Zebrafisk embryo er en fremragende model for udviklingsmæssige biologi forskning. Under embryogenese, zebrafisk udvikler sig med en æggeblomme masse, som præsenterer tre-dimensionelle udfordringer for prøve observation og analyse. Denne protokol beskriver, hvordan man opretter todimensionale flade mount præparater af hele mount in situ (ønske) farvet zebrafisk embryo prøver.
Zebrafisk embryo er nu almindeligt anvendt til grundlæggende og biomedicinsk forskning for at undersøge den genetiske styring af udviklingsprocesser og at modellere medfødte misdannelser. Under den første dag i livet, zebrafisk embryo skrider frem gennem mange udviklingsstadier, herunder gødskning, spaltning, gastrulation, segmentering og organogenese af strukturer såsom nyrer, hjerte, og det centrale nervesystem. Anatomi af en ung zebrafisk foster præsenterer flere udfordringer for visualisering og analyse af de involverede i mange af disse begivenheder væv, fordi fosteret udvikler sig i forbindelse med en rund æggeblomme masse. Således til nøjagtig analyse og billeddannelse af eksperimentelle fænotyper i faste embryonale prøver mellem tailbud og 20 somite etape (10 og 19 timer efter befrugtning (HPF), henholdsvis), som dem farvet ved anvendelse af hele mount in situ-hybridisering (WISH), er det ofte er ønskeligt at fjerne det embryon blommen balle og for at placere den fladt på et objektglas. Dog kan udføre en flad mount procedure være trættende. Derfor er vellykket og effektiv flad mount forberedelse lettes i høj grad gennem den visuelle demonstration af dissektion teknik, og også hjulpet ved anvendelse af reagenser, der bistår i optimal væv håndtering. Her giver vi vores ønske protokol for en eller to-farvet påvisning af genekspression i zebrafisk embryo, og vise, hvordan den flade montering procedure kan udføres på dette eksempel på en farvede faste eksemplar. Denne flad montering protokol er bredt anvendelig til studiet af mange embryonale strukturer, der opstår i den tidlige zebrafisk udvikling, og kan gennemføres i samarbejde med andre farvningsmetoder udføres på embryo prøver fast.
Zebrafisk, Danio rerio, er blevet en udbredt organisme i studiet af udviklingsmæssige biologi. Zebrafisk er en tropisk, arter ferskvand hvirveldyr, der tilhører familien Cyprinidae. Zebrafisk blev oprindeligt brugt til miljøforskning for at få oplysninger om de farer af potentielle forurenende stoffer i vandet, som de var let opnåelige, billig og nem at vedligeholde 1. I de sidste tredive år har zebrafisk blevet anerkendt som en genetisk medgørlig hvirveldyr model system til et væld af årsager. Zebrafisk viser et højt niveau af anatomiske og fysiologiske bevaring med højere hvirveldyr, herunder pattedyr 2,3. Nylig genomsekvens annotation har vist, at cirka 70% af humane gener har mindst én zebrafisk modstykke 4. For eksempel har mange ortologe gener, som spiller en vigtig rolle under nyre udvikling blevet identificeret mellem disse arter 5-7. Denne dramatic bevaringsgrad med hensyn til cellulær og molekylær biologi har gjort det muligt for forskerne at skabe modeller for en bred vifte af menneskelige sygdomme i zebrafisk 8 og zebrafisk er blevet et værdifuldt redskab til at identificere potentielle lægemiddelbehandlinger bruge kemiske genetiske skærme 9.
Desuden er ikke kun i stand til at rekapitulere en bred vifte af komplekse udviklingsprocesser og sygdomstilstande, der ses hos mennesker, men flere andre attributter også øge sin appel som en model organisme til embryologiske studier zebrafisk model. Zebrafisk er oviparous og reproducere gennem broadcast gydning, som giver forskere med nem adgang til de embryoner fra starten af gødskning 10. Andre fordele omfatter embryo størrelse, gennemsigtighed og hurtig, ekstern udvikling 10. Derudover zebrafisk voksne besidder høj frugtbarhed og producerer typisk relativt store kobling størrelser, der kan variere mellem 200-500pr uge, i sidste ende gør det muligt for forskere at udføre højt throughput eksperimenter, såsom fænotype baseret kemiske skærme, med lethed 9.
