Abstract
Electron Para resonans (EPR) overvåket redokstitreringer er en kraftig metode for å bestemme midtpunktet potensialet av kofaktorer i proteiner og å identifisere og kvantifisere kofaktorer i deres påvisbare Redox tilstand.
Teknikken er komplementær til direkte elektrokjemi (voltammetry) tilnærminger, som det ikke tilbyr informasjon om elektron overføringshastigheter, men ikke fastslå identiteten og Redox tilstand av kofaktorer i proteinet som studeres. Teknikken er allment gjeldende for noen protein inneholder et elektron paramagnetisk resonans (EPR) påvisbare kofaktor.
En typisk titrering krever 2 ml protein med en cofaktor-konsentrasjon i området fra 1 til 100 pM. Proteinet blir titrert med et kjemisk reduksjonsmiddel (natriumditionitt) eller oksydasjonsmiddel (kaliumferricyanid) for å likevekt prøven på et visst potensial. En platinatråd og en Ag / AgCl referanse-elektrode er forbundet til en voltmeter for å måle potensialet i proteinoppløsningen. Et sett av 13 forskjellige redox-mediatorer blir brukt til å stabilisere seg mellom de redoks-kofaktorer av proteinet og elektrodene. Prøver blir tatt ved forskjellige potensialer og elektronParaMagnetiske resonansspektra, karakteristiske for de forskjellige redoks kofaktorer i proteinet, blir målt. Plottet av signalintensiteten i forhold til prøvepotensialet blir analysert ved hjelp av Nernst-ligningen for å bestemme midtpunktet potensialet av kofaktor.
Introduction
Det er påfallende at de mest grunnleggende kjemiske prosesser opprettholde livet på denne planeten, fotosyntese, nitrogenfiksering og respirasjon, katalyseres av store protein komplekser som inneholder et bredt spekter av organiske og uorganiske redoks kofaktorer. Det har blitt anslått at om lag 30% av alle proteiner inneholder en eller flere metall kofaktorer. 1,2 Identifisering og karakterisering av redoks kofaktorer kan etableres ved hjelp av direkte elektrokjemi (f.eks protein film voltammetry) eller redokstitreringer. De to teknikkene er komplementært i sin natur og anvendelse. Voltammetri tilbyr rask bestemmelse av midtpunkts potensialer og elektronoverføring kinetikken for kofaktorer som kan reagere med en elektrodeflate. 3,4 Vanligvis denne fungerer godt for elektronoverføring proteiner, så som cytokrom c eller ferredoxin. Og det noen ganger virker for mer komplekse proteiner som er immobilisert til en elektrodeflate. Detaljert kunnskap omnatur kofaktorer i proteinet må være tilgjengelig, som voltammogram ikke vil gi noen direkte informasjon om identiteten til kofaktor. Redoks-titreringer er mer arbeidskrevende å utføre og krever mg mengder av protein. Imidlertid, de tilbyr informasjon om midtpunktet potensial og identiteten til kofaktor. 5 Videre er i en enkelt titrering flere kofaktorer i et protein kan overvåkes.
Prinsippet med et redoks-titrering, er at redoks-aktive protein eller enzym som er kjemisk redusert eller oksidert. For å sørge for at kofaktorer reagerer med reduksjons eller oxidant redoks meklere brukes. Disse redoks mediatorer også reagere med en elektrode, slik at potensialet av løsningen kan måles. Mediatorer fungere som en redox-buffer, og i likevekt mellom de kofaktorer i proteinet og elektroden. Etter kjemisk poising potensialet til den ønskede verdi, blir en prøve trukket og raskt frosset i flytende nitrogen for å await videre analyse med spektroskopiske teknikker. EPR-spektroskopi er spesielt nyttige i dette henseende ettersom den kan brukes til å måle kvantitativt paramagnetiske metallsentre eller organiske radikaler.
