Den zebrafisk embryot är en utmärkt modell för utvecklingsbiologisk forskning. Under embryogenes, zebrafisk utvecklas med en äggula massa, som presenterar tredimensionella utmaningar för prov observation och analys. Detta protokoll beskriver hur man skapar tvådimensionella platta mount beredningar av hela montera in situ (WISH) färgade zebrafisk embryo exemplar.
Den zebrafisk embryot är nu vanligt för grundläggande och biomedicinsk forskning för att undersöka den genetiska kontrollen av utvecklingsprocesser och att modellera medfödda avvikelser. Under den första dagen i livet, fortskrider den zebrafisk embryot genom många utvecklingsstadier, inklusive gödsling, klyvning, gastrulation, segmentering, och organogenesen av strukturer såsom njure, hjärta och centrala nervsystemet. Anatomi av en ung zebrafisk embryo presenterar flera utmaningar för visualisering och analys av vävnader som är inblandade i många av dessa händelser, eftersom embryot utvecklas tillsammans med en rund äggula massa. Således, för noggrann analys och avbildning av experimentella fenotyper i fasta embryonala exemplar mellan tailbud och 20 somit stadiet (10 och 19 timmar efter befruktning (HPF), respektive), såsom de som färgas med hela montera in situ hybridisering (WISH), det är ofta önskvärt att avlägsna embryot från gulan ball och för att positionera den platt på ett objektglas. Däremot kan utföra ett platt fäste förfarande vara tråkiga. Därför framgångsrik och effektiv plan montera beredning underlättas i hög grad genom den visuella demonstration av dissektion tekniken, och också hjälpt av att använda reagens som hjälper till optimal hantering vävnad. Här ger vi vår WISH protokoll för en eller två-färgs detektion av genuttryck i zebrafisk embryot, och visa hur platt monteringsförfarandet kan utföras på detta exempel på en färgade fasta prov. Denna platta montering protokoll är brett tillämpbar på studiet av många embryonala strukturer som uppstår under tidig zebrafisk utveckling, och kan genomföras parallellt med andra färgningsmetoder som utförs på fasta embryoprov.
Den zebrafisk, Danio rerio, har blivit en allmänt använd organism i studien av utvecklingsbiologi. Zebrafisk är en tropisk, sötvatten ryggradsdjur som tillhör familjen Cyprinidae. Zebrafisk användes ursprungligen för miljöforskning för att få information om riskerna med potentiella vattenföroreningar, eftersom de var lätt att få, billig och lätt att underhålla 1. Under de senaste trettio åren har zebrafisk blivit erkänd som en genetiskt lätthanterlig ryggradsdjur modellsystem för en mängd orsaker. Zebrafish visar en hög grad av anatomiska och fysiologiska bevarande med högre ryggradsdjur inklusive däggdjur 2,3. Nyligen genomsekvensen anteckning har visat att cirka 70% av mänskliga gener har minst en zebrafisk motsvarighet 4. Till exempel har många ortologa gener som spelar en viktig roll under njurutveckling förekommer mellan dessa arter 5-7. Denna DRAmatic grad av bevarande med avseende på cell-och molekylärbiologi har gjort det möjligt för forskare att skapa modeller för ett brett spektrum av mänskliga sjukdomar i zebrafisk 8, och zebrafisk har blivit ett värdefullt verktyg för att identifiera potentiella läkemedelsbehandlingar med hjälp av kemiska genetiska skärmar 9.
Dessutom är inte bara möjlighet att rekapitulera en mängd komplexa utvecklingsprocesser och sjukdomstillstånd som ses hos människor, men flera ytterligare attribut öka även sitt överklagande som modellorganism för embryologiska studier av zebrafisk modell. Zebrafisk är oviparous och reproducera genom broadcast lek, vilket ger forskare med enkel tillgång till de embryon från uppkomsten av befruktning 10. Andra fördelar är embryo storlek, öppenhet, och snabb, extern utveckling 10. Dessutom, zebrafisk vuxna har hög fruktsamhet och vanligtvis producerar relativt stora kopplingsstorlekar som kan variera mellan 200-500per vecka, i slutändan gör det möjligt för forskare att utföra hög genomströmning experiment, såsom fenotyp baserad kemiska skärmar, med lätthet 9.