Alligevel, på trods af de mange fordele, der er udstillet af zebrafisk model, der er udfordringer, der vedrører analyse og kommunikation af de eksperimentelle resultater fra tidlige udviklingsstadier. I nogle tilfælde kan den iboende anatomi zebrafisk embryo tilsløre visualisering af en data. Efter befrugtningen, den første celle undergår flere spaltningshændelser som udviklingen skrider 11. Efter gastrulation, dukker den embryonale akse i tailbud etape (10 HPF), således at det er viklet rundt om blommen 11. Som efterfølgende udvikling skrider frem gennem segmentering periode, vil stammen vokse i masse og også forlænge ved aksial forlængelse, således at en hale sammen med en del af blommesækken selv strækker sig ud fra den centrale æggeblomme masse11.. Mellem tailbud og 20 somite etape (19 HPF), der forsøger at observere specifikke udviklingsmæssige funktioner efter udnyttelsen af forskellige farvningsprotokoller, såsom ønsker, kan være en udfordring både at visualisere og fotografere på grund af geometrien af embryoet og uigennemsigtighed blommesækken. En måde at eliminere disse udfordringer er at fjerne blommen og derefter flade embryonet ind i en to-dimensionel prøve, der kan analyseres på en mere enkel måde.
Følgende protokol og video ressourcer giver en guide til, hvordan man med succes deyolk og flad montere et foster efter fiksering og farvning, i eksemplet med en eller to-farvet WISH farvning. Ønske er en udbredt teknik, der muliggør påvisning af specifikke nukleinsyrer i bevarede eksemplarer, og dermed giver mulighed for site (s) af genekspression at blive opdaget inden for væv. WISH-teknikker er blevet grundigt beskrevet, og kan udføres med forskellige farve-substrater samt influenzaorescent detektionssystemer 12-20. Her giver vi vores ændrede WISH protokol, der bruges til zebrafisk embryoner mellem tailbud og segmentering udviklingstrin. Alternative WISH protokoller, er imidlertid forenelige med den flade mount her beskrevne procedure, som nævnt i starten af protokollen nedenfor. Desuden kunne flad montering anvendes i forbindelse med ethvert antal eksisterende visualiseringsteknikker, såsom hele mount immunhistokemi eller celle afstamning sporingsetiketter, som ikke er beskrevet i denne protokol. Samlet set kan teknikken med flad montering bedre muliggøre overlegen analyse og præsentation af resultater fra forsøg med de tidligste stadier af fosterudviklingen i zebrafisk.
Zebrafisk har vist sig at være en særdeles værdifuld model organisme i hele forskningsverdenen i de senere år. Zebrafisk udviser en betydelig grad af genetisk bevarelse med den, højere hvirveldyr, og fordele vedrørende deres anatomi, avl, og livscyklus gør denne art meget modtagelig for eksperimentelle analyser. Desuden har fremme af molekylære teknikker, der gælder for zebrafisk fremmes yderligere anvendelse af denne model organisme i videnskabelig forskning. For eksempel har et stort udvalg af transgene zebrafisk linjer blevet genereret til at studere sygdomsudvikling og besvare mange fundamentale spørgsmål, der ligger til grund for de centrale mekanismer udvikling, herunder organogenesen.
