklf和被称为是独立的转录因子GATA活动testhymin的表情没有任何变化。因此,在与他们的其他实验结果的同时,它显露GATA1是在调节细胞的骨髓,红细胞系中的分化是必不可少的。神经嵴发育的研究中,平片被用来研究crestin表达的勃朗峰(MOB M610)在一项研究中突变体检查勃朗峰和tfap2a基因功能23的角色。在10和20的ss,crestin表达完全废除的头部和下降的暴徒M610突变体主干区域相比,正常野生型表达,最终帮助本组总结的关于勃朗峰的重要性和tfap2a调控在神经嵴形成。此外,在器官而言,平片已启用不同的结构域的存在,在早期肾脏祖字段中发现的斑马鱼胚胎肾脏的发育过程中,被称为鱼头。在斑马鱼胚胎提供一个保守的,但在解剖学直截了当的系统来研究肾祖细胞如何构成的鱼头肾单位功能单元产生,被称为nephrogenesis 6,7的处理( 图4)。平板安装分析相当有用的重域文件NAL祖细胞,并在鱼头图案6,7( 图5),这是前所未知的解剖变化RA信号的结果。总而言之,这些例子表明,确实有这平坦的安装协议的正常发育和疾病状态过程中发生的不同过程的研究很多广阔的应用前景。
从概念上讲,这款平板安装过程相当简单的整体。然而,技巧的掌握这种方法所需的操作和程度可能相当具有挑战性的掌握在没有视觉演示。因此,该协议被编译,使研究人员,特别是那些新来的斑马鱼模型,有机会更好地了解如何执行这项技术,并分享我们在这可以优化组织处理试剂的意见。我们希望这一协议最终将允许其他人在社会上完善最理想的样本条件为uSED对优质成像,数据分析,和他们在出版物结果沟通。最终,这应该使研究人员能够克服斑马鱼的解剖学障碍在早期胚胎发育,这可能掩盖了实验结果的介绍,并通过使用这个简单而显著技术解决这些。
The authors have nothing to disclose.
这项工作部分由下列各项资金,以支持RAW:美国国立卫生研究院资助K01 DK083512,DP2 OD008470,和R01 DK100237;三月优生优育基金会罗勒奥康纳入门学者补助金#5-FY12-75;从科学与生物科学系的圣母院书院大学启动资金。我们特别要感谢伊丽莎白和迈克尔·加拉格尔,连同整个加拉格尔家庭,谁给予的慷慨礼物圣母院大学培养干细胞研究。资助者在研究设计,数据收集和分析,发布的决定,或准备稿子没有任何作用。我们感谢生物科学部的工作人员的支持,和中心斑马鱼研究在巴黎圣母院为他们在我们的斑马鱼殖民地的照顾和福利的杰出贡献。最后,我们感谢我们的研究实验室的成员的意见,讨论和对这项工作的见解,如以及金盏花(Maripooka)和百日草温格特提供自然脱落的猫科动物胡须,使我们的研究最优秀的睫毛工具。
50 X E3 | 250 mM NaCl, 8.5 mM KCL, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination. | ||
1 X E3 | Dilute 50 X E3 in distilled water. | ||
mesh tea strainer | English Tea Store | SKU #ASTR_KEN, MPN#1705 | |
embryo incubation dish | Falcon | 35-1005 | |
transfer pipet | Samco | 202, 204 | |
flat-bottom microcentrifuge tube | VWR | 87003-300; 87003-298 | |
glass vial | Wheaton | 225012 | |
1 X Pbst | 0.1% Tween-20 detergent in 1 X Pbs, made by diluting 10 X Pbs in distilled water. | ||
Tween-20 stock | American Bioanalytical | AB02038 | |
10X Pbs | American Bioanalytical | AB11072 | |
paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 19210 | |
4% PFA/1X Pbs | Dissolve 4% PFA (w/v) in 1 X Pbs, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze aliquots for storage at -20 °C. Thaw just before use and do not refreeze stocks. | ||
filter sterilization unit | Corning | 430516 | 1L filter system, 0.45 um CA |
MeOH | Sigma | 34860-4L | |
proteinase K | Roche | 03-115-879-001 | Dissolve in distilled water to make proteinase K stock (10 mg/mL) and store aliquots at -20 °C. |
HYB+ | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/mL yeast torula RNA, 50 ug/ul heparin | ||
DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents | Roche | 11175025910; 11685619910 | Refer to manufacturer instructions. |
SP6 RNA polymerase | Roche | 11487671001 | |
T7 RNA polymerase | Roche | 10881775001 | |
T3 RNA polymerase | Roche | 11031171001 | |
RNase 1 inhibitor | Roche | 3335399001 | |
DNase 1 inhibitor, 10 X DNase 1buffer | Roche | 4716728001 | |
glycogen | Roche | 10901393001 | |
Ethanol (EtOH) | Sigma | E7023 | Aliquot 50 ml aliquots of 100% EtOH and 70% EtOH (diluted with molecular grade water) and store at -20 °C. |
molecular grade distilled water | Mediatech | 25-055-CM | |
waterbath | Thermo | 51221073 | Model 2831 |
nanodrop | Thermo | ND-2000c | |
formamide | American Bioanalytical | AB00600 | Store at -20 °C. |