Den Redokstitrering kan utføres i to retninger: fra lav til høy eller fra høy til lav midtpunktet potensial. Valget er avhengig av stabiliteten av de kofaktorer som studeres. Ofte er det lurt å starte på lavt potensial og legge oksidasjonsmiddel for trinnvis øke potensialet. Dette kalles en oksydativ titrering og er beskrevet her. Her viser vi Redokstitrering av jern-svovel klynge som inneholder protein Nar1 fra Saccharomyces cerevisiae. Dette protein er involvert, sannsynligvis som et stillas protein, i det cytosoliske jern-svovel klynge biosyntetiske maskiner (CIA reaksjonsveien). 6,7
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av oppsett og løsninger
- Forbered bufferløsning inneholdende 100 mM Tris, 250 mM NaCl og 10% glycerol ved pH 8,5. Avlufte buffer ved spyling med argon. Introduser buffer i en anaerob kammer.
- Fordel buffer i to deler. Til en porsjon (buffer A) tilsett 1 mM DL-ditiotreitol (DTT, M r 154,25 g / mol) og 1 mM L-cystein. Den andre del (buffer B) ikke inneholder reduksjonsmidler.
- Forberede oksiderende og reduksjonsløsninger. Gjør 1 ml oppløsninger av 2, 20 og 200 mM kaliumferricyanid (FIC, M r 329,26 g / mol) og natrium-ditionitt (SD M r 174,11 g / mol) i anaerob buffer B.
- Forbered mekler mix som følger:
- Legg 160 uM av hver av de følgende redoks mediatorer og 50 mM NaCl i buffer B: N, N, N ', N'-tetrametyl-p-phenylendediamine (TMPD, M r 237,17 g / mol, E' 0 0,276 V) 2,6-diklorfenol indofenol(DCIP, M r 290,08 g / mol, E '0 0,217 V), fenazin-etosulfat (PES, M r 334,4 g / mol, E' 0 0,055 V), metylen blått (M r 319,85 g / mol, E ' 0 0,011 V), Resorufin (M r 235,17 g / mol, E '0 -0,051 V), Indigodisulphonate (M r 466,35 g / mol, E' 0 -0,125 V), 2-hydroksy-1,4-naphtaquinone ( M r 174,15 g / mol, E '0 -0,145 V), Antrakinon-2-sulfonat (M r 328,28 g / mol, E' 0 -0,225 V), Phenosafranin (M r 322,8 g / mol, E '0 -0,252 V), safranin O (M r 350,84 g / mol, E '0 -0,280 V), nøytralrødt (M r 288,8 g / mol, E' 0 -0,340 V), benzyl viologen (M r 409,4 g / mol, E '0 -0,350 V), og metyl viologen (M r 257,16 g / mol, E' 0 -0,440 V).
- Pakk flasken i aluminiumsfolie for å beskytte meklers fra lys.
- Forbered 10 mg / ml S. cerevisiae strep-tagged Nar1 protein (181 uM, M r 55.2 kDa) i buffer A. Express S. cerevisiae Nar1 i E. coli som et strep-merket protein ved hjelp av en pET24a ekspresjonsvektor. Rense proteinet i en anaerob kammer ved hjelp av streptokokk-Tactin kromatografi media (IBA) og rense ved hjelp av et protein rensing system som Akta renser (GE Healthcare).
- Forberede Redokstitrering oppsettet i en anaerob kammer som følger:
- Koble en Ag / AgCl-referanseelektrode og en platinatråd-elektrode til titrering fartøyet. Koble begge elektrodene til et voltmeter som kan måle fra mV opp til V.
- Sett inn en liten røring bar.
- Plasser titrering fartøyet over en magnetisk rører.
- Fyll titrering fartøyet med buffer B, mediator blanding løsning og proteinoppløsningen til opp til 2 ml, dvs. til endelige konsentrasjoner på 72 uM protein og 38 uM av hvertmekler. Merk: avhengig av proteinkonsentrasjonen, og den nødvendige mellem konsentrasjoner mengder av de tre oppløsninger bør justeres.
- Rør i 30 min og slå på voltmeter.
- Forbered 10 rene kvarts glass EPJ-rør. Innføre rørene i den anaerobe kammeret.
- Fylle en liten (ca. 200 ml), flytende nitrogen dewar med flytende nitrogen.
