Abstract
Elektronspinresonans (EPR) overvåget redox-titreringer er en kraftfuld metode til at bestemme midtpunktet potentiale cofaktorer i proteiner, og at identificere og kvantificere de cofaktorer i deres påviselig redoxtilstand.
Teknikken supplerer direkte elektrokemi (voltammetri) nærmer, da det ikke giver oplysninger om elektron overførselshastigheder, men fastslå identiteten og redox tilstand cofaktorer i proteinet under studiet. Teknikken er bredt anvendelig til et hvilket som helst protein, der indeholder en elektron paramagnetisk resonans (EPR) påviselig cofaktor.
En typisk titrering kræver 2 ml protein med en cofaktor koncentration i området på 1-100 uM. Proteinet titreres med en kemisk reduktionsmiddel (natriumdithionit) eller oxidant (kaliumferricyanid) for at poise prøven på et bestemt potentiale. En platin tråd og en Ag / AgCl referenceelektrode er forbundet til en voltmeter til at måle potentialet af proteinopløsningen. Et sæt af 13 forskellige redoxmediatorer anvendes til at ækvilibrere mellem redox cofaktorer af proteinet og elektroderne. Prøver er tegnet på forskellige potentialer og Elektronspinresonans spektre, karakteristiske for de forskellige redox cofaktorer i proteinet, måles. Plottet af signalintensiteten versus potentielle prøven analyseres ved hjælp af Nernst ligning for at bestemme midtpunktet potentiale cofaktor.
Introduction
Det er påfaldende, at de mest grundlæggende kemiske processer opretholde liv på denne planet, fotosyntese, kvælstof fiksering og respiration, katalyseres af store proteinkomplekser indeholdende en lang række organiske og uorganiske redox cofaktorer. Det er blevet anslået, at ca. 30% af alle proteiner indeholder en eller flere metal cofaktorer. 1,2 identificere og karakterisere redox cofaktorer kan etableres ved hjælp af direkte elektrokemi (f.eks protein film voltammetri) eller redox-titreringer. De to teknikker er komplementære i deres natur og anvendelighed. Voltammetri tilbyder hurtig bestemmelse af midtpunktet potentialer og elektronoverførselsdele kinetik cofaktorer, som kan reagere med en elektrode overflade. 3,4 Normalt fungerer godt for elektron transfer proteiner, såsom cytochrom c eller ferredoxin. Og undertiden virker for mere komplekse proteiner, der er blevet immobiliseret til en elektrode overflade. Detaljeret viden omart cofaktorer i proteinet skal være til rådighed, da voltammogram ikke vil give nogen direkte information om identiteten af cofaktor. Redox titreringer er mere besværligt at udføre og kræver mg mængder af protein. Men de tilbyder information om midtpunktet potentiale og identitet cofaktor. 5 endvidere i en enkelt titrering flere cofaktorer i et protein kan overvåges.
Princippet om en redox titrering er, at redox aktive protein eller enzym kemisk reduceres eller oxideres. For at sikre, at de cofaktorer reagerer med reducerende eller oxiderende redoxmediatorer anvendes. Disse redoxmediatorer også reagere med en elektrode, så der kan måles potentialet af opløsningen. De mediatorer fungere som en redox buffer og ækvilibrere mellem cofaktorer i proteinet og elektroden. Efter kemisk poising potentiale til den ønskede værdi, en prøve tegnet og hurtigt nedfrosset i flydende nitrogen i AWAIT yderligere analyse med spektroskopiske teknikker. EPR spektroskopi er særligt nyttige i denne henseende, da den kan anvendes til kvantitativ måling af paramagnetiske metal centre eller organiske radikaler.