Trots detta, trots de många fördelar som är utställda av zebrafisk modell, det finns utmaningar som hänför sig till analys och kommunikation av de experimentella resultaten från tidiga utvecklingsstadier. I vissa fall kan den inneboende anatomin i zebrafisk embryot skymma visualiseringen av en data. Efter befruktningen, genomgår den initiala cell flera klyvningshändelser som utvecklingen fortskrider 11. Efter gastrulation, framträder den embryonala axeln vid tailbud stadiet (10 HPF) så att den lindas runt äggulan 11. Som senare utveckling fortskrider genom segmenteperioden, kommer stammen att växa i massa och även förlänga med axiell töjning så att en svans tillsammans med en del av gulesäcken själv sträcker sig ut från den centrala äggula massan11. Mellan tailbud och 20 somit stadiet (19 HPF), försök att följa särskilda utvecklingsfunktioner efter utnyttjande av olika färgningsprotokoll som vill kan vara en utmaning både för att visualisera och fotografera på grund av geometrin hos embryot och opacitet gulesäcken. Ett sätt att eliminera dessa problem är att ta bort äggulan och därefter platta till embryo i en två-dimensionell prov som kan analyseras på ett mer rättframt sätt.
Följande protokoll och videoresurser ger en guide för hur man framgångsrikt deyolk och platt montera ett embryo efter fixering och färgning, med hjälp av exempel på en eller två färger WISH färgning. WISH är en allmänt använd teknik som möjliggör detektering av specifika nukleinsyror i konserverade prover och därmed gör det möjligt att ställe (n) av genuttryck som skall detekteras inom vävnader. WISH-tekniker har beskrivits utförligt, och kan utföras med olika färgsubstrat liksom influensaorescent detektionssystem 12-20. Här ger vi vår modifierade WISH protokoll som används för zebrafisk embryon mellan tailbud och segmenteutvecklingsstadier. Alternativa WISH protokoll, dock är kompatibla med den platta fästet förfarande som beskrivs här, som inledningsvis av protokollet nedan. Dessutom kunde platt monterings användas tillsammans med vilket som helst antal av existerande visualiseringstekniker, som till exempel hela montera immunohistokemi eller cellhärstamnings tracking etiketter, som inte beskrivs i detta protokoll. Sammantaget kan tekniken med platta montering bättre möjliggör överlägsen analys och presentation av data från experiment med de tidigaste stadierna av embryonal utveckling i zebrafisk.
Zebrafisk har visat sig vara ett mycket värdefullt modellorganism i hela forskarvärlden under de senaste åren. Zebrafisk uppvisar en betydande grad av genetisk konservering med det av högre ryggradsdjur, och fördelar som rör deras anatomi, avel, och livscykel gör denna art mycket mottagliga för experimentella analyser. Dessutom har utvecklingen av molekylära tekniker som gäller för zebrafisk främjas ytterligare användningen av denna modellorganism i vetenskaplig forskning. Till exempel har ett stort utbud av transgena zebrafisk linjer tagits fram för att studera sjukdomsförloppet och besvara många grundläggande frågor som ligger bakom de viktigaste mekanismerna för utveckling inklusive organogenesen.
