Sebrafisk embryo er en utmerket modell for utviklingsbiologi forskning. Under embryogenesis, sebrafisk utvikle med en eggeplomme masse, som presenterer tredimensjonale utfordringer for prøve observasjon og analyse. Denne protokollen beskriver hvordan du oppretter todimensjonale flate montere preparater av hele fjellet in situ (skulle ønske) farget sebrafisk embryo prøver.
Sebrafisk embryo er nå ofte brukt for grunnforskning og biomedisinsk forskning for å undersøke den genetiske kontroll av utviklingsprosesser og for å modellere medfødte misdannelser. I løpet av første dag av livet, utvikler sebrafisk embryo gjennom mange utviklingsstadier, inkludert befruktning, cleavage, gastrulation, segmentering, og organogenesen av strukturer som nyre, hjerte og sentralnervesystemet. Anatomien til en ung sebrafisk embryo presenterer flere utfordringer for visualisering og analyse av vev som er involvert i mange av disse hendelsene, fordi fosteret utvikler seg i forbindelse med en runde plommemassen. Således, for nøyaktig analyse og avbildning av eksperimentelle fenotyper i anleggs embryoniske prøver mellom tailbud og 20. somitt trinn (10 og 19 timer etter befruktning (HPF), henholdsvis), slik som de som farget med hele montering in situ hybridisering (WISH), er det er det ofte ønskelig å fjerne embryoet fra eggeplomme balt og å plassere den flatt på et glass lysbilde. Imidlertid utføre en flat mount prosedyren kan være kjedelig. Derfor, vellykket og effektiv flat mount preparatet er mye lettere gjennom visuell demonstrasjon av disseksjon teknikk, og også bidratt ved å bruke reagenser som bistår i optimal vev håndtering. Her gir vi vår WISH protokoll for én eller to farger påvisning av genuttrykk i sebrafisk embryo, og demonstrere hvordan flat montering prosedyren kan utføres på dette eksempel på en farget faste prøven. Denne flat montering protokollen er bredt anvendelig til studiet av mange embryonale strukturer som dukker opp i løpet av tidlig sebrafisk utvikling, og kan gjennomføres i forbindelse med andre farvemetoder som utføres på faste embryo prøver.
Sebrafisk, Danio rerio, har blitt et utbredt organisme i studiet av utviklingsbiologi. Sebrafisk er en tropisk, ferskvanns virveldyr arter som tilhører familien cyprinidae. Sebrafisk ble opprinnelig brukt til miljøforskning for å få informasjon om farene ved potensielle vannforurensninger, som de var lett oppnåelig, billig og lett å vedlikeholde en. I løpet av de siste tretti årene har sebrafisk blitt anerkjent som en genetisk medgjørlig virveldyr modellsystem for en rekke grunner. Sebrafisk viser et høyt nivå av anatomiske og fysiologiske konservering med høyere virveldyr, inkludert pattedyr 2,3. Nyere genomsekvens merknad har avdekket at ca 70% av menneskets gener har minst en sebrafisk motstykke fire. For eksempel har mange ortologe gener som spiller en viktig rolle under nyre utviklingen blitt identifisert mellom disse artene 5-7. Dette dramatiskmatic grad av bevaring med hensyn til mobilnettet og molekylærbiologi har aktivert forskerne å lage modeller for et bredt spekter av menneskelige sykdommer i sebrafisk 8, og sebrafisk har blitt et verdifullt verktøy for å identifisere potensielle narkotika terapi ved hjelp av kjemiske genetiske skjermer ni.
Videre er sebrafisk-modellen ikke bare i stand til å rekapitulere en rekke komplekse utviklingsprosesser og sykdomstilstander som er sett hos mennesker, men flere andre attributter også høyne sin appell som modellorganisme for embryologiske studier. Sebrafisk er oviparous og reprodusere gjennom kringkasting gyting, noe som gir forskerne med lett tilgang til embryoene fra utbruddet av befruktning 10. Andre fordeler er embryo størrelse, gjennomsiktighet, og rask, ekstern utvikling 10. I tillegg, sebrafisk voksne besitter høy fruktbarhet og produserer vanligvis relativt store clutch størrelser som kan variere mellom 200-500per uke, til slutt slik at forskerne å utføre store gjennomgangs eksperimenter, som for eksempel fenotype basert kjemiske skjermer, med letthet ni.