Den redox titrering kan udføres i to retninger: fra lav til høj eller fra høj til lav midtpunktet potentiale. Valget afhænger af stabiliteten af cofaktorer under undersøgelsen. Er ofte det klogt at starte på lav potentiale og tilføje oxidant til trinvist øge mulighederne. Dette kaldes en oxidativ titrering og er beskrevet her. Her viser vi redox titrering af jern-svovl klynge indeholdende protein Nar1 fra Saccharomyces cerevisiae. Dette protein er involveret, sandsynligvis som et stillads protein, i cytosoliske jern-svovl klynge biosyntetiske maskiner (CIA-vejen). 6,7
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af Setup og løsninger
- Forbered pufferopløsning indeholdende 100 mM Tris, 250 mM NaCI og 10% glycerol ved pH 8,5. Aflufte buffer ved skylning med argon. Indfør bufferen i et anaerobt kammer.
- Opdel bufferen i to portioner. Til den ene portion (buffer A) tilsættes 1 mM DL-dithiothreitol (DTT, M r 154,25 g / mol) og 1 mM L-cystein. Den anden del (buffer B) ikke indeholder reduktionsmidler.
- Forbered oxidant og reduktionsmiddel løsninger. Lav 1 ml opløsninger af 2, 20 og 200 mM kaliumferricyanid (FIC, M r 329,26 g / mol) og natriumdithionit (SD, M r 174,11 g / mol) i anaerob buffer B.
- Forbered mediator mix som følger:
- Tilføj 160 uM af hver af de følgende redoxmediatorer og 50 mM NaCI til buffer B: N, N, N ', N' -tetramethyl-p-phenylendediamine (TMPD, M r 237,17 g / mol, E '0 0,276 V) , 2,6-dichlorphenol indophenol(DCIP, M r 290,08 g / mol, E '0 0,217 V), phenazinethosulfat (PES, M r 334,4 g / mol, E' 0 0,055 V) methylen blå (Mr 319,85 g / mol, E ' 0 0,011 V), Resorufin (Mr 235,17 g / mol, E '0 -0,051 V), Indigodisulphonate (Mr 466,35 g / mol, E' 0 -0,125 V), 2-hydroxy-1,4-naphtaquinone ( Mr 174,15 g / mol, E '0 -0,145 V), anthraquinon-2-sulfonat (Mr 328,28 g / mol, E' 0 -0,225 V), Phenosafranin (M r 322,8 g / mol, E '0 -0,252 V), Safranin O (M r 350,84 g / mol, E '0 -0,280 V), neutral rød (M r 288,8 g / mol, E' 0 -0,340 V), benzyl viologen (M r 409,4 g / mol, E '0 -0,350 V), og methylviologen (Mr 257,16 g / mol, E' 0 -0,440 V).
- Wrap flasken i aluminiumfolie for at beskytte mæglerens fra lys.
- Forbered 10 mg / ml S. cerevisiae strep-mærkede Nar1 protein (181 uM, M r 55,2 kDa) i buffer A. Express S. cerevisiae Nar1 i E. coli som et Strep-mærket protein ved hjælp af en pET24a ekspressionsvektor. Oprens protein i et anaerobt kammer ved hjælp Strep-Tactin kromatografimedier (IBA) og oprense ved hjælp af en proteinoprensning, såsom Akta purifier (GE Healthcare).
- Forbered redox titrering setup i et anaerobt kammer som følger:
- Tilslut en Ag / AgCl referenceelektrode og en platintråd elektrode til titrering fartøj. Tilslut begge elektroder til et voltmeter, der kan måle fra mV til V.
- Indsæt en lille omrøring bar.
- Placer titrering fartøjet over en magnetomrører.
- Fyld titrering fartøj med puffer B, mediator mix opløsning og protein opløsning op til 2 ml, dvs. til slutkoncentrationer på 72 uM protein og 38 uM af hvertmægler. Bemærk: afhængig af koncentrationen protein og det krævede mediator koncentrationer af størrelsen af de tre løsninger bør justeres.
- Omrør i 30 minutter, og tænd for voltmeter.
- Forbered 10 ren kvarts glas EPR rør. Indførelse rørene i den anaerobe kammer.
- Fyld en lille (ca. 200 ml) flydende nitrogen dewar med flydende nitrogen.
2. Udfør Redox Titrering
- Vent potentialet af opløsningen er stabil. Bemærk: I praksis betyder det, at potentialet driver mindre end 1 mV per minut.