Följaktligen, baserat på dynamisk användning av zebrafisk i både sjukdomen och dess utvecklingsforskning, cellmärkningsmetoder och signal kvantifiering är en viktig aspekt av dataanalyser. Även metoder som använder fluorescerande etttibodies kan användas för att detektera proteinuttryck i transgena zebrafisk, forskare förlitar sig typiskt på standardförfaranden som WISH 12-16 att undersöka spatiotemporal lokalisering av gentranskript i en fast, icke-transgena zebrafisk provet. I själva verket är WISH en av de mest använda teknikerna i biologi 16, och är ett viktigt verktyg som används för att karakterisera fenotypen av genetiska mutationer och kemiska genetiska störningar. Icke desto mindre är WISH associerad med ett antal potentiella fallgropar och utmaningar. För att bekräfta specificiteten av antisens ribroprobe kan sens-riboprober användas som en kontroll för att bedöma specificiteten av antisens-riboprob färgningsmönster. Medan avsnitten 4 och 5 presenteras i den ordning märkning och upptäckt av en digoxygenin märkt prob följt av fluorescein-märkta sonden, kan denna ordning vändas. Normalt är svagare signaler (gener med lägre uttryck nivåer) bäst upptäckas med digoxigenin-märkta prober och denna fläckutvecklades först med en lila substrat, följt av detektion och färgning av starkare signal (mer rikligt uttryckt gen) genom att använda den röda underlaget. Men om två-färgreaktioner kommer att genomföras, är det rekommenderat att olika kombinationer av etiketter och substrat testas för att finna det förfarande som är mest lämpad för insamling och analys av data. Dessutom, de tider som anges blockering, antikropps inkubation och tvätt i avsnitten 4-5 är anpassade för embryon yngre än 24 timmar efter befruktning; långa intervaller av samma steg med äldre embryon kan leda till salt ackumulering på provet. Omfattande tips för felsökning standard zebrafisk embryo WISH har redan dokumenterats i litteraturen 12-16. Förmodligen den vanligaste dilemmat är hög bakgrund. Vi rekommenderar att öka antalet MABT tvättar i steg 4,7 till 15-20 tvättar om det behövs, men i vår erfarenhet tillägget av natten MABT "super-wash"ger enastående resultat när den används tillsammans med 10 eller fler korta MABT tvättar innan du går vidare till steg 4,8. Ett annat exempel dilemma är dålig sond infiltration, vilket kan förekomma med långa riboprobes. Klippning av riboprobe följande steg 3,6 genom alkalisk hydrolys kan motverka detta. I vår erfarenhet med unga prover, är sond klippning normalt inte behövs. Man bör dock ha i åtanke att parametrar som detta kan vara bidragande faktorer i resultatet av en WISH experiment, och vi föreslår granskning av dessa användbara felsökningsinstruktioner redan finns tillgänglig i samhället som behövs för att förfina de experimentella parametrar för WISH i din egen forskning 12.
Förutom traditionella WISH tekniker 12-16, har det skett en kontinuerlig växten av framsteg inom WISH metoder och alternativa protokoll som har formulerats. Dessa omfattar nya sätt att signaldetektering, såsom genom användning av fluorescens 17-19, att metoder som möjliggör lokalisering av microRNAs 20. Trots detta, trots de många förbättringar som har gjorts till aktuella cellmärkningsmetoder, är hur effektiva dessa förfaranden negeras om fläcken (s) inte lätt kan visualiseras i provet av intresse vid en önskad tidpunkt. Denna begränsning är problematiskt för forskare, särskilt när det avser de tidiga embryonala stadier av zebrafisk ontogeni, vilket potentiellt kan leda till luckor i vår förståelse av olika utvecklingsprocesser som uppstår vid dessa tillfällen. Under normal zebrafisk utveckling kommer gulesäcken successivt minskar i storlek eftersom embryot åldrarna 11. Därför är vid dessa senare utvecklingsstadier (> 24 h efter befruktning), är ganska okomplicerad WISH-färgning för att analysera på grund av att embryot är större i jämförelse med dess angränsande gulesäcken. Detta är dock inte fallet från svansen knoppstadiet till tidig somitogenesis (när embryonalamassan är placerad runt gulan) där den opaka gulesäcken ibland kan skymma visualiseringen av fläcken. Följaktligen var metoden för platt montering fram för att lindra de bild-och dataanalys problem i samband med karakteriseringen av tidiga zebrafisk embryo prover (schematiserade i Figur 1 och Figur 2), och har varit i stort sett används sedan systematiskt fenotypning av genetiska mutationer isolerade från de första storskaliga genetiska skärmar 21.