Derfor baseres på den dynamiske brug af zebrafisk i både sygdommen og udviklingsstadiet forskning, cellemærkning metoder og signal kvantificering er et afgørende aspekt af dataanalyser. Mens metoder, som anvender lysstofrør entibodies kan anvendes til påvisning af protein-ekspression i transgen zebrafisk forskere typisk afhængige af standardprocedurer som WISH 12-16 at undersøge Spatiotemporal lokalisering af gentranskription i en fast, ikke-transgen zebrafisk prøve. I virkeligheden ønsker er en af de mest udbredte teknikker i biologi 16, og er et vigtigt redskab til at karakterisere fænotype af genetiske mutationer og kemiske genetiske forstyrrelser. Ikke desto mindre er ønske er forbundet med en række potentielle faldgruber og udfordringer. For at bekræfte specificiteten af antisense ribroprobe kan sense riboprober bruges som en kontrol for at vurdere specificitet antisense riboprobe farvningsmønstre. Mens § § 4 og 5 er vist i rækkefølge mærkning og detektion af en digoxygenin-mærket probe efterfulgt af fluorescein-mærket probe, kan denne ordre vendes. Typisk er svagere signaler (gener med lavere ekspressionsniveauer) bedst påvises med digoxygenin-mærkede prober og denne pletudvikles først med en lilla underlag, efterfulgt af påvisning og farvning af stærkere signal (mere rigeligt udtrykt gen) ved hjælp af den røde underlag. Hvis tofarvede reaktioner vil blive udført, anbefales det dog, at forskellige kombinationer af etiketter og substrater er testet for at finde den fremgangsmåde, der er mest velegnet til indsamling og analyse af data. Desuden er opgivet til at blokere, antistof-inkubation og vask forudsat i § § 4-5 er skræddersyet til embryoner yngre end 24 timer efter befrugtning; lange mellemrum i disse samme trin med ældre fostre kan føre til salt ophobning på prøven. Omfattende tips til fejlfinding standard zebrafisk embryo WISH er allerede blevet dokumenteret i litteraturen 12-16. Formentlig det mest almindeligt dilemma er høj baggrund. Vi anbefaler, at øge antallet af MABT vasker i trin 4.7 til 15-20 vasker hvis nødvendigt, selvom vores erfaring tilføjelsen af natten MABT 'super-vask'giver enestående resultater, når de anvendes i forbindelse med 10 eller flere korte MABT vasker, før du fortsætter til trin 4.8. Et andet eksempel dilemma er dårlig sonde infiltration, der kan forekomme med langvarige riboprober. Klipning riboproben følgende trin 3.6 via alkalisk hydrolyse kan modvirke dette. I vores erfaring med unge prøver er sonde klipning ikke typisk kræves. Man bør imidlertid huske på, at parametre som dette kan være medvirkende faktorer i resultatet af et ønske eksperiment, og vi foreslår en undersøgelse af disse nyttige fejlfinding vejledning allerede offentligt tilgængelige i samfundet efter behov for at forfine de eksperimentelle parametre for WISH i din egen forskning 12.
Ud over de traditionelle WISH teknikker 12-16, har der været en løbende fremkomsten af fremskridt i WISH metoder og alternative protokoller, der er blevet formuleret. Heriblandt nye måder signaldetektering, såsom gennem anvendelse af fluorescerendecens 17-19, metoder, der muliggør lokalisering af microRNA 20.. Alligevel, på trods af de mange forbedringer, der er foretaget i de nuværende celle mærkningsfremgangsmåder er effektiviteten af disse procedurer negeret hvis pletten (r) ikke let kan visualiseres i prøven af interesse på et ønsket tidspunkt. Denne begrænsning er problematisk for forskere, især når den vedrører de tidlige embryonale stadier af zebrafisk ontogeni, som potentielt kan føre til huller i vores forståelse af forskellige udviklingsprocesser, der opstår på disse tidspunkter. Under normal zebrafisk udvikling vil blommesækken aftager i størrelse som foster aldre 11. Derfor ved disse senere udviklingsstadier (> 24 timer efter befrugtning) WISH farvningen er forholdsvis ligetil at analysere fordi fosteret er større i forhold til dens tilstødende blommesækken. Men dette er ikke tilfældet fra halen knopstadiet til tidlig somitogenesis (når embryonalemasse er placeret rundt om blommen) når det uigennemsigtige blommesækken kan undertiden sløre visualisering af pletten. Derfor blev metoden til flad montering udtænkt til at hjælpe med at lindre de billedbehandling og dataanalyse problemer forbundet med karakteriseringen af tidlige zebrafisk embryo prøver (skematiseret i figur 1 og figur 2), og har stort set været brugt siden systematisk fænotypning af genetiske mutationer isolerede fra de første storstilede genetiske skærme 21.