- Notér det potentiale givet ved voltmeter.
- Tegn den første prøve på 200 pi og tilføre en EPR rør.
- Cap røret med en gummiprop og tag røret fra den anaerobe kammer.
- Frys røret i flydende nitrogen som følger: Advarsel! Dette skal ske langsomt, ellers røret vil bryde.
- Sæt først tip af røret i flydende nitrogen.
- Vent en hvislende lyd kan høres. Bemærk: Det kan tage op til 10 sek.
- Sæt langsomt resten af røret, således at prøven del er fuldt neddykket.
- Tilføj en lille portion 1-2 pi 2 mM SD opløsning til opløsningen i titreringen fartøj at sænke potentialet af opløsningen til -0.6 V.
Bemærk: Hvis mere end 10 pi tilføjes, skifte til 20 mM opløsning. Da det er meget vanskeligt at poise til en bestemt potentiel værdi, de faktiske værdier for voltmeteret nedskrevet og anvendt til at konstruere titreringskurven. - Tegn en prøve som beskrevet i trin 2,3-2,5.
- Notér det faktiske potentiale givet ved voltmeter.
- Tilføj oxidant indtil potentialet er steget med cirka 50 mV. Start ved tilsætning af en lille portion 1-2 pi 2 mM FIC opløsning. Hvis mere end 10 pi tilføjes, skifte til 20 mM opløsning.
- Notér how meget af løsningerne er blevet tilføjet. Bemærk: Dette er nødvendigt at korrigere for prøve fortynding under titreringen.
- Tegn en prøve som beskrevet i trin 2,3-2,5.
- Notér det faktiske potentiale givet ved voltmeter.
- Gentag trin 2.9 og 2.12 indtil den potentielle området fra -0,6 V til 0,2 V er blevet dækket, og alle 10 EPJ rør er fyldt med hver 200 pi.
Bemærk: Som volumen med hver tilbagetrækning reduceres positioneringen af elektroderne kan være nødvendigt at justere har god kontakt med opløsningen uden indblanding af omrøring. Det kan være vanskeligt at måle potentialet efter fjernelse af den sidste prøve, og derfor potentialet af denne prøve kan være mindre nøjagtige. - Eventuelt opbevare de frosne EPJ prøver i flydende nitrogen, indtil EPJ målingerne kan finde sted.
3. Mål Titrering Prøver Brug EPR spektroskopi og dataanalyse
- Record EPR spektre af de forskelligetitrering prøver som følger:
- Brug en høj vakuumpumpe til at evakuere et kvarts kryostat til <10 -5 bar.
- Tænd for vandkøling af EPR magnet. Åbn strømmen af tør luft gennem EPR hulrum.
- Tænd for strømmen til magneten og computeren i EPJ.
- Kør en frekvens kalibrering program. Indstil EPR måleparametre. Slut kryostat til flydende helium dewar-karret. Afkøl hulrum til 9-16 K.
- Indføre EPR prøven i hulrummet. Optag EPR spektrum.
- Identificere de forskellige EPJ arter og bruge den bedste spektre at kvantificere signaler. Opnå EPR kvantificering ved dobbelt integration af spektrene og sammenligning med spektret af en ekstern kobber standardopløsning 10 mM CuSO 10/04 mM HCl / 2 M NaCIO 4. 8
- Gør titreringskurven som følger:
- Plot EPR signal amplitude ved en g-værdi, der er karakteristisk for paramagnetiske stof af interesse mod den potentielle.
- Skift EPR signal amplitude skala til en spin / molekyle skala ved hjælp af EPR kvantificering fra trin 3.2.
- Ret signal amplituden af hver prøve for fortynding, der er opstået på grund af tilsætninger af oxiderende eller reducerende middel.
- Ret potentialet for midtpunktet potentiale Ag / AgCl referenceelektrode.
Bemærk: Ag / AgCl referenceelektrode (med mættet KCl) har et midtpunkt potentiale 0,194 V versus Standard hydrogenelektrode (SHE) ved 25 ° C. Derfor, hvis potentialet på voltmeteret læser circa -0.6 V, potentiale med henvisning til hun -0.4 V.