Sedan tillkomsten av den plana monteringsteknik, har analysen av tidiga utvecklingsstadier förbättrats betydligt. När gulan avlägsnas från embryot, är det möjligt att lägga embryot platt på ett objektglas i den önskade orienteringen för avbildning. Denna tvådimensionella läget möjliggör visning av hela embryot på en gång, vilket eliminerar behovet av att rotera provet. Många vävnader finns i breda områden av embryot, till exempelprekursorerna, som bildar blod och njure. Vidare kan man behöva jämföra flera olika utvecklings vävnader på en gång. Platt montering möjliggör att forskaren att samtidigt visa hela domänen av sådana cellgrupper, och därmed i hög grad kan underlätta kvantifieringar såsom ett mätningsområde för en vävnad eller cellräkningar. Denna teknik har i slutändan hjälpt leda till många upptäckter rörande en rad viktiga utvecklings mekanismerna bakom blodbildningen, neurogenes, och organogenesen. Således, en gång bemästrat, ansökningarna om denna enkla teknik för forskare är ganska betydande.
Till exempel i en studie för att undersöka härstamning val under blodbildningen, platt montera beredningar av zebrafisk embryon vid 14 och 18 somit steg (ss) användes för att illustrera de förändringar som skett i uttrycksmönstret för PU.1 zinkfingertranskriptionsfaktor mellan vildtyp och GATA1 morpholino injiceras embryon 22.Denna metod gjorde det möjligt för detektion av en expanderad PU.1 domän vid 18 ss, vilket indikerar att GATA1 är mest sannolikt att reglera expressionen av PU.1 i det mellanliggande cellmassan (ICM) runt denna tidpunkt. Ytterligare platt monterade embryon som färgats för olika erytroida gener inklusive gtpbp1 och epsin visade en förlust i uttrycket av dessa gener i vlt mutanter som var GATA1 – / -. Ytterligare analyser visade ingen förändring i uttrycket av erythoid gener som biklf och testhymin som var kända för att vara oberoende av gata aktivitet. Därför, tillsammans med sina andra experimentella resultat, visade det sig att GATA1 är viktigt att reglera differentiering av celler i Myelosuppression erytroid härstamning. I en studie på neural crest utveckling, var platt fästen används för att undersöka Crestin expression i Mont Blanc (MOB M610)-mutanter i en studieundersöka roller Mont Blanc och tfap2a geners funktion 23. Vid 10 och 20 ss, var Crestin uttryck helt upphävts i huvudet och minskade i bakluckan regionen mob M610 mutanter i jämförelse med den normala vildtyp uttryck, i slutändan hjälpa denna grupp att dra slutsatser om vikten av Mont Blanc och tfap2a reglering under neural crest bildning. Dessutom, i termer av organogenesen har platta fästen möjliggjort upptäckten av närvaron av distinkta domäner i den tidiga njur progenitor fältet under utveckling av zebrafisk embryonala njur-, känd som pronephros. Den zebrafisk embryot ger en konserverad och ändå anatomiskt okomplicerat system för att studera hur njur stamceller ger upphov till nefronet funktionella enheter som utgör de pronephros, en process som kallas nephrogenesis 6,7 (Figur 4). Flat montera analys har varit till nytta för dokument domäner av reinterna stamfäder och att dissekera resultatet av förändringar i RA signalering under pronephros mönstring 6,7 (Figur 5), som tidigare var okänd. Sammantaget dessa exempel visar att det faktiskt finns många breda applikationer för denna platta montera protokoll i studiet av olika processer som uppstår vid normal utveckling och sjukdomstillstånd.