2. Utfør Redokstitrering
- Vent til potensialet av løsningen er stabil. Merk: I praksis betyr dette at potensialet svinger mindre enn 1 mV per minutt.
- Notere potensialet gitt av voltmeter.
- Trekke den første prøven på 200 ul og injisere i en EPJ tube.
- Cap røret med en gummipropp og fjerne røret fra anaerob kammer.
- Fryse røret i flytende nitrogen som følger: Forsiktig! Dette må gjøres langsomt, ellers røret vil brekke.
- Først setter du tip av røret i flytende nitrogen.
- Vent til en hvesende lyd kan høres. Merk: Dette kan ta opp til 10 sek.
- Langsomt inn resten av røret, slik at prøven delvis er fullstendig neddykket.
- Tilsett en liten alikvot 1-2 ul av 2 mM SD oppløsning til oppløsningen i titreringen fartøyet for å redusere potensialet av løsningen til -0,6 V.
Merk: Hvis mer enn 10 pl må legges, bytte til 20 mM løsning. Ettersom det er meget vanskelig å poise til et bestemt potensial verdi, er de virkelige verdier er tatt opp på voltmeteret nedskrevet, og brukes til å konstruere titreringskurven. - Trekke en prøve som beskrevet i trinn 2.3 til 2.5.
- Notere selve potensial gitt av voltmeter.
- Legg oksydasjonsmiddel inntil potensialet har økt med ca. 50 mV. Start med å legge en liten porsjon 1-2 mL av 2 mM FIC løsning. Dersom mer enn 10 pl må legges, bytte til 20 mM løsning.
- Notere how mye av løsningene har blitt lagt til. Merk: Dette er nødvendig for å korrigere for prøvefortynningen under titrering.
- Trekke en prøve som beskrevet i trinn 2.3 til 2.5.
- Notere selve potensial gitt av voltmeter.
- Gjenta trinn 2.9 og 2.12 til potensialet varierer fra -0,6 V til 0,2 V har blitt dekket og alle 10 EPJ rørene er fylt hver med 200 mL.
Merk: Når volumet med hvert uttak blir redusert plassering av elektrodene kan være nødvendig å justere som har god kontakt med oppløsningen uten innblanding av omrøring. Det kan være vanskelig å måle potensialet etter tilbaketrekning av den siste prøven, og dermed potensialet for at prøven kan være mindre nøyaktig. - Eventuelt kan oppbevare de frosne EPR prøver i flytende nitrogen inntil de EPR målinger kan finne sted.
3. Mål Titrering Prøver Bruke EPR spektroskopi og dataanalyse
- Record EPR spektrene av forskjelligtitrering prøver som følger:
- Bruk en høy vakuumpumpe for å evakuere en kvarts kryostat til <10 -5 bar.
- Slå på vannkjøling av EPR magnet. Åpne strømmen av tørr luft gjennom EPR hulrom.
- Slå på strømmen til magneten og datamaskinen av EPJ.
- Kjør en frekvens kalibreringsprogram. Still EPJ måleparametere. Koble kryostat til flytende helium dewar. Avkjøl hulrom til 9-16 K.
- Introduser EPJ prøven i hulrommet. Spill EPR-spekteret.
- Identifisere de ulike EPJ-arter og bruke den beste spektra å kvantifisere signaler. Oppnå EPR kvantifisering av dobbelt integrering av spektra og sammenligning med spektret av en ekstern standard kobberløsningen 10 mM CuSO4 / 10 mM HCl / 2 M NaCIO 4. 8
- Gjør titreringskurven som følger:
- Plotte EPR signalamplituden ved en g-verdi som er karakteristisk for den paramagnetiske arter av interesse mot potensialet.
- Endre EPR signal amplitude skala til en spinner / molekyl skala ved hjelp av EPJ kvantifisering fra trinn 3.2.
- Korriger signalamplituden av hver prøve for fortynningen som har oppstått på grunn av tilsetninger av oksyderende eller reduserende middel.
- Korriger potensialet for midtpunktet potensialet av Ag / AgCl referanse-elektrode.