- Monter signal til Nernst ligning:
For en art, der er paramagnetiske i reduceret tilstand:
For en art, der er paramagnetisk i oxidized tilstand:
For en art, der er paramagnetisk i en mellemliggende tilstand:
Disse ligninger er gældende for redoxreaktioner, hvor en elektron overføres, så n = 1.
E = potentiale i Volt
E m = midtpunkt potentiale i volt
F = Faraday konstant = 96480 C · mol -1
R = gaskonstant = 8,314 J · K -1 · mol -1
T = temperatur i Kelvin
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den redox titrering af jern-svovl klynge indeholdende protein Nar1 fra Saccharomyces cerevisiae resulterede i identifikationen af tre forskellige cofaktorer: Nar1: a [3fe-4S] klynge, en [4Fe-4S] klynge og en mononukleær Fe center (figur 1) . De EPR signaler er karakteriseret ved deres g-værdier: for [3fe-4S] + g z 2,01, g crossover 2,00 (figur 1B); for [4Fe-4S] +, g z 2,02 g y 1,93 g x 1,82 (figur C), og for mononukleære Fe 3+ g 4,3 og 9,7 (figur 1A). EPR signal i [4Fe-4S] + klynge er meget lig, hvad der er blevet rapporteret for Nar1 tidligere. 6,9 EPR signalet fra den mononukleære jern er karakteristisk for en rombiske high spin ferri arter (figur 1A).
Kvantificering af EPJ signaler viste, at de [4Fe-4S]klynge og mononukleare Fe er ækvimolær til ca. 60% af proteinkoncentrationen, og at [3fe-4S] klynge indhold er kun 5% (figur 1). Den [3fe-4S] klynge er mest sandsynligt et nedbrydningsprodukt og ufuldstændig klynge. Den [3fe-4S] klynge signal forsvandt over 0,05 V, muligvis på grund af oxidativ nedbrydning.
Følgende midtpunkt potentialer blev bestemt for de forskellige cofaktorer:
0,003 V for Fe 3+ / Fe 2+ par af mononukleære Fe centrum (figur 2A), -0,125 V for de [3fe-4S] + / [3fe-4S] 0 par (figur 2B) og mellem -0,45 og -0,50 V for de [4Fe-4S] 2+ / [4Fe-4S] + par (figur 2C). På grund af den lave værdi af [4Fe-4S] klynge ingen præcise midtpunkt potentiale kunne bestemmes. Den lave potentiale [4Fe-4S] klynge indikerer, at det ikke har en redox rolle iprotein, da det vil være meget vanskeligt at reducere klyngen. Den mononukleare jern center kan reduceres eller oxideres i cytoplasmaet. En redox rolle dette center er derfor muligt.
Uafhængig jern bestemmelse på det oprensede Nar1 protein blev udført under anvendelse af ferene metoden. 10 Dette gav 3,2 Fe / molekyle. Den mononukleare Fe signal repræsenterer 0,6 Fe pr molekyle og [3fe-4S] klynge er kun 0,05 pr molekyle. Dette efterlader 2,45 Fe / molekyle og derfor 0,61 [4Fe-4S] klynge per proteinmolekyle. Kvantificeringen af EPR signal i [4Fe-4S] + klynge på -0.45V resulterede i 0,26 spins / molekyle. Så kun 42% af [4Fe-4S] klynge kunne reduceres ved -0,45 V. På grundlag af disse kvantificeringer et midtpunkt potentiale [4Fe-4S] 2+ / [4Fe-4S] + par -0,46 V bestemtes .
