Abstract
電子常磁性共鳴（EPR）は、酸化還元滴定は、強力な方法は、タンパク質中の補因子の中点電位を決定し、それらの検出可能なレドックス状態に補因子を同定および定量するために監視されている。
それは電子伝達率に関する情報を提供していませんが、検討中のタンパク質に補因子のアイデンティティと酸化還元状態を確立しないような技術は、直接電気化学（ボルタンメトリー）のアプローチ、と相補的である。技術は、電子常磁性共鳴（EPR）検出可能な補因子を含有する任意のタンパク質に広く適用可能である。
典型的な滴定は1〜100μMの範囲の補因子の濃度が2ミリリットルのタンパク質が必要です。タンパク質は、特定の電位における試料ポイズのために、化学的還元剤（亜ジチオン酸ナトリウム）または酸化剤（フェリシアン化カリウム）で滴定する。白金線及びAg / AgCl参照電極をボルトに接続されている。タンパク質溶液の電位を測定するための計器。 13の異なるレドックスメディエーターのセットは、タンパク質の酸化還元補因子と電極との間に平衡化するために使用される。試料タンパク質の異なる酸化還元補因子に特徴的な、異なる電位および電子常磁性共鳴スペクトルで描かれているが、測定される。試料電位に対する信号強度のプロットは、補因子の中点電位を決定するために、ネルンストの式を使用して分析される。
Introduction
それはこの惑星、光合成、窒素固定と呼吸に生命を維持する最も基本的な化学プロセスは、有機および無機の酸化還元補因子の広い範囲を含む大きなタンパク質複合体によって触媒されることに顕著である。これは、全てのタンパク質の約30％が1つまたは複数の金属補因子を含んでいると推定されている。1,2は 、酸化還元補因子を直接電気化学（ 例えば 、タンパク質フィルムボルタンメトリー）または酸化還元滴定を使用して確立することができる識別し特徴付ける。 2の技術は、その性質や適用性で相補的である。ボルタンメトリーは電極表面と反応することができるの中点電位および補因子の電子移動速度の速い決定を提供しています。3,4は通常、このようなシトクロムcまたはフェレドキシンなどの電子伝達タンパク質、に適しています。そして、それは時々、電極表面に固定化されたより複雑なタンパク質のために働く。の詳細な知識タンパク質における補因子の性質は、ボルタングラムは、補因子のアイデンティティ上の任意の直接的な情報を与えることはありませんように、利用可能でなければならない。レドックス滴定は、タンパク質のmgの量を実行し、必要とする方が面倒である。しかしながら、それらは中間電位と補因子のアイデンティティに関する情報を提供する。 図5は、さらに、単一の滴定にタンパク質内の複数の補因子を監視することができる。
酸化還元滴定の原理は、レドックス活性タンパク質または酵素は、化学的に還元または酸化されることである。補因子は、還元剤または酸化剤の酸化還元メディエーターが使用されていると反応していることを確認するために。溶液の電位を測定することができるように、これらの酸化還元メディエーターは、電極と反応する。メディエーターは、酸化還元緩衝剤として作用し、蛋白質と電極における補因子との間で平衡化する。 AW化学的に所望の値に電位をpoisingした後、サンプルが引き出されるとすぐに液体窒素中で凍結させ分光技術とのさらなる分析をAIT。 EPR分光法は、それを定量的に常磁性金属中心または有機基を測定するために使用することができるように、この点で特に有用である。
酸化還元滴定は、二方向に実行することができます：ローからハイに、またはハイからロー中間電位に。選択は、研究対象の補因子の安定性に依存している。多くの場合、低電位で開始し、可能性を高める段階的に酸化剤を追加することが賢明です。これは、酸化滴定と呼ばれ、ここで説明されている。ここでは、 出芽酵母由来のタンパク質Nar1を含む鉄-硫黄クラスターの酸化還元滴定を示した。このタンパク質は、細胞質の鉄硫黄クラスター生合成機構（CIA経路）において、足場タンパク質として、可能性が関与している。6,7
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Protocol
セットアップとソリューションの作製
- 100mMトリス、250mMのNaClおよびpH8.5の10％グリセロールを含む緩衝溶液を調製する。アルゴンでフラッシュすることによりバッファを脱気。嫌気性チャンバー内にバッファを導入する。