Merk: Ag / AgCl-referanseelektrode (mettet med KCl) har et midtpunkt potensial på 0,194 volt i forhold til den standard hydrogenelektrode (SHE) ved 25 ° C. Derfor, hvis potensialet på voltmeteret viser circa -0,6 V, er potensialet med henvisning til SHE -0,4 V.
- Monter signal til Nernst-ligningen som følger:
For en art som er paramagnetisk i redusert tilstand:
For en art som er paramagnetisk i oxidized tilstand:
For en art som er paramagnetisk i en mellomtilstand:
Disse ligningene er gyldig for redoksreaksjoner i hvilket en elektron blir overført, slik at n = 1.
E = potensial i Volt
E m = midtpunktet potensial i Volt
F = Faradays konstant = 96480 C · mol -1
R = Gas konstant = 8,314 J · K -1 · mol -1
T = Temperatur i Kelvin
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den Redokstitrering av jern-svovel klynge som inneholder protein Nar1 fra Saccharomyces cerevisiae resulterte i identifisering av tre ulike kofaktorer: Nar1: a [3fe-4S] cluster, en [4Fe-4S] klase og en mononukleær Fe sentrum (Figur 1) . EPJ-signaler er preget av sine g-verdier: for [3fe-4S] + g z 2.01, g crossover 2,00 (Figur 1B); for [4Fe-4S] +, z g 2,02 g 1,93 y, g x 1,82 (figur C), og for det mononukleære Fe 3+ g 4,3 og 9,7 (figur 1A). EPR-signalet fra [4Fe-4S] + klynge er svært likt det som er blitt rapportert for Nar1 tidligere. 6,9 EPR-signalet fra den mononukleære jern er karakteristisk for et rombiske høy ring treverdig arter (figur 1A).
Kvantifisering av EPJ-signaler tydet på at de [4Fe-4S]klynge og mononukleære Fe er ekvimolar til omtrent 60% av proteinkonsentrasjonen, og at [3fe-4S] klynge innholdet er bare 5% (figur 1). Den [3fe-4S] klynge er mest sannsynlig et nedbrytningsprodukt og ufullstendig klynge. Den [3fe-4S] klynge signal forsvant over 0,05 V, muligens på grunn av oksidativ degradering.
De følgende midtpunkt-potensialer ble bestemt for de forskjellige kofaktorer:
0,003 V for Fe 3+ / Fe 2+ par av mononukleære Fe sentrum (Figur 2A), -0,125 V for de [3fe-4S] + / [3fe-4S] 0 par (figur 2B) og mellom -0,45 og -0,50 V for de [4Fe-4S] 2+ / [4Fe-4S] + par (Figur 2C). På grunn av den lave verdien på [4Fe-4S] cluster ingen presis midtpunktet potensial kan fastsettes. Den lave potensial [4Fe-4S] klynge indikerer at det ikke har et redoks rolle iprotein som det vil være meget vanskelig å redusere klyngen. Den mononukleær jern sentrum kan bli redusert eller oksidert i cytoplasma. En redoks rolle dette senteret er derfor mulig.
Uavhengig jern bestemmelse av det rensede Nar1 proteinet ble utført ved hjelp av fremgangsmåten 10 ferene. Dette gav 3,2 Fe / molekyl. Den mononukleær Fe signal representerer 0,6 Fe per molekyl, og det [3fe-4S] klynge er bare 0,05 per molekyl. Dette etterlater 2,45 Fe / molekyl, og derfor 0.61 [4Fe-4S] klynge per proteinmolekyl. Kvantifisering av EPR-signalet fra [4Fe-4S] + klynge på -0.45V resulterte i 0,26 spinn / molekyl. Slik at bare 42% av [4Fe-4S] klyngen kan reduseres ved -0,45 V. Basert på disse kvantifiseringene en midtpunktpotensial av [4Fe-4S] 2+ / [4Fe-4S] + par -0,46 V ble bestemt .