Likevel, til tross for overfloden av fordelene som er utstilt ved sebrafisk-modellen, det er utfordringer som gjelder for analyse og kommunikasjon av de eksperimentelle resultatene fra tidlige utviklingsstadier. I noen tilfeller kan den iboende anatomi av sebrafisk embryo tilsløre visualisering av ens data. Etter befruktning, den første cellen gjennomgår flere cleavage hendelser som utviklingen skrider 11. Etter gastrulation, framgår det embryonale aksen på tailbud scenen (10 HPF) slik at det er pakket rundt plommen 11. Som senere utvikling går fremover gjennom segmentering perioden, vil stammen vokse i massen og også forlenges ved aksial forlengelse, slik at et hale sammen med en del av plommesekken i seg selv strekker seg ut fra den sentrale plommemasse11.. Mellom tailbud og 20. somitt trinn (19 HPF), forsøk på å observere spesifikke utviklings egenskaper etter at utnyttelsen av forskjellige fargings protokoller, for eksempel ønsker det kan være utfordrende både for å visualisere og fotografiet på grunn av geometrien av embryoet og opasiteten plommesekken. En måte til å eliminere disse utfordringene er å fjerne plomme og deretter flate embryoet i en to-dimensjonal prøve som kan analyseres på en mer direkte måte.
Følgende protokoller og video ressurser gi en guide for hvordan du lykkes deyolk og flat montere et embryo etter fiksering og farging, med eksempel på en eller to farger WISH farging. WISH er en mye brukt teknikk som muliggjør påvisning av spesifikke nukleinsyrer i konserverte prøver, og dermed gjør det mulig for området (e) av genekspresjon som skal påvises i vev. WISH-teknikker har blitt omfattende beskrevet, og kan utføres med forskjellige farge substrater samt influensaorescent deteksjonssystemer 12-20. Her gir vi vår modifiserte WISH protokollen som brukes for sebrafisk embryo mellom tailbud og segmenterings stadier av utviklingen. Alternativt WISH-protokoller, men er forenlig med den flate monteringsprosedyren er beskrevet her, som nevnt i begynnelsen av protokollen nedenfor. I tillegg kunne flat montering utnyttes i forbindelse med hvilket som helst antall av eksisterende visualiseringsteknikker, som for eksempel hele fjellet immunhistokjemi, eller celle lineage sporing av etiketter, som ikke er beskrevet i denne protokollen. Generelt kan teknikken for flat montering bedre at overlegen analyse og presentasjon av data innhentet fra eksperimenter med de tidligste stadier av fosterutvikling hos sebrafisk.
Sebrafisk har vist seg å være en svært verdifull modellorganisme i forskningsmiljø i løpet av de siste årene. Sebrafisk oppviser en vesentlig grad av genetisk konservering med den av høyere virveldyr, og fordeler knyttet til deres anatomi, avl, og livssyklus foreta denne arten meget mottagelig for eksperimentelle analyser. Videre har fremme av molekylære teknikker som gjelder for sebrafisk videre fremmet bruken av denne modellorganisme i vitenskapelig forskning. For eksempel har et stort utvalg av transgene sebrafisk linjer blitt generert for å studere sykdomsutvikling og for å svare på mange grunnleggende spørsmål som ligger bak de viktigste mekanismene for utvikling inkludert organogenesen.