- 2回に分けてバッファを分割します。一部分（緩衝液A）に1mMのDL-ジチオスレイトール（DTT、Mは、154.25グラム/モルrを）および1mMのL-システインを加える。他の部分（バッファーB）は、還元剤が含まれていない。
- 酸化剤と還元剤溶液を調製する。 1ミリリットルの2の溶液20、および200mMのフェリシアン化カリウムを加える（FIC、Mは、329.26グラム/モルrを）および嫌気性緩衝液B中の亜ジチオン酸ナトリウム（SD、Mは、174.11グラム/モルrの ）の
- 次のようにメディエーターミックスを調製する：
- Bバッファするために、以下のレドックスメディエーターおよび50mMのNaClの各160μMの追加：N、N、N '、N' -テトラメチル-p-フェニphenylendediamine（TMPD、Mは、237.17グラム/モルrは 、E '0 0.276 V） 、2,6-ジクロロフェノールインドフェノールメチレンブルー（M rは 319.85グラム/モル、E '、'フェナジンエトサルフェート（PES、Mは、334.4グラム/モル、E rは 、（0 0.217 V 0 0.055 V）DCIP、Mは、290.08グラム/モル、E rを'）を0 0.011 V）、レゾルフィン（M rは 235.17グラム/モル、E '0 -0.051 V）、Indigodisulphonate（M rは 466.35グラム/モル、E' 0 -0.125 V）、2-ヒドロキシ-1,4- naphtaquinone（ M rは 174.15グラム/モル、E '0 -0.145 V）、アントラキノン-2-スルホン酸（M rは 328.28グラム/モル、E' 0 -0.225 V）、フェノサフラニン（M rは 322.8グラム/モル、E '0 -0.252 V）、サフラニンO（M rは 350.84グラム/モル、E '0 -0.280 V）、ニュートラルレッド（M rは 288.8グラム/モル、E' 0 -0.340 V）、ベンジルビオロゲン（M rは 409.4グラム/モル、E '0 -0.350 Vの）、およびメチルビオロゲン（M rは 257.16グラム/モル、E' 0 -0.440 V）。
- 仲介者を保護するためにアルミホイルで瓶をラップ光からS。
- 準備10mg / mlのS. cerevisiaeの StrepタグNar1タンパク質バッファーAエクスプレスSに（181μM、Mは55.2 kDaのR） E.で出芽酵母 Nar1のpET24a発現ベクターを用いて、連鎖球菌タグ化タンパク質として大腸菌 。のStrep-Tactinのクロマトグラフィー媒体（IBA）を用いて、嫌気性チャンバー内のタンパク質を精製などのAkta精製装置（GE Healthcare社）のようなタンパク質精製システムを用いて精製する。
- 次のように嫌気性チャンバー内酸化還元滴定のセットアップを準備します。
- Ag / AgCl参照電極および白金線電極を滴定容器に接続する。 V.までmVのから測定することができます電圧計に両電極を接続します
- 小さな撹拌棒を挿入します。
- マグネチックスターラー上記滴定容器を置きます。
- すなわち、72μMタンパク質および各38μMの最終濃度までバッファーB、最大2 mlのメディエーター混合溶液及びタンパク質溶液で滴定容器に充填仲介者。注：タンパク質濃度に依存して、必要なメディエーター三つの溶液の量が調整されるべきである濃度。
- 30分間攪拌し、電圧計のスイッチを入れる。
- 10清潔な石英ガラスEPR管を準備します。嫌気性チャンバー内チューブを導入する。
- 液体窒素で（200ミリリットル年頃 ）小型の液体窒素デュワーを埋める。
2.レドックス滴定を行います
- ソリューションの電位が安定するまで待ちます。注：実際には、これは、潜在的には毎分1mV未満漂うことを意味する。
- 電圧計によって与えられた可能性を書き留め。
- 200μlのの最初のサンプルを描画し、EPR管に注入する。
- ゴム栓でチューブをキャップと嫌気性チャンバーからチューブを取り外します。
- 注意：以下のように液体窒素中でチューブを凍結！これは、ゆっくりと行う必要があり、そうでなければ、チューブが破損します。