Figur 1: EPR spektra av ulike kofaktorer av Nar1. (A) Mononuclear høy spinn treverdig S = 5/2 signal om Nar1 klar på 0,031 V. EPJ betingelser: mikrobølgeovn frekvens, 9,386 GHz; mikrobølgeeffekt, 20 dB; modulasjon frekvens, 100 kHz; modulasjon amplitude, 12,5 g; temperatur, 16 K. (B) [3fe-4S] + klynge S = 1/2 signal om Nar1 klar på -0,004 V. EPJ betingelser: mikrobølgeovn frekvens, 9,386 GHz; mikrobølgeeffekt, 16 dB; modulasjon frekvens, 100 kHz; modulasjon amplitude, 12,5 g; temperatur, 9,5 K. (C) [4Fe-4S] + klynge S = 1/2 signal om Nar1 klar på -0,45 V. EPJ betingelser: mikrobølgeovn frekvens, 9,385 GHz; mikrobølgeeffekt, 16 dB; modulasjon frekvens, 100 kHz; modulasjon amplitude, 12,5 g; temperatur, 9.2 K. Under -0,25 V en skarp S = 1/2 signal (*) først, noe som skyldes kationet radikale arter av metyl viologen og benzyl viologen.
"Src =" / files / ftp_upload / 51611 / 51611fig2highres.jpg "/>
Figur 2: Redokstitrering av kofaktorer i Nar1. (A) Titrering kurve av mononukleær høy spinn treverdig signal overvåkes ved g = 4.3;. (B) Titrering kurve av de [3fe-4S] + signal overvåkes ved g = 2,01 (C) Titrering kurve av de [4Fe-4S] + signal overvåkes ved g = 1.82. De heltrukne linjer er passer for n = 1 redoks overganger Med Midtpunkt potensialer 0,003 V for Fe 3+ / Fe 2+ par av mononukleær Fe sentrum, -0,125 V for de [3fe-4S] + / [3fe-4S ] 0 par -0,46 V for [4Fe-4S] 2+ / [4Fe-4S] + par.
Figur 3:. Nernst kurver av ulike redoks meklere som utgjør mekler mix Ordren er fra høyre til venstre som GIVno i protokollen og i tabell 1.
| Navn | Cas nummer | E '0 (V) vs SHE | M w (g / mol) |
| N, N, N ', N'-tetrametyl-p-phenylendediamine (TMPD) · (HCl) 2- | 637-01-4 | 0,276 | 237,17 |
| 2,6-diklorfenol indofenol (DCIP), natriumsaltet | 620-45-1 | 0,217 | 290,08 * |
| Fenazin ethosulfate (PES) | 10510-77-7 | 0,055 | 334,4 |
| Metylenblått | 122965-43-9 | 0,011 | 319,85 * |
| Resorufin, natriumsaltet | 34994-50-8 | -0,051 | 235,17 |
| Indigodisulfonate (indigokarmin) | 860-22-0 | -0,125 | 466,35 |
| 2-hydroksy-1,4-naphtaquinone | 83-72-7 | -0,145 | 174,15 |
| Antrakinon-2-sulfonat Na + H 2 O | 153277-35-1 | -0,225 | 328,28 |
| Phenosafranin | 81-93-6 | -0,252 | 322,8 |
| Safranin O | 477-73-6 | -0,280 | 350,84 |
| Nøytral rød | 553-24-2 | -0,340 | 288,8 |
| Benzyl viologen | 1102-19-8 | -0,350 | 409,4 |
| Metyl viologen | 1910-42-5 | -0,440 | 257,16 * |
* Vannfri
Tabell 1: Redox meklere som utgjør mekler mix.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Serien av 13 redoks mediatorer gir en redoks-likevekt i løsningen i området fra -0,45 til 0,3 volt i forhold til SHE (Tabell 1 og figur 3). Godt over og under disse potensialer alle mediatorer er enten fullstendig redusert eller fullstendig oksydert og således ikke lenger ekvilibrering med redoks-aktive sentre av proteinet kan skje. Dette er et viktig begrep, som i litteraturen noen ganger redokstitreringer er utført med bare to eller tre mediatorer, slik at kun et smalt område som skal måles 11. Slike redokstitreringer vil kun gi pålitelige resultater dersom redoks kofaktor har et midtpunkt potensial innenfor et område på ca ± 50 mV over midtpunktet potensialet av mediatorer. Den temperaturavhengigheten til midtpunkt potensialene for de forskjellige mediatorer har blitt bestemt, og det ble vist at redoks-titreringer kan utføres ved temperaturer så høye som 80 ° C. 12 Avdampning av titrasjon løsning kan forhindres ved å legge et lag av Nujol mineralolje, som er kompatibelt med de fleste proteinholdige oppløsninger.