20X SSC | American Bioanalytical | AB13156 | |
MAB | 2L formula: Into 1.5 L of distilled water, mix 23.2 g maleic acid, 17.5 g NaCl, 55.0 g Trisma base, then add 8 mLs of 1M Tris-HCl pH 9.5, and then fill to 2 L. Autoclave. | ||
MABT | MAB + 0.1% Tween-20 | ||
block solution | We make in 50 ml fresh aliquots: 10 mLs of BSA (from 10% lab stock), 5 mls of FCS (from stock), and 35 mLs of MABT. Save unused block at 4 °C to use for antibody solution. Note: Thaw the BSA and FCS stocks at 37 °C—if you thaw at a higher temperature they become a thick gel (do not use). | ||
FCS (fetal calf serum) stock | Invitrogen | 16140089 | Aliquot in 5 or 10 ml portions and store at -20 °C. |
BSA (bovine serum albumin) stock | American Bioanalytical | AB00448 | Make a 10% stock diluted in MAB by dissolving the BSA flakes at room temperature with rapid stirring, then store 10 ml aliquots at -20 °C. Store undissolved BSA flakes at 4 °C. |
anti-digoxigenin antibody | Roche | 11-093-274-910 | Store at 4 °C. |
anti-fluorescein antibody | Roche | 11-426-338-910 | Store at 4 °C. |
12-well staining dish | BD-Falcon | 35-3225 | |
pre-staining buffer | 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20. Always make fresh: it will precipitate in the course of a few days. | ||
staining solution-purple | For every 10mLs needed: add 45 uL of NBT and 35 uL of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples). | ||
staining solution-red | For every 10mLs needed: add 31.5 uL of INT and 35 uL of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples).. | ||
NBT stock | Sigma | N6876 | Stored at -20 °C; powder diluted 50mg/mL in 70% DMF, 30% water. |
INT stock | Sigma | I8377 | Stored at -20 °C; powder diluted 55mg/mL in 70% DMF, 35% water. |
BCIP stock | Sigma | B8503 | Stored at -20 °C; powder diluted 50mg/mL in 100% DMF. |
DMF (dimethylformaldehyde) | American Bioanalytical | AB00450 | |
glycine | Sigma | G8898 | 0.1 M glycine, pH 2.2 |
small plastic Petri dish | Corning | 430589, 430588 | |
glycerol | Sigma | G7893 | |
fine forceps | Roboz | RS-1050 | Dumont Tweezers Pattern #55 |
lash tool | Constructed by affixing a suitable lash to a pipet tip (sizes ranging from P10-P1000 can be used) using superglue. We use a naturally shed human eyelash, a naturally shed animal whisker or wiry fur coat hair, or a natural or synthetic lash purchased from the beauty department at a pharmaceutical or retail store (extra long lashes are most amenable to stable mounting on the pipet tip). The pipet tip is affixed onto a straight rod (8-10 cm in length) such as a needle holder (e.g. Fisher 08-965-A) for easy handling. See Figure 3 for images of these homemade tools. | ||
glass slide | Thermo-Fisher | 4445 | White Frost |
glass coverslip | Thermo-Fisher | 12-540A | 18 x 18 mm |
modeling clay | Hasbro | Playdoh | Other craft modeling clay products can be substituted |
slide holder | Thermo-Fisher | 12-587-10 | Cardboard tray to store slides flat |
stereomicroscope | Nikon | SMZ645, SMZ1000 | |
compound microscope | Nikon | 80i, 90i |