Følgelig, basert på den dynamiske bruk av sebrafisk både sykdom og utviklingsforskning, cellemerking metoder og mengdesignalet er en viktig del av data-analyser. Mens metoder som ansetter fluorescerende entibodies kan brukes for å påvise protein ekspresjon i transgene sebrafisk, forskere typisk avhengige av standard prosedyrer som WISH 12-16 for å undersøke den tid og rom lokalisering av gentranskriptene i en fast, ikke-transgene sebrafisk prøven. Faktisk er WISH en av de mest brukte metoder innen biologi 16, og er et viktig verktøy som brukes til å karakterisere fenotypen av genetiske mutasjoner og kjemiske genetiske forstyrrelser. Likevel er WISH forbundet med en rekke potensielle fallgruver og utfordringer. For å bekrefte spesifisiteten til antisense ribroprobe kan sense riboprobes bli brukt som en kontroll for å vurdere spesifisiteten av antisense riboprobe fargingsmønstre. Mens delene 4 og 5 er presentert i størrelsesorden merking og deteksjon av en digoxygenin-merkede probe, etterfulgt av fluorescein-merket probe, kan denne rekkefølgen reverseres. Vanligvis blir svakere signaler (gener med lavere uttrykk nivåer) oppdages best med digoxygenin-merket prober og denne flekkenutviklet først med en fiolett substrat, etterfulgt av deteksjon og farging av sterkere signal (mer rikelig uttrykt gen) ved hjelp av røde substratet. Imidlertid, hvis to-farge-reaksjoner skal utføres, er det anbefalt at forskjellige kombinasjoner av etiketter og substrater blir testet for å finne en fremgangsmåte som er mest egnet for datainnsamling og analyse. I tillegg, de gangene gitt for å blokkere, antistoff inkubasjon og vasking følger av § § 4-5 er skreddersydd for embryoer yngre enn 24 timers innlegg befruktning; lange intervaller på de samme trinnene med voksne embryo kan føre til salt akkumulering på prøven. Omfattende tips for feilsøking standard sebrafisk embryo WISH har allerede blitt dokumentert i litteraturen 12-16. Uten tvil den mest vanlige dilemma er høy bakgrunn. Vi anbefaler å øke antall MABT vasker i Step 4,7 til 15-20 vasker hvis det er nødvendig, selv om det i vår erfaring tillegg av natten MABT 'super-wash'gir fremragende resultater når det brukes sammen med 10 eller flere korte MABT vasker før du fortsetter til trinn 4.8. Et annet eksempel dilemma er dårlig sonde infiltrasjon, noe som kan forekomme med lange riboprobes. Shearing den riboprobe følgende trinn 3.6 gjennom alkalisk hydrolyse kan motvirke dette. I vår erfaring med små prøver, er sonde klipping vanligvis ikke nødvendig. Imidlertid bør man huske på at parametere som dette kan være medvirkende faktorer i utfallet av en WISH eksperiment, og vi foreslår undersøkelse av disse nyttige feilsøkingsinstruksjonene allerede er offentlig tilgjengelige i samfunnet som nødvendig for å avgrense de eksperimentelle parametre for WISH i din egen forskning 12.
I tillegg til tradisjonelle WISH teknikker 12-16, har det vært en kontinuerlig veksten av fremskritt i WISH metoder og alternative protokoller som er formulert. Disse omfatter nye måter for signaldeteksjon, for eksempel ved bruk av elektronisk fCence 17-19, til metoder som gjør det mulig lokalisering av microRNAs 20. Likevel, til tross for de mange forbedringer som er gjort til gjeldende celle merking metoder, er effektiviteten av disse prosedyrene opphevet hvis flekken (e) ikke kan være lett visualiseres i utvalget av interesse på et ønsket tidspunkt. Denne begrensningen er problematisk for forskere, spesielt når det gjelder de tidlige embryonale stadier av sebrafisk ontogeni, noe som potensielt kan føre til hull i vår forståelse av ulike utviklingsprosesser som oppstår på disse tider. Under normal sebrafisk utvikling, vil plommesekken gradvis avta i størrelse som de embryo alderen 11. Derfor, på disse senere utviklingsstadier (> 24 timer etter befruktning), er WISH flekker ganske grei å analysere fordi fosteret er større i forhold til dens tilstøtende plommesekken. Dette er imidlertid ikke tilfelle fra halen knopp scenen til tidlig somitogenesen (når den embryonalemassen er plassert rundt eggeplomme), hvor det opake plommesekken kan noen ganger tilsløre visualisering av flekken. Følgelig ble fremgangsmåten i flat montering utviklet for å lindre de bilde-og dataanalyse problemer forbundet med karakterisering av sebrafisk tidlige embryo prøver (skjematiserte i figur 1 og figur 2), og har vært mye brukt, siden den systema phenotyping av genetiske mutasjoner isolerte fra de første storskala genetiske skjermer 21.