Siden fremkomsten af den flade montering teknik har analysen af tidlige udviklingsstadier blevet væsentligt forbedret. Når blommen er fjernet fra embryonet, er det muligt at lægge embryo fladt på en glasplade i den ønskede orientering til billeddannelse. Denne to-dimensionelle position muliggør visning af hele embryo på én gang, hvilket eliminerer behovet for at rotere prøven. Talrige væv er placeret i brede områder af embryonet, såsomforstadier, der danner blod og nyrer. Endvidere kan man nødt til at sammenligne flere forskellige udviklingslande væv på én gang. Flad montering gør det muligt for forskeren at samtidig at se hele domænet af sådanne cellegrupper, og kan således i høj grad støtte kvantificeringer såsom et måleområde for et væv eller celletallet. Denne teknik har i sidste ende hjulpet føre til mange opdagelser om en række vigtige udviklingsmæssige mekanismer bag hematopoiese, neurogenese og organogenesis. Således når mestrer, ansøgningerne om denne enkle teknik til forskere er ganske betydelige.
For eksempel i en undersøgelse afstamning valg under hematopoiese, flad montere præparater af zebrafisk embryoner på 14 og 18 somite stadier (ss) blev brugt til at illustrere de ændringer, der skete i udtrykket mønster af pu.1 zink finger transskription faktor mellem vildtype og gata1 morpholino injicerede embryoner 22.Denne metode gjorde det muligt for påvisning af en udvidet pu.1 domæne ved 18 ss, hvilket indikerer, at gata1 er mest sandsynligt regulerer ekspressionen af pu.1 i det mellemliggende cellemasse (ICM) omkring dette tidspunkt. Supplerende fast monteret embryoner farvet for forskellige erythroide gener, herunder gtpbp1 og epsin viste et tab i ekspressionen af disse gener i VLT mutanter, der var gata1 – / -. Yderligere analyser viste ingen ændring i ekspressionen af erythoid gener som biklf og testhymin, der blev kendt for at være uafhængig af gata aktivitet. Derfor, i forbindelse med deres andre eksperimentelle resultater blev det afsløret, at gata1 er vigtigt i reguleringen af differentieringen af celler i myelo-erythroid afstamning. I en undersøgelse af neural crest udvikling blev flade mounts bruges til at undersøge Crestin udtryk i Mont Blanc-(MOB M610) mutanter i en undersøgelseundersøge roller Mont Blanc og tfap2a genfunktion 23. Ved 10 og 20 ss blev Crestin udtryk helt ophævet i hovedet og faldt i bagagerummet region mob M610 mutanter i forhold til den normale vildtype-udtryk, i sidste ende hjælpe denne gruppe til at konkludere, om vigtigheden af Mont Blanc og tfap2a regulering under neuralkam formation. Derudover er der i form af organogenese har flade mounts aktiveret opdagelsen af tilstedeværelsen af distinkte domæner i begyndelsen renal progenitor område i udviklingen af zebrafisk embryonale nyre, kendt som pronephros. Zebrafisk embryo giver et bevaret og alligevel anatomisk ligetil system til at studere, hvordan nyre stamfædre giver anledning til nephron funktionelle enheder, der omfatter pronephros, en proces kendt som nephrogenesis 6,7 (Figur 4). Flad mount analyse har været nyttigt at dokumentere domæner af renale stamfædre og at dissekere resultatet af ændringer i RA signalering under pronephros mønstring 6,7 (figur 5), som tidligere var ukendt. Tilsammen disse eksempler viser, at der er faktisk mange brede ansøgninger til denne flade montere protokol i studiet af forskellige processer, der opstår under normal udvikling og syge tilstande.