Den anaerobicity av oppløsningene og titrering fartøy er svært viktig. Titreringen bør fortrinnsvis utføres i en anaerob hanskerommet. Det er imidlertid mulig å benytte en forseglet titrering fartøy koblet til en argon-gasstilførselen. EPR-rør kan kobles til en argon / vakuum manifold ved hjelp av små stykker av gummislangen. Titreringen prøver kan bli injisert inn i rørene via gummislangen ved hjelp av gasstette sprøyter med 13 cm lange nåler.
Under titrering av Nar1 anaerobicity var meget viktig som protein utfelles under aerobe forhold (ikke vist). Ingen nedbør skjedde under titrering.
EPR overvåket redokstitreringer er komplementære til direkte elektro (voltammetri), selv om begge fremgangsmåter kan anvendes for å bestemme midtpunktet po tentials av kofaktorer. Den første tilbyr identifisering og kvantifisering av kofaktor (e) i sin EPJ påvisbare Redox tilstand. Sistnevnte gir informasjon om elektronoverføring kinetikk og krever mindre mengder protein. Proteinprøver for redokstitreringer ikke krever spesielle forbehandlinger eller immobilisering på en overflate, som ofte er nødvendig for direkte elektrokjemiske metoder.
Direkte elektrokjemi har bare vært vellykket i konkrete saker og krever intensiv eksperimentering for å finne optimale forhold. EPR overvåket redokstitreringer har en relativt enkel måte å karakterisere redoks-kofaktorer, uansett kompleksiteten av enzymsystemet. Denne teknikken er uunnværlig i den karakteriseringen av store proteinkomplekser med flere kofaktorer. I kombinasjon med strukturell informasjon og karakterisering av enzymkinetikk, kan den katalytiske mekanismen bli studert i stor detalj.
jove_content "> I denne studien kofaktorer i S. cerevisiae Nar1p ble preget Tre forskjellige typer jern kofaktorer ble funnet.:. mononukleær jern, en [3fe-4S] klynge og en [4Fe-4S] klynge Mengden av [3fe -4S] gruppe var bare 5% av proteinkonsentrasjonen og sannsynligvis representerer en oksydativ nedbrytningsprodukt av [4Fe-4S] klyngen. Både mononukleære jern og [4Fe-4S] klynge var tilstede i støkiometriske mengder. Midtpunktet potensialet på [4Fe-4S] klynge er meget lav, noe som indikerer at den fysiologiske oksydasjonstilstand av klyngen er 2+, og at det ikke er sannsynlig at klyngen har et redoks-funksjon. Det mononukleære jern, har imidlertid en mellomliggende midtpunktpotensial og eventuelt gjennomgår et redoks-endring under fysiologiske betingelser.Biokatalytiske anvendelser av redoksenzymer dukker opp som svar på krav om mer bærekraftige syntetiske ruter fra fornybare kilder. Karakterisering av redoks-pEGENSKAPER av disse enzymene er viktig å forstå mekanismen og katalytisk omfanget av disse enzymer. For eksempel er midtpunktet potensialet av T1 kobber sentrum av laccase ansett for å være en viktig egenskap av disse enzymer. Den katalytiske effektiviteten av laccases har vist seg å være direkte avhengig av den termodynamiske drivkraft for elektrontransport, dvs. forskjellen i midtpunktet potensialet av T1 kobber senter og substratet 13. Redokstitreringer gir en meget robust måte å skaffe midtpunkt-potensialer i forskjellige redoks-aktive kofaktorer i enzymer og proteiner. Teknikken er relativt krevende i form av protein, vanligvis krever noen mg av protein, men det vil høyst sannsynlig være vellykket.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert ved stipend fra den nederlandske nasjonale forskerskolen kombinasjon, Katalyse Kontrollert av Chemical Design (NRSC-katalyse). Dr. HY Steensma og Dr. GPH van Heusden fra Leiden University er anerkjent for sin støtte med rekombinant uttrykk for S. cerevisiae Nar1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reference electrode (Ag/AgCl) | Radiometer | ||