Begreppsmässigt är ganska enkel övergripande denna platta mount procedur. Däremot kan de manipulationer och grad av finess som krävs för att bemästra denna metod vara ganska utmanande att bemästra i avsaknad av visuell demonstration. Därför var detta protokoll sammanställts för att göra det möjligt för forskare, särskilt de nya i zebrafisk modellen, med en möjlighet att bättre förstå hur man utför den här tekniken och dela våra råd om de reagenser som kan optimera vävnadshantering. Vi hoppas att detta protokoll i slutändan gör att andra i samhället för att förfina de mest idealiska provförhållanden som used för premium bildbehandling, dataanalys och kommunikation av resultaten i publikationer. I slutändan bör det göra det möjligt för forskare att övervinna de anatomiska hinder i zebrafisk under tidig embryogenes, vilket kan skymma presentation av experimentella resultat, och lösa dem med hjälp av denna enkla men betydelsefulla teknik.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har delvis stöd av finansiering till RAW från var och en av följande: NIH bidrag K01 DK083512, DP2 OD008470, och R01 DK100237; March of Dimes Basil O'Connor Startat Scholar beviljande av bidrag nr 5-FY12-75; starta fonder från University of Notre Dame College of Science och Institutionen för Biological Sciences. Vi vill särskilt tacka Elizabeth och Michael Gallagher, tillsammans med hela Gallagher Family, som förmedlade en generös gåva till University of Notre Dame för att främja stamcellsforskning. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet. Vi tackar de stavar av Institutionen för Biological Sciences för deras stöd, och Centrum för Zebrafish forskning på Notre Dame för deras enastående engagemang i vård och omsorg om våra zebrafisk koloni. Slutligen, vi tackar medlemmarna i vår forskningslabb för sina kommentarer, diskussioner och insikter om detta arbete, somsamt Marigold (Maripooka) och Zinnia Wingert för att ge naturligt kasta katt morrhår för att göra mest utmärkt lash verktyg för vår forskning.
50 X E3 | 250 mM NaCl, 8.5 mM KCL, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination. | ||
1 X E3 | Dilute 50 X E3 in distilled water. | ||
mesh tea strainer | English Tea Store | SKU #ASTR_KEN, MPN#1705 | |
embryo incubation dish | Falcon | 35-1005 | |
transfer pipet | Samco | 202, 204 | |
flat-bottom microcentrifuge tube | VWR | 87003-300; 87003-298 | |
glass vial | Wheaton | 225012 | |
1 X Pbst | 0.1% Tween-20 detergent in 1 X Pbs, made by diluting 10 X Pbs in distilled water. | ||
Tween-20 stock | American Bioanalytical | AB02038 | |
10X Pbs | American Bioanalytical | AB11072 | |
paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 19210 | |
4% PFA/1X Pbs | Dissolve 4% PFA (w/v) in 1 X Pbs, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze aliquots for storage at -20 °C. Thaw just before use and do not refreeze stocks. | ||
filter sterilization unit | Corning | 430516 | 1L filter system, 0.45 um CA |
MeOH | Sigma | 34860-4L | |
proteinase K | Roche | 03-115-879-001 | Dissolve in distilled water to make proteinase K stock (10 mg/mL) and store aliquots at -20 °C. |
HYB+ | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/mL yeast torula RNA, 50 ug/ul heparin | ||
DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents | Roche | 11175025910; 11685619910 | Refer to manufacturer instructions. |
SP6 RNA polymerase | Roche | 11487671001 | |
T7 RNA polymerase | Roche | 10881775001 | |
T3 RNA polymerase | Roche | 11031171001 | |
