इस अनुच्छेद 1 के क्रम में बिजली की उत्तेजना का उपयोग कर मकड़ियों से जहर की निकासी के लिए एक प्रोटोकॉल), प्रोटिओमिक लक्षण वर्णन आचरण 2) विष ग्रंथि जीन अभिव्यक्ति को बढ़ावा, और 3) विष के कार्यात्मक अध्ययन करते प्रदान करता है. इस जीन की अभिव्यक्ति के अध्ययन के लिए विष ग्रंथि microdissections के वर्णन के बाद है.
विष रासायनिक आम तौर पर विभिन्न शारीरिक गतिविधियों के साथ कई प्रोटीन और पेप्टाइड्स शामिल जटिल स्राव हैं. विष प्रोटीन के कार्यात्मक लक्षण वर्णन सेलुलर रिसेप्टर्स के लिए दवा सुराग या जांच की पहचान सहित महत्वपूर्ण जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों, है. मकड़ियों विषैला जीवों के अधिकांश प्रजातियों अमीर क्लेड हैं, लेकिन केवल कुछ प्रजातियों के विष के कारण छोटे जानवरों से जहर की मात्रा मिनट का संग्रह के साथ जुड़े कठिनाई के भाग में, अच्छी तरह से समझ रहे हैं. इस पत्र में पश्चिमी काले विधवा (Latrodectus संध्या का तारा) पर प्रक्रिया का प्रदर्शन, बिजली की उत्तेजना का उपयोग कर मकड़ियों से विष के संग्रह के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है. एकत्र विष मास स्पेक्ट्रोमेट्री के माध्यम से प्रत्यक्ष प्रोटीन की पहचान, कार्यात्मक assays, और transcriptomic अध्ययन के लिए विष जीन अभिव्यक्ति की उत्तेजना सहित विभिन्न बहाव के विश्लेषण के लिए उपयोगी है. इस तकनीक कि आईएसओ प्रोटोकॉल से अधिक लाभ हैविष के हिस्से के रूप में स्रावित नहीं कर रहे हैं कि सेलुलर प्रोटीन से वास्तविक विष घटकों को अलग नहीं है जो पूरी ग्रंथि homogenates, से देर विष. प्रतिनिधि परिणाम मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग कर एकत्र नमूना से जाना जाता विष पेप्टाइड का पता लगाने के प्रदर्शित करता है. विष संग्रह प्रक्रिया के परिणाम इस क्रम स्तर पर विष-व्यक्त प्रोटीन और पेप्टाइड्स के लक्षण वर्णन की ओर जाता है कि प्रदर्शन के साथ, मकड़ी विष ग्रंथियों विदारक के लिए एक प्रोटोकॉल के बाद है.
विष मुख्य रूप से शिकार या रक्षा उद्देश्यों के लिए एक और जानवर में इंजेक्शन पशु स्राव कर रहे हैं, और भी जैव चिकित्सा प्रासंगिकता 1-3 से महत्वपूर्ण जैविक आवेदन किया है. केवल कुछ जानवरों जहर synthesize, लेकिन यह विकसित स्वतंत्र रूप से किया गया है क्योंकि इसके उत्पादन, अकशेरुकी (जैसे, निडारियंस, कोन घोंघे, बिच्छू, और मकड़ियों) और रीढ़ (जैसे, सांप, कुछ मछली और स्तनधारियों) भर श्रेणी विभाजन व्यापक है कई बार 1,4 . विष का बायोकेमिकल लक्षण वर्णन आम तौर पर वे काफी हद तक तेजी घटक विषाक्त पदार्थों 1 वितरित करने के लिए इंजेक्शन पशुओं