- まずTを挿入液体窒素中でチューブのIP。
- シューという音が聞こえるまで待ってください。注：これは10秒ほどかかる場合があります。
- サンプル部品が完全に浸漬されるように、ゆっくりとチューブの残りの部分を挿入します。
- -0.6 Vにソリューションの可能性を下げるために滴定容器内の溶液に2 mMのSD液の小アリコート1-2μLを追加
注：複数の10μlを添加しなければならない場合、20 mM溶液に切り替える。それは、特定の潜在的な値にポイズのは非常に困難であるように、電圧計に記録された実際の値は切下げと滴定曲線を構築するために使用される。 - ステップ2.3から2.5で説明したようにサンプルを描画します。
- 電圧計によって与えられた実際の電位を下に注意してください。
- ポテンシャルは約 50 mVに増加しているまで、酸化剤を追加します。 2 mMのFICソリューションの小アリコート1-2μLを追加することで起動します。以上の10μlを添加しなければならない場合、20 mM溶液に切り替える。
- HOを下に注意してくださいワットソリューションの多くが追加されました。注：これは、滴定中のサンプルの希釈を補正する必要がある。
- ステップ2.3から2.5で説明したようにサンプルを描画します。
- 電圧計によって与えられた実際の電位を下に注意してください。
- 繰り返しますが、-0.6 Vから0.2 Vへの潜在的な範囲まで、2.9と2.12ステップがカバーされており、全10 EPR管は200μlの各充填される。
注：すべての撤退と体積が減少すると、電極の位置を調整する必要が攪拌の干渉なしに溶液との良好な接触を有することができる。これは、最後のサンプルの回収後に電位を測定することは困難であるので、そのサンプルの電位はあまり正確であってもよい。 - EPR測定が行われることができるまで、必要に応じて、液体窒素中で凍結したEPRのサンプルを格納。
EPR分光法およびデータ解析を使用して3.メジャー滴定サンプル
- 異なるの記録EPRスペクトル滴定のサンプル次のように：
- <10 -5バーに石英クライオスタットを排気する高真空ポンプを使用してください。
- EPRマグネットの水冷に切り替えます。 EPRの空洞を通して乾燥空気の流れを開きます。
- 磁石への電源供給とEPRのコンピューターのスイッチをオンにします。
- 周波数較正プログラムを実行します。 EPR測定パラメータを設定します。液体ヘリウムデュワーにクライオスタットを接続します。 9-16 Kに空洞を観る
- キャビティ内のEPRサンプルを紹介します。 EPRスペクトルを記録します。
- 別のEPR種を同定し、シグナルを定量化するために最善のスペクトルを使用しています。スペクトルと外部銅標準溶液を10mMのCuSO 4月 10日mMの塩酸/ 2 MのNaClO 4のスペクトルとの比較の二重積分によりEPRの定量化を実現。8
- 次のように滴定曲線を行います。
- パラに特徴的なg値でEPR信号振幅をプロット潜在に対する関心の磁気種。
- ステップ3.2からEPR定量を用いてスピン/分子スケールにEPR信号振幅スケールを変更する。
- 酸化または還元剤の添加により発生した希釈のため、各サンプルの信号振幅を補正する。
- Ag / AgCl参照電極の中間電位の可能性を修正する。
注：（飽和KClを含む）、Ag / AgCl参照電極は、25℃における標準水素電極（SHE）に対して0.194 Vの中点電位を有する。電圧計の電位が-0.6 V 年頃読み込みしたがって、彼女を参照して、可能性は-0.4 Vです。
- 次のようにネルンストの式に信号を合わせる：
還元状態で常磁性である種の場合：
Oで常磁性である種のためにxidized状態：
中間状態で常磁性である種の場合：
これらの式は、一つの電子が転送されるレドックス反応のために有効であるので、n = 1である。
ボルトでE =潜在的な
ボルトでのE、M =中間電位
F =ファラデー定数= 96480 C·モル-1
R =気体定数= 8.314 J·K -1·モル-1
Tケルビンで=温度
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Representative Results