Figur 1: EPR spektre af forskellige cofaktorer af Nar1. (A) mononukleære højt spin jern S = 2/5 signal om Nar1 klar på 0,031 V. EPJ betingelser: mikrobølge frekvens, 9,386 GHz; mikrobølgeeffekt, 20 dB; modulationsfrekvens, 100 kHz; modulationsamplitude, 12,5 g; temperatur, 16 K. (B) [3fe-4S] + klynge S = 1/2-signalet af Nar1 klar på -0,004 V. EPJ betingelser: mikrobølge frekvens, 9,386 GHz; mikrobølgeeffekt, 16 dB; modulationsfrekvens, 100 kHz; modulationsamplitude, 12,5 g; temperatur, 9,5 K. (C) [4Fe-4S] + klynge S = 1/2-signalet af Nar1 klar på -0,45 V. EPJ betingelser: mikrobølge frekvens, 9,385 GHz; mikrobølgeeffekt, 16 dB; modulationsfrekvens, 100 kHz; modulationsamplitude, 12,5 g; temperatur, 9,2 K. Nedenfor -0,25 V en skarp S = 1/2-signalet (*) optrådte, hvilket skyldes kationen radikale arter af methylviologen og benzyl viologen.
"Src =" / files / ftp_upload / 51611 / 51611fig2highres.jpg "/>
Figur 2: Redox titrering af de cofaktorer af Nar1. (A) titreringskurve af mononukleære højt spin jern signal overvåges g = 4,3;. (B) titreringskurve af [3fe-4S] + signal overvåges g = 2,01 (C) titreringskurve af [4Fe-4S] + signal overvåges ved g = 1,82. De fuldt optrukne linier er passer til n = 1 redox overgange med midtpunkt potentialer 0,003 V til Fe 3+ / Fe 2+ par af mononukleære Fe centrum, -0,125 V for de [3fe-4S] + / [3fe-4S ] 0 par -0,46 V for [4Fe-4S] 2+ / [4Fe-4S] + par.
Figur 3:. Nernst kurver for de forskellige redoxmediatorer der udgør mediator mix Ordren er fra højre mod venstre som givDA i protokollen og i tabel 1.
| Navn | Cas nummer | E '0 (V) vs HUN | Mw (g / mol) |
| N, N, N ', N' -tetramethyl-p-phenylendediamine (TMPD) · (HCl) 2 | 637-01-4 | 0,276 | 237,17 |
| 2,6-dichlorphenol indophenol (DCIP), natriumsalt | 620-45-1 | 0,217 | 290,08 * |
| Phenazin ethosulfat (PES) | 10510-77-7 | 0,055 | 334,4 |
| Methylenblåt | 122965-43-9 | 0,011 | 319,85 * |
| Resorufin, natriumsalt | 34994-50-8 | -0,051 | 235,17 |
| Indigodisulfonate (indigo karminrød) | 860-22-0 | -0,125 | 466,35 |
| 2-hydroxy-1,4-naphtaquinone | 83-72-7 | -0,145 | 174,15 |
| Anthraquinon-2-sulfonat Na + H 2 O | 153277-35-1 | -0,225 | 328,28 |
| Phenosafranin | 81-93-6 | -0,252 | 322,8 |
| Safranin O | 477-73-6 | -0,280 | 350,84 |
| Neutral rød | 553-24-2 | -0,340 | 288,8 |
| Benzyl viologen | 1102-19-8 | -0,350 | 409,4 |
| Methylviologen | 1910-42-5 | -0,440 | 257,16 * |
* Vandfri
Tabel 1: redoxmediatorer der udgør mægleren mix.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Rækken af 13 redoxmediatorer tillader en redox ligevægt i opløsningen i intervallet fra -0,45 til +0,3 V versus SHE (tabel 1 og figur 3). Godt over og under disse potentialer alle mediatorer enten fuldstændigt reduceret eller helt oxideret og derfor ikke yderligere ligevægt med redox aktive centre af proteinet kan forekomme. Dette er et vigtigt begreb, som i litteraturen undertiden redox titreringer udføres med kun to eller tre mediatorer, så kun et snævert interval, der skal måles 11. Sådanne redox-titreringer vil kun give pålidelige resultater, hvis redox cofaktor har et midtpunkt potentiale inden for et interval på ca. ± 50 mV af midtpunktet potentiale mediatorer. Temperaturafhængighed midtpunktet potentialer for de forskellige mediatorer er blevet bestemt, og det blev vist, at redox-titreringer kan udføres ved temperaturer så høje som 80 ° C. 12 Fordampning af TITration opløsning kan forhindres ved tilsætning af et lag af Nujol mineralolie, som er kompatibel med de fleste proteinholdige opløsninger.