Begrebsmæssigt denne flade mount procedure er forholdsvis enkel samlet. Manipulationer og graden af finesse, der kræves for at mestre denne metode, kan dog være ganske udfordrende at mestre i fravær af visuel demonstration. Derfor er denne protokol blev udarbejdet for at gøre det muligt for forskere, især de nye til zebrafisk model med mulighed for bedre at forstå, hvordan du udfører denne teknik, og dele vores råd på reagenserne, der kan optimere væv håndtering. Vi håber, at denne protokol i sidste ende vil give andre i samfundet til at forfine de mest ideelle prøve betingelser for at være used for premium billedbehandling, dataanalyse og kommunikation af deres resultater i publikationer. I sidste ende bør dette gøre det muligt for forskerne at overvinde de anatomiske hindringer i zebrafisk under tidlig embryogenese, der kan skjule præsentationen af eksperimentelle resultater, og løse disse gennem brug af denne enkle, men betydelige teknik.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev delvist støttet af midler til RAW fra hver af følgende: NIH tilskud K01 DK083512, DP2 OD008470 og R01 DK100237; March of Dimes Basil O'Connor Starter Scholar tildeling af tilskud # 5-FY12-75; opstart midler fra University of Notre Dame College of Science og Biologisk Institut. Vi vil især gerne takke Elizabeth og Michael Gallagher, sammen med hele Gallagher Family, der bibringes en generøs gave til University of Notre Dame for at fremme stamcelleforskning. De finansieringskilderne havde nogen rolle i undersøgelsens design, dataindsamling og-analyse, beslutning om at offentliggøre, eller udarbejdelse af manuskriptet. Vi takker stabe af Biologisk Institut for deres støtte, og Center for zebrafisk Forskning på Notre Dame for deres enestående engagement i pleje og velfærd for vores zebrafisk koloni. Endelig vil vi takke medlemmerne af vores forskningslaboratorium for deres kommentarer, diskussioner og indsigter om dette arbejde, somsamt Marigold (Maripooka) og Zinnia Wingert for at give naturligt kaste feline whiskers til at gøre mest fremragende lash værktøjer til vores forskning.
50 X E3 | 250 mM NaCl, 8.5 mM KCL, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination. | ||
1 X E3 | Dilute 50 X E3 in distilled water. | ||
mesh tea strainer | English Tea Store | SKU #ASTR_KEN, MPN#1705 | |
embryo incubation dish | Falcon | 35-1005 | |
transfer pipet | Samco | 202, 204 | |
flat-bottom microcentrifuge tube | VWR | 87003-300; 87003-298 | |
glass vial | Wheaton | 225012 | |
1 X Pbst | 0.1% Tween-20 detergent in 1 X Pbs, made by diluting 10 X Pbs in distilled water. | ||
Tween-20 stock | American Bioanalytical | AB02038 | |
10X Pbs | American Bioanalytical | AB11072 | |
paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 19210 | |
4% PFA/1X Pbs | Dissolve 4% PFA (w/v) in 1 X Pbs, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze aliquots for storage at -20 °C. Thaw just before use and do not refreeze stocks. | ||
filter sterilization unit | Corning | 430516 | 1L filter system, 0.45 um CA |
MeOH | Sigma | 34860-4L | |
proteinase K | Roche | 03-115-879-001 | Dissolve in distilled water to make proteinase K stock (10 mg/mL) and store aliquots at -20 °C. |
HYB+ | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/mL yeast torula RNA, 50 ug/ul heparin | ||
DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents | Roche | 11175025910; 11685619910 | Refer to manufacturer instructions. |
SP6 RNA polymerase | Roche | 11487671001 | |
T7 RNA polymerase | Roche | 10881775001 | |
T3 RNA polymerase | Roche | 11031171001 | |