Nar1：[3FE-4S]クラスター、[4FE-4S]クラスター及び単核鉄センター（ 図1） サッカロマイセス·セレビシエ由来のタンパク質Nar1を含む鉄-硫黄クラスターの酸化還元滴定は、3つの異なる補因子を同定した。 EPR信号は、それらのG値によって特徴付けられる：用[3FE-4S] + G Z 2.01、G クロスオーバー 2.00（ 図1B）。 [4FE-4S] +、G Z 2.02グラムyを 1.93、G のx 1.82（ 図C）、及び核のFe 3+ G 4.3および9.7（ 図1A）のためのために。 [4FE-4S] +クラスターのEPR信号はNar1について報告されているものと非常に類似している以前に。6,9核鉄のEPR信号は菱形高スピン鉄種（ 図1A）に特徴的である。
EPR信号の定量化は、[4FE-4S]ことが示されたクラスタおよび単核鉄は約タンパク質濃度の60％モルであり、かつ[3FE-4S]クラスターの含有量は、わずか5％（ 図1）であること。 [3FE-4S]クラスターは、おそらく分解産物及び不完全クラスタである。 [3FE-4S]クラスター信号は、おそらく酸化分解に、0.05 Vの上に姿を消した。
以下の中間点電位が異なる補因子について決定した。
単核鉄センターの鉄3+ / Feの2+カップル（ 図2A）のための0.003 V、-0.125 [3FE-4S]用のV + / [3FE-4S] 0カップル（ 図2B）と-0.45の間で[4FE-4S] 2+ / [4FE-4S] +カップル（ 図2C）および-0.50 V。 [4FE-4S]の低い値に起因して決定することができない正確な中間電位をクラスタ化しない。 [4FE-4S]クラスターの低電位は、それが中の酸化還元の役割を持っていないことを示していますそれはクラスタを低減することは非常に困難であるように、タンパク質。単核鉄中心は、細胞質に還元または酸化することができる。このセンターのレドックス役割は、ことが可能である。
精製Nar1タンパク質上の独立した鉄の決定はferene法を用いて行った。10これは、3.2のFe /分子を得た。単核鉄信号は分子あたり0.6のFeを表し、[3FE-4S]クラスターは、0.05分子当たりある。これは2.45のFe /分子、およびタンパク質分子あたりしたがって、0.61 [4FE-4S]クラスターを残します。 -0.45Vで[4FE-4S] +クラスターのEPRシグナルの定量化は、0.26スピン/分子をもたらした。だから、[4FE-4S]はクラスタがこれらの定量化に基づいて、-0.45 Vに減少させることができた[4FE-4S]の中点電位が2+ / [4FE-4S]は+カップルの-0.46 Vが決定されたのだけ42％ 。
図1：EPR Nar1の異なる補因子のスペクトル。 0.031 V. EPR条件で構えNar1の（A）核高スピン鉄のS = 5/2シグナル：マイクロ波周波数、9.386ギガヘルツ。マイクロ波電力、20デシベル。変調周波数、100kHzで、変調振幅、12.5 G。 -0.004 V. EPR条件で構えNar1の温度、16 K.（B）[3FE-4S]クラスター+ S = 1/2シグナル：マイクロ波周波数、9.386ギガヘルツ。マイクロ波電力、16デシベル。変調周波数、100kHzで、変調振幅、12.5 G。温度、9.5 K. （C）[4FE-4S] + -0.45 V. EPR条件で構えNar1のクラスタS = 1/2シグナル：マイクロ波周波数、9.385ギガヘルツ。マイクロ波電力、16デシベル。変調周波数、100kHzで、変調振幅、12.5 G。温度、-0.25 V以下は9.2 K.メチルビオロゲンおよびベンジルビオロのカチオンラジカル種に起因しているシャープS = 1/2信号（*）が登場、。
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図2：Nar1の補因子の酸化還元滴定。 （A）G = 4.3で監視し、単核高スピン鉄（III）信号の滴定曲線、[3FE-4S]の（B）滴定曲線+ [4FE-4S]の信号G = 2.01で監視（C）滴定曲線。 +信号G = 1.82で監視。実線は[3FE-4S] + / [3FE-4S用の単核鉄センターの鉄3+ / Feの2+カップルのための中間点電位0.003 Vのn = 1の酸化還元遷移のためのフィット、-0.125 Vです] [4FE-4S] 2+ / [4FE-4S] +カップルのための0カップル-0.46 V。