Den anaerobicity af løsninger og titreringen fartøj er meget vigtigt. Titreringen bør gennemføres i en anaerob handskerummet. Det er imidlertid muligt at anvende en tætnet titrering beholder forbundet til et argongas forsyning. EPR rør kan være forbundet til en argon / vakuum manifold ved hjælp af små stykker af gummi slange. Titreringsdataene prøver kan injiceres ind i rørene via gummislanger ved hjælp af gastætte sprøjter med 13 cm lange nåle.
Under titrering af Nar1 anaerobicity var meget vigtig, da proteinet præcipiterer under aerobe betingelser (ikke vist). Ingen nedbør opstod under titreringen.
EPR overvåget redox-titreringer er komplementære til direkte elektrokemi (voltammetri), selv om begge metoder kan anvendes til at bestemme midtpunktet po tentials af cofaktorer. Den første giver identifikation og kvantificering af cofaktor (er) i deres EPJ påviselig redoxtilstand. Sidstnævnte indeholder oplysninger om elektronoverførselsdele kinetik og kræver mindre mængder af protein. De proteinprøver for redox-titreringer kræver ikke særlige forbehandlinger eller immobilisering på en overflade, som ofte kræves for direkte elektrokemiske metoder.
Direkte elektrokemi har kun været en succes i særlige tilfælde og kræver intensiv eksperimenter for at finde optimale betingelser. EPJ overvåget redox-titreringer tilbyde en forholdsvis enkel metode til at karakterisere redox cofaktorer, uanset kompleksiteten af enzymsystem. Denne teknik er uundværlig i karakteriseringen af store proteinkomplekser med flere cofaktorer. I kombination med strukturel information og karakterisering af enzymkinetik, kan den katalytiske mekanisme studeres i stor detalje.
jove_content "> I denne undersøgelse cofaktorerne af S. cerevisiae Nar1p blev karakteriseret Tre forskellige typer jern cofaktorer blev fundet:.. mononuklear jern, en [3fe-4S] klynge og en [4Fe-4S] klynge Mængden af [3fe -4S] klynge var kun 5% af proteinkoncentrationen og sandsynligvis repræsenterer en oxidativ nedbrydningsprodukt af [4Fe-4S] klynge. Både mononukleære jern og [4Fe-4S] klynge var til stede i støkiometriske mængder. Midtpunktet potentiale den [4Fe-4S] klynge er meget lav, hvilket indikerer, at den fysiologiske oxidationstrin af klyngen er 2+, og at det ikke er sandsynligt, at klynge har en redox funktion. Den mononukleare jern, har imidlertid en mellemliggende midtpunktet potentiale og eventuelt undergår en redox forandringer under fysiologiske betingelser.Biokatalytiske anvendelser af redoxenzymer dukker som svar på krav om mere bæredygtige syntetiske ruter fra vedvarende energikilder. Karakterisering af redox properties af disse enzymer er vigtigt at forstå mekanismen og katalytisk anvendelsesområdet for disse enzymer. For eksempel er midtpunktet potentiale T1 kobber centrum af laccase anses for at være en vigtig egenskab ved disse enzymer. Den katalytiske effektivitet af laccaser har vist sig at være direkte afhængig af den termodynamiske drivkraft af elektronoverførsel, dvs. forskellen i midtpunktet potentiale T1 kobber center og substratet 13. Redox titreringer tilbyde en meget robust måde at få midtpunktet potentialer forskellige redoxaktive cofaktorer i enzymer og proteiner. Teknikken er relativt krævende med hensyn til protein, generelt kræver et par mg protein, men det vil sandsynligvis blive en succes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en forskningsbevilling fra det hollandske Forskerskolen kombination, Katalyse Kontrolleres af Chemical Design (NRSC-katalyse). Dr. HY Steensma og Dr. GPH van Heusden fra Leiden University er anerkendt for deres støtte med rekombinant ekspression af S. cerevisiae Nar1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reference electrode (Ag/AgCl) | Radiometer | ||