Siden advent av flat montering teknikk, har analysen av tidlige utviklingsstadier blitt betydelig forbedret. Når eggeplomme fjernet fra embryo, er det mulig å legge embryoet flatt på en glass-slide i den ønskede orientering for avbildning. Denne to-dimensjonal posisjon muliggjør visning av hele embryo på en gang, noe som eliminerer behovet for å rotere prøven. Tallrike vev befinner seg i vide områder av embryoet, som f.eksforløpere som danner blod og nyre. Videre kan man trenger for å sammenligne flere forskjellige utviklings vev på én gang. Flat montering gjør det mulig for forskeren å samtidig se hele domenet av slike cellegrupper, og dermed i stor grad kan hjelpe quantifications eksempel retningsmåling for et vev eller celletall. Denne teknikken har til slutt hjulpet føre til mange oppdagelser vedrørende en rekke viktige utviklings mekanismene bak hematopoiesen, neurogenesis, og organogenesen. Dermed, når mestret, programmer for denne enkle teknikken for forskerne er ganske betydelig.
For eksempel, i en studie undersøke avstamning valg under hematopoiesis, flat montere preparater av sebrafisk embryo på 14 og 18 somitt stadier (SS) ble brukt til å illustrere de endringene som skjedde i uttrykket mønster av pu.1 sink finger transkripsjonsfaktor mellom villtype og gata1 morpholino injisert embryoer 22.Denne metode muliggjorde påvisning av et ekspandert pu.1 domene ved 18 ss, noe som indikerer at gata1 er sannsynligvis å regulere ekspresjonen av pu.1 i den mellomliggende celle-masse (ICM) rundt dette tidspunkt. Ekstra flat montert embryoer farget for ulike erythroide gener inkludert gtpbp1 og epsin demonstrert et tap i uttrykket av disse genene i VLT mutanter som var gata1 – / -. Videre analyser viste ingen endring i uttrykket av erythoid gener som biklf og testhymin som var kjent for å være uavhengig av gata aktivitet. Derfor, i forbindelse med sitt andre eksperimentelle resultater, ble det avslørt at gata1 er viktig i regulering av differensiering av celler i myelo-erythroid avstamning. I en studie av neural crest utvikling, ble flate mounts brukes til å undersøke crestin uttrykk i mont blanc (mob M610) mutanter i en studieundersøke rollene til Mont Blanc og tfap2a gen-funksjon 23. På 10 og 20 ss, ble crestin uttrykk helt avskaffet i hodet og ble redusert i bagasjerommet regionen mob M610 mutanter i forhold til den normale vill-type uttrykk, slutt å hjelpe denne gruppen til å konkludere om betydningen av Mont Blanc og tfap2a regulering under neural crest formasjon. I tillegg, i form av organogenesen, har flate mounts aktivert oppdagelsen av tilstedeværelsen av forskjellige domener i tidlig nyre stamfar feltet under utviklingen av sebrafisk embryonale nyre, kjent som pronephros. Sebrafisk embryo gir en konservert og likevel anatomisk grei system for å studere hvordan nyrestamfedre gi opphav til nevronet funksjonelle enheter som utgjør de pronephros, en prosess som kalles nephrogenesis 6,7 (figur 4). Flat montere analysen har vært nyttig for dokument domener av renale stamceller og å dissekere utfallet av endringer i RA signale under pronephros mønstring 6,7 (figur 5), som tidligere var ukjent. Samlet utgjør disse eksemplene tyder på at det er faktisk mange brede programmer for denne flate montere protokollen i studiet av ulike prosesser som oppstår under normal utvikling og syke tilstander.