図3：。メディエーターミックスを構成する別のレドックスメディエーターのネルンスト曲線は、順序がGIVとして右から左にある専用プロトコルで、表1において。
| 名前 | CAS番号 | SHE VS E '0（V） | wは M（グラム/モル） |
| N、N、N '、N' -テトラメチル-p-フェニphenylendediamine（TMPD）·（HCl）の2 | 637-01-4 | 0.276 | 237.17 |
| 2,6-ジクロロインドフェノール（DCIP）、ナトリウム塩 | 620-45-1 | 0.217 | 290.08 * |
| フェナジンエトサルフェート（PES） | 10510-77-7 | 0.055 | 334.4 |
| メチレンブルー | 122965-43-9 | 0.011 | 319.85 * |
| レゾルフィン、ナトリウム塩 | 34994-50-8 | -0.051 | 235.17 |
| Indigodisulfonate（インジゴカルミン） | 860-22-0 | -0.125 | 466.35 |
| 2-ヒドロキシ-1,4- naphtaquinone | 83-72-7 | -0.145 | 174.15 |
| アントラキノン-2-スルホン酸のNa + H 2 O | 153277-35-1 | -0.225 | 328.28 |
| フェノサフラニン | 81-93-6 | -0.252 | 322.8 |
| サフラニンO | 477-73-6 | -0.280 | 350.84 |
| ニュートラルレッド | 553-24-2 | -0.340 | 288.8 |
| ベンジルビオロ | 1102-19-8 | -0.350 | 409.4 |
| メチルビオロゲン | 1910-42-5 | -0.440 | 257.16 * |
*無水
表1：メディエーターミックスを構成するレドックスメディエーター。
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Discussion
13レドックスメディエーターのシリーズは-0.45からSHEに対して0.3 V（ 表1および図3）の範囲内の溶液中での酸化還元平衡を可能にする。さて上およびこれらの電位以下のすべてのメディエーターは、どちらか完全に還元または完全に酸化、したがって、タンパク質の酸化還元活性中心との更なる平衡化が発生しないことができている。時々還元滴定は、狭い範囲11を測定することができるように、2つまたは3つのメディエーターを用いて実施された文献のように、これは重要な概念である。酸化還元補因子が年頃 ±メディエーターの中点電位の50 mVの範囲内の中間電位を持っている場合このような酸化還元滴定は唯一の信頼できる結果が得られます。別のメディエーターの中点電位の温度依存性が決定されており、それは、酸化還元滴定は、80°Cの高温で行うことができることが示された。乳首の12蒸発を飼料溶液は、ほとんどのタンパク質を含有する溶液と互換性のあるヌジョール鉱油の層を追加することによって防止することができる。
ソリューションおよび滴定容器の嫌気性は非常に重要です。滴定は、好ましくは嫌気性グローブボックス内で実行する必要があります。しかし、アルゴンガス供給源に接続された密封滴定容器を使用することが可能である。 EPR管は、ゴムチューブの小片を用いてアルゴン/真空マニホールドに接続することができる。滴定試料を13 cmの長さの針を気密シリンジを用いて、ゴムチューブを介して、チューブ内に注入することができる。
タンパク質は好気的条件下で沈殿するようNar1の嫌気性の滴定中に非常に重要であった（図示せず）。沈殿は滴定中発生していない。
EPRは、両方のアプローチは、中点経口決定するために用いることができるが、酸化還元滴定は、直接電気化学（ボルタンメトリー）に相補的に監視補因子の。電位。最初のものは、そのEPR検出可能なレドックス状態における補因子（単数または複数）の同定および定量を提供しています。後者は、電子移動速度に関する情報を提供し、タンパク質の少量を必要とする。多くの場合、直接の電気化学的なアプローチのために必要とされるように酸化還元滴定のためのタンパク質試料は、表面に特殊な前処理または固定化を必要としません。