| Chemicals | Sigma-Aldrich | ||
| EPR spectrometer | Bruker | ||
| N,N,N’,N’-tetramethyl-p-phenylendediamine (TMPD) · (HCl)2 | 637-01-4 | ||
| 2,6-dichlorophenol indophenol (DCIP), sodium salt | 620-45-1 | ||
| Phenazine ethosulfate (PES) | 10510-77-7 | ||
| Methylene blue | 122965-43-9 | ||
| Resorufin, sodium salt | 34994-50-8 | ||
| Indigodisulfonate (indigo carmine) | 860-22-0 | ||
| 2-hydroxy-1,4-naphtaquinone | 83-72-7 | ||
| Anthraquinone-2-sulfonate Na+ H2O | 153277-35-1 | ||
| Phenosafranin | 81-93-6 | ||
| Safranin O | 477-73-6 | ||
| Neutral red | 553-24-2 | ||
| Benzyl viologen | 1102-19-8 | ||
| Methyl viologen | 1910-42-5 |
References
- Lippard, S. J., Berg, J. M. Principles of Bioinorganic Chemistry. , University Science Books. (1994).
- Bertini, I. Bioinorganic Chemistry. , University Science Books. 611 (1994).
- Leger, C., et al. Enzyme Electrokinetics: Using Protein Film Voltammetry To Investigate Redox Enzymes and Their Mechanisms. Biochemistry. 42, 8653-8662 (2003).
- Hagen, W. R. Direct Electron Transfer of Redox Proteins at the Bare Glassy Carbon Electrode. Eur. J. Biochem. 182, 523-530 (1989).
- Pierik, A. J., et al. Redox Properties of the Iron-Sulfur Clusters in Activated Fe-Hydrogenase from Desulfovibrio vulgaris (Hildenborough). Eur. J. Biochem. 209, 63-72 (1992).
- Balk, J., Pierik, A. J., Netz, D. J., Muhlenhoff, U., Lill, R. The Hydrogenase-like Nar1p is Essential for Maturation of Cytosolic and Nuclear Iron-Sulphur Proteins. EMBO J. 23, 2105-2115 (2004).
- Sharma, A. K., Pallesen, L. J., Spang, R. J., Walden, W. E. Cytosolic Iron-Sulfur Cluster Assembly (CIA) System: Factors, Mechanism, and Relevance to Cellular Iron Regulation. J. Biol. Chem. 285, 26745-26751 (2010).
- Aasa, R., Vänngård, T. EPR Signal Intensity and Powder Shapes. A Reexamination. J. Magn. Reson. 19, 308-315 (1975).
- Balk, J., Pierik, A. J. A., Netz,, J, D., Mühlenhoff, U., Lill, R. Nar1p, a conserved eukaryotic protein with similarity to Fe-only hydrogenases, functions in cytosolic iron-sulphur protein biogenesis. Biochem. Soc. Trans. 33, 86-89 (2005).
- Hennessy, D. J., Reid, G. R., Smith, F. E., Thompson, S. L. Ferene - a new spectrophotometric reagent for iron. Can. J. Chem. 62, 721-724 (1984).
- Flint, D. H., Emptage, M. H., Guest, J. R. Fumarase A from Escherichia coli: purification and characterization as an iron-sulfur cluster containing enzyme. Biochemistry. 31, 10331-10337 (1992).
- Hagedoorn, P. L., Driessen, M. C., Mvd Bosch,, Landa, I., Hagen, W. R. Hyperthermophilic Redox Chemistry: a Re-evaluation. FEBS Lett. 440, 311-314 (1998).
- Tadesse, M. A., D'Annibale, A., Galli, C., Gentili, P., Sergi, F. An assessment of the relative contributions of redox and steric issues to laccase specificity towards putative substrates. Organic & biomolecular chemistry. 6, 868-878 (2008).