| Chemicals | Sigma-Aldrich | ||
| EPR spectrometer | Bruker | ||
| N,N,N’,N’-tetramethyl-p-phenylendediamine (TMPD) · (HCl)2 | 637-01-4 | ||
| 2,6-dichlorophenol indophenol (DCIP), sodium salt | 620-45-1 | ||
| Phenazine ethosulfate (PES) | 10510-77-7 | ||
| Methylene blue | 122965-43-9 | ||
| Resorufin, sodium salt | 34994-50-8 | ||
| Indigodisulfonate (indigo carmine) | 860-22-0 | ||
| 2-hydroxy-1,4-naphtaquinone | 83-72-7 | ||
| Anthraquinone-2-sulfonate Na+ H2O | 153277-35-1 | ||
| Phenosafranin | 81-93-6 | ||
| Safranin O | 477-73-6 | ||
| Neutral red | 553-24-2 | ||
| Benzyl viologen | 1102-19-8 | ||
| Methyl viologen | 1910-42-5 |
References
- Lippard, S. J., Berg, J. M. Principles of Bioinorganic Chemistry. , University Science Books. (1994).
- Bertini, I. Bioinorganic Chemistry. , University Science Books. 611 (1994).
- Leger, C., et al. Enzyme Electrokinetics: Using Protein Film Voltammetry To Investigate Redox Enzymes and Their Mechanisms. Biochemistry. 42, 8653-8662 (2003).
- Hagen, W. R. Direct Electron Transfer of Redox Proteins at the Bare Glassy Carbon Electrode. Eur. J. Biochem. 182, 523-530 (1989).
- Pierik, A. J., et al. Redox Properties of the Iron-Sulfur Clusters in Activated Fe-Hydrogenase from Desulfovibrio vulgaris (Hildenborough). Eur. J. Biochem. 209, 63-72 (1992).
- Balk, J., Pierik, A. J., Netz, D. J., Muhlenhoff, U., Lill, R. The Hydrogenase-like Nar1p is Essential for Maturation of Cytosolic and Nuclear Iron-Sulphur Proteins. EMBO J. 23, 2105-2115 (2004).
- Sharma, A. K., Pallesen, L. J., Spang, R. J., Walden, W. E. Cytosolic Iron-Sulfur Cluster Assembly (CIA) System: Factors, Mechanism, and Relevance to Cellular Iron Regulation. J. Biol. Chem. 285, 26745-26751 (2010).
- Aasa, R., Vänngård, T. EPR Signal Intensity and Powder Shapes. A Reexamination. J. Magn. Reson. 19, 308-315 (1975).
- Balk, J., Pierik, A. J. A., Netz,, J, D., Mühlenhoff, U., Lill, R. Nar1p, a conserved eukaryotic protein with similarity to Fe-only hydrogenases, functions in cytosolic iron-sulphur protein biogenesis. Biochem. Soc. Trans. 33, 86-89 (2005).
- Hennessy, D. J., Reid, G. R., Smith, F. E., Thompson, S. L. Ferene - a new spectrophotometric reagent for iron. Can. J. Chem. 62, 721-724 (1984).
- Flint, D. H., Emptage, M. H., Guest, J. R. Fumarase A from Escherichia coli: purification and characterization as an iron-sulfur cluster containing enzyme. Biochemistry. 31, 10331-10337 (1992).
- Hagedoorn, P. L., Driessen, M. C., Mvd Bosch,, Landa, I., Hagen, W. R. Hyperthermophilic Redox Chemistry: a Re-evaluation. FEBS Lett. 440, 311-314 (1998).
- Tadesse, M. A., D'Annibale, A., Galli, C., Gentili, P., Sergi, F. An assessment of the relative contributions of redox and steric issues to laccase specificity towards putative substrates. Organic & biomolecular chemistry. 6, 868-878 (2008).