Konseptuelt er denne flate mount prosedyren ganske enkel samlet. Imidlertid kan de manipulasjoner og grad av finesse som kreves for å mestre denne metoden være ganske utfordrende å mestre i fravær av visuell demonstrasjon. Derfor ble denne protokollen utarbeidet for å muliggjøre forskere, spesielt de som er nye til sebrafisk-modellen, med mulighet til å bedre forstå hvordan du utfører denne teknikken og dele våre råd på reagenser som kan optimalisere vev håndtering. Vi håper at denne protokollen til slutt vil tillate andre i samfunnet til å avgrense de mest ideelle prøve forhold til å være used for premium bildebehandling, dataanalyse, og formidling av sine resultater i publikasjoner. Ideelt sett skal dette at forskere til å overvinne de anatomiske hindringer i zebrafisk embryogenese under tidlig, noe som kan formørke fremstilling av eksperimentelle resultater, og løse disse ved hjelp av denne enkle, men signifikant teknikk.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble delvis støttet av midler til RAW fra hver av følgende: NIH tilskudd K01 DK083512, DP2 OD008470, og R01 DK100237; March of Dimes Basil O'Connor Starter Scholar tilskudd prisen # 5-FY12-75; starte opp midler fra University of Notre Dame College of Science and Department of Biological Sciences. Vi ønsker spesielt å takke Elizabeth og Michael Gallagher, sammen med hele Gallagher Family, som formidles en sjenerøs gave til Universitetet i Notre Dame for å fremme stamcelleforskning. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Vi takker staber av Department of Biological Sciences for deres støtte, og Center for sebrafisk Forskning ved Notre Dame for sin enestående engasjement i omsorg og velferd for våre sebrafisk koloni. Til slutt, vi takker medlemmene av vår forskningslaboratorium for sine kommentarer, diskusjoner og innsikt om dette arbeidet, somvel som Marigold (Maripooka) og Zinnia Wingert for å gi naturlig kaste feline værhår for å gjøre mest fremragende snert verktøy for vår forskning.
50 X E3 | 250 mM NaCl, 8.5 mM KCL, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination. | ||
1 X E3 | Dilute 50 X E3 in distilled water. | ||
mesh tea strainer | English Tea Store | SKU #ASTR_KEN, MPN#1705 | |
embryo incubation dish | Falcon | 35-1005 | |
transfer pipet | Samco | 202, 204 | |
flat-bottom microcentrifuge tube | VWR | 87003-300; 87003-298 | |
glass vial | Wheaton | 225012 | |
1 X Pbst | 0.1% Tween-20 detergent in 1 X Pbs, made by diluting 10 X Pbs in distilled water. | ||
Tween-20 stock | American Bioanalytical | AB02038 | |
10X Pbs | American Bioanalytical | AB11072 | |
paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 19210 | |
4% PFA/1X Pbs | Dissolve 4% PFA (w/v) in 1 X Pbs, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze aliquots for storage at -20 °C. Thaw just before use and do not refreeze stocks. | ||
filter sterilization unit | Corning | 430516 | 1L filter system, 0.45 um CA |
MeOH | Sigma | 34860-4L | |
proteinase K | Roche | 03-115-879-001 | Dissolve in distilled water to make proteinase K stock (10 mg/mL) and store aliquots at -20 °C. |
HYB+ | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/mL yeast torula RNA, 50 ug/ul heparin | ||
DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents | Roche | 11175025910; 11685619910 | Refer to manufacturer instructions. |
SP6 RNA polymerase | Roche | 11487671001 | |
T7 RNA polymerase | Roche | 10881775001 | |
T3 RNA polymerase | Roche | 11031171001 | |
RNase 1 inhibitor | Roche | 3335399001 | |