RNase 1 inhibitor | Roche | 3335399001 | |
DNase 1 inhibitor, 10 X DNase 1buffer | Roche | 4716728001 | |
glycogen | Roche | 10901393001 | |
Ethanol (EtOH) | Sigma | E7023 | Aliquot 50 ml aliquots of 100% EtOH and 70% EtOH (diluted with molecular grade water) and store at -20 °C. |
molecular grade distilled water | Mediatech | 25-055-CM | |
waterbath | Thermo | 51221073 | Model 2831 |
nanodrop | Thermo | ND-2000c | |
formamide | American Bioanalytical | AB00600 | Store at -20 °C. |
20X SSC | American Bioanalytical | AB13156 | |
MAB | 2L formula: Into 1.5 L of distilled water, mix 23.2 g maleic acid, 17.5 g NaCl, 55.0 g Trisma base, then add 8 mLs of 1M Tris-HCl pH 9.5, and then fill to 2 L. Autoclave. | ||
MABT | MAB + 0.1% Tween-20 | ||
block solution | We make in 50 ml fresh aliquots: 10 mLs of BSA (from 10% lab stock), 5 mls of FCS (from stock), and 35 mLs of MABT. Save unused block at 4 °C to use for antibody solution. Note: Thaw the BSA and FCS stocks at 37 °C—if you thaw at a higher temperature they become a thick gel (do not use). | ||
FCS (fetal calf serum) stock | Invitrogen | 16140089 | Aliquot in 5 or 10 ml portions and store at -20 °C. |
BSA (bovine serum albumin) stock | American Bioanalytical | AB00448 | Make a 10% stock diluted in MAB by dissolving the BSA flakes at room temperature with rapid stirring, then store 10 ml aliquots at -20 °C. Store undissolved BSA flakes at 4 °C. |
anti-digoxigenin antibody | Roche | 11-093-274-910 | Store at 4 °C. |
anti-fluorescein antibody | Roche | 11-426-338-910 | Store at 4 °C. |
12-well staining dish | BD-Falcon | 35-3225 | |
pre-staining buffer | 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20. Always make fresh: it will precipitate in the course of a few days. | ||
staining solution-purple | For every 10mLs needed: add 45 uL of NBT and 35 uL of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples). | ||
staining solution-red | For every 10mLs needed: add 31.5 uL of INT and 35 uL of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples).. | ||
NBT stock | Sigma | N6876 | Stored at -20 °C; powder diluted 50mg/mL in 70% DMF, 30% water. |
INT stock | Sigma | I8377 | Stored at -20 °C; powder diluted 55mg/mL in 70% DMF, 35% water. |
BCIP stock | Sigma | B8503 | Stored at -20 °C; powder diluted 50mg/mL in 100% DMF. |
DMF (dimethylformaldehyde) | American Bioanalytical | AB00450 | |
glycine | Sigma | G8898 | 0.1 M glycine, pH 2.2 |
small plastic Petri dish | Corning | 430589, 430588 | |
glycerol | Sigma | G7893 | |
fine forceps | Roboz | RS-1050 | Dumont Tweezers Pattern #55 |
lash tool | Constructed by affixing a suitable lash to a pipet tip (sizes ranging from P10-P1000 can be used) using superglue. We use a naturally shed human eyelash, a naturally shed animal whisker or wiry fur coat hair, or a natural or synthetic lash purchased from the beauty department at a pharmaceutical or retail store (extra long lashes are most amenable to stable mounting on the pipet tip). The pipet tip is affixed onto a straight rod (8-10 cm in length) such as a needle holder (e.g. Fisher 08-965-A) for easy handling. See Figure 3 for images of these homemade tools. | ||
glass slide | Thermo-Fisher | 4445 | White Frost |
glass coverslip | Thermo-Fisher | 12-540A | 18 x 18 mm |
modeling clay | Hasbro | Playdoh | Other craft modeling clay products can be substituted |
slide holder | Thermo-Fisher | 12-587-10 | Cardboard tray to store slides flat |
stereomicroscope | Nikon | SMZ645, SMZ1000 | |
compound microscope | Nikon | 80i, 90i |