RNase 1 inhibitor | Roche | 3335399001 | |
DNase 1 inhibitor, 10 X DNase 1buffer | Roche | 4716728001 | |
glycogen | Roche | 10901393001 | |
Ethanol (EtOH) | Sigma | E7023 | Aliquot 50 ml aliquots of 100% EtOH and 70% EtOH (diluted with molecular grade water) and store at -20 °C. |
molecular grade distilled water | Mediatech | 25-055-CM | |
waterbath | Thermo | 51221073 | Model 2831 |
nanodrop | Thermo | ND-2000c | |
formamide | American Bioanalytical | AB00600 | Store at -20 °C. |
20X SSC | American Bioanalytical | AB13156 | |
MAB | 2L formula: Into 1.5 L of distilled water, mix 23.2 g maleic acid, 17.5 g NaCl, 55.0 g Trisma base, then add 8 mLs of 1M Tris-HCl pH 9.5, and then fill to 2 L. Autoclave. | ||
MABT | MAB + 0.1% Tween-20 | ||
block solution | We make in 50 ml fresh aliquots: 10 mLs of BSA (from 10% lab stock), 5 mls of FCS (from stock), and 35 mLs of MABT. Save unused block at 4 °C to use for antibody solution. Note: Thaw the BSA and FCS stocks at 37 °C—if you thaw at a higher temperature they become a thick gel (do not use). | ||
FCS (fetal calf serum) stock | Invitrogen | 16140089 | Aliquot in 5 or 10 ml portions and store at -20 °C. |
BSA (bovine serum albumin) stock | American Bioanalytical | AB00448 | Make a 10% stock diluted in MAB by dissolving the BSA flakes at room temperature with rapid stirring, then store 10 ml aliquots at -20 °C. Store undissolved BSA flakes at 4 °C. |
anti-digoxigenin antibody | Roche | 11-093-274-910 | Store at 4 °C. |
anti-fluorescein antibody | Roche | 11-426-338-910 | Store at 4 °C. |
12-well staining dish | BD-Falcon | 35-3225 | |
pre-staining buffer | 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20. Always make fresh: it will precipitate in the course of a few days. | ||
staining solution-purple | For every 10mLs needed: add 45 uL of NBT and 35 uL of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples). | ||
staining solution-red | For every 10mLs needed: add 31.5 uL of INT and 35 uL of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples).. | ||
NBT stock | Sigma | N6876 | Stored at -20 °C; powder diluted 50mg/mL in 70% DMF, 30% water. |
INT stock | Sigma | I8377 | Stored at -20 °C; powder diluted 55mg/mL in 70% DMF, 35% water. |
BCIP stock | Sigma | B8503 | Stored at -20 °C; powder diluted 50mg/mL in 100% DMF. |
DMF (dimethylformaldehyde) | American Bioanalytical | AB00450 | |
glycine | Sigma | G8898 | 0.1 M glycine, pH 2.2 |
small plastic Petri dish | Corning | 430589, 430588 | |
glycerol | Sigma | G7893 | |
fine forceps | Roboz | RS-1050 | Dumont Tweezers Pattern #55 |
lash tool | Constructed by affixing a suitable lash to a pipet tip (sizes ranging from P10-P1000 can be used) using superglue. We use a naturally shed human eyelash, a naturally shed animal whisker or wiry fur coat hair, or a natural or synthetic lash purchased from the beauty department at a pharmaceutical or retail store (extra long lashes are most amenable to stable mounting on the pipet tip). The pipet tip is affixed onto a straight rod (8-10 cm in length) such as a needle holder (e.g. Fisher 08-965-A) for easy handling. See Figure 3 for images of these homemade tools. | ||
glass slide | Thermo-Fisher | 4445 | White Frost |
glass coverslip | Thermo-Fisher | 12-540A | 18 x 18 mm |
modeling clay | Hasbro | Playdoh | Other craft modeling clay products can be substituted |
slide holder | Thermo-Fisher | 12-587-10 | Cardboard tray to store slides flat |
stereomicroscope | Nikon | SMZ645, SMZ1000 | |
compound microscope | Nikon | 80i, 90i |