DNase 1 inhibitor, 10 X DNase 1buffer | Roche | 4716728001 | |
glycogen | Roche | 10901393001 | |
Ethanol (EtOH) | Sigma | E7023 | Aliquot 50 ml aliquots of 100% EtOH and 70% EtOH (diluted with molecular grade water) and store at -20 °C. |
molecular grade distilled water | Mediatech | 25-055-CM | |
waterbath | Thermo | 51221073 | Model 2831 |
nanodrop | Thermo | ND-2000c | |
formamide | American Bioanalytical | AB00600 | Store at -20 °C. |
20X SSC | American Bioanalytical | AB13156 | |
MAB | 2L formula: Into 1.5 L of distilled water, mix 23.2 g maleic acid, 17.5 g NaCl, 55.0 g Trisma base, then add 8 mLs of 1M Tris-HCl pH 9.5, and then fill to 2 L. Autoclave. | ||
MABT | MAB + 0.1% Tween-20 | ||
block solution | We make in 50 ml fresh aliquots: 10 mLs of BSA (from 10% lab stock), 5 mls of FCS (from stock), and 35 mLs of MABT. Save unused block at 4 °C to use for antibody solution. Note: Thaw the BSA and FCS stocks at 37 °C—if you thaw at a higher temperature they become a thick gel (do not use). | ||
FCS (fetal calf serum) stock | Invitrogen | 16140089 | Aliquot in 5 or 10 ml portions and store at -20 °C. |
BSA (bovine serum albumin) stock | American Bioanalytical | AB00448 | Make a 10% stock diluted in MAB by dissolving the BSA flakes at room temperature with rapid stirring, then store 10 ml aliquots at -20 °C. Store undissolved BSA flakes at 4 °C. |
anti-digoxigenin antibody | Roche | 11-093-274-910 | Store at 4 °C. |
anti-fluorescein antibody | Roche | 11-426-338-910 | Store at 4 °C. |
12-well staining dish | BD-Falcon | 35-3225 | |
pre-staining buffer | 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20. Always make fresh: it will precipitate in the course of a few days. | ||
staining solution-purple | For every 10mLs needed: add 45 uL of NBT and 35 uL of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples). | ||
staining solution-red | For every 10mLs needed: add 31.5 uL of INT and 35 uL of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples).. | ||
NBT stock | Sigma | N6876 | Stored at -20 °C; powder diluted 50mg/mL in 70% DMF, 30% water. |
INT stock | Sigma | I8377 | Stored at -20 °C; powder diluted 55mg/mL in 70% DMF, 35% water. |
BCIP stock | Sigma | B8503 | Stored at -20 °C; powder diluted 50mg/mL in 100% DMF. |
DMF (dimethylformaldehyde) | American Bioanalytical | AB00450 | |
glycine | Sigma | G8898 | 0.1 M glycine, pH 2.2 |
small plastic Petri dish | Corning | 430589, 430588 | |
glycerol | Sigma | G7893 | |
fine forceps | Roboz | RS-1050 | Dumont Tweezers Pattern #55 |
lash tool | Constructed by affixing a suitable lash to a pipet tip (sizes ranging from P10-P1000 can be used) using superglue. We use a naturally shed human eyelash, a naturally shed animal whisker or wiry fur coat hair, or a natural or synthetic lash purchased from the beauty department at a pharmaceutical or retail store (extra long lashes are most amenable to stable mounting on the pipet tip). The pipet tip is affixed onto a straight rod (8-10 cm in length) such as a needle holder (e.g. Fisher 08-965-A) for easy handling. See Figure 3 for images of these homemade tools. | ||
glass slide | Thermo-Fisher | 4445 | White Frost |
glass coverslip | Thermo-Fisher | 12-540A | 18 x 18 mm |
modeling clay | Hasbro | Playdoh | Other craft modeling clay products can be substituted |
slide holder | Thermo-Fisher | 12-587-10 | Cardboard tray to store slides flat |
stereomicroscope | Nikon | SMZ645, SMZ1000 | |
compound microscope | Nikon | 80i, 90i |