直接的な電気化学は、特定の場合において成功して、最適な条件を見つけるために集中的な実験を必要としている。 EPRは、酸化還元滴定にかかわらず、酵素システムの複雑さ、酸化還元補因子を特徴づけるために、比較的簡単なアプローチを提供監視した。この技術は、複数の補因子を有する大きなタンパク質複合体の特徴付けが不可欠である。構造情報及び酵素反応速度の特徴と組み合わせて、触媒機構は、非常に詳細に研究することができる。
jove_content ">本研究では、S。セレビシエ Nar1pの補因子を特徴づけた鉄の補因子の3種類が発見された：単核鉄、[3FE-4S]クラスターと[4FE-4S]クラスター[3FEの量-4S]クラスターは、タンパク質濃度のわずか5％であったと思わ[4FE-4S]クラスターの酸化分解生成物を表している。単核鉄および[4FE-4S]クラスターの両方は、化学量論的量で存在していた。中間電位[4FE-4S]クラスターは、クラスターの生理学的な酸化状態であること2+、それがクラスタが酸化還元機能を有する可能性は低いことを示し、非常に低い。単核鉄しかしながら、中間の中間電位を有するおそらく生理的条件下で酸化還元変化を受ける。酸化還元酵素の生体触媒のアプリケーションは、再生可能資源からのより持続可能な合成経路の要求に応じて浮上している。レドックスpの特徴付けこれらの酵素のropertiesは、これらの酵素のメカニズムおよび触媒スコープを理解することが重要です。例えば、ラッカーゼのT1銅中心の中点電位は、これらの酵素の重要な特徴であると考えられる。ラッカーゼの触媒効率は、T1銅中心と基板13の中点電位の差、すなわち 、電子移動の熱力学的駆動力に直接依存することが示されている。レドックス滴定は、酵素やタンパク質の異なる酸化還元活性補因子の中点電位を得ることは非常に堅牢な方法を提供します。技術は、比較的一般的にタンパク質の数mgを必要とする、タンパク質の点で要求しているが、それは非常に高い成功する。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もない。
Acknowledgments
この作品は、財政的に化学設計（NRSC-触媒反応）によって制御オランダの国立研究学校コンビネーション、触媒反応から研究助成金によってサポートされていました。ライデン大学から博士HY Steensma博士とGPHバンフースデンは、Sの組換え発現との支援のために認められている出芽酵母 Nar1。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reference electrode (Ag/AgCl) | Radiometer | ||
| Chemicals | Sigma-Aldrich | ||
| EPR spectrometer | Bruker | ||
| N,N,N’,N’-tetramethyl-p-phenylendediamine (TMPD) · (HCl)2 | 637-01-4 | ||
| 2,6-dichlorophenol indophenol (DCIP), sodium salt | 620-45-1 | ||
| Phenazine ethosulfate (PES) | 10510-77-7 | ||
| Methylene blue | 122965-43-9 | ||
| Resorufin, sodium salt | 34994-50-8 | ||
| Indigodisulfonate (indigo carmine) | 860-22-0 | ||
| 2-hydroxy-1,4-naphtaquinone | 83-72-7 | ||
| Anthraquinone-2-sulfonate Na+ H2O | 153277-35-1 | ||
| Phenosafranin | 81-93-6 | ||
| Safranin O | 477-73-6 | ||
| Neutral red | 553-24-2 | ||
| Benzyl viologen | 1102-19-8 | ||
| Methyl viologen | 1910-42-5 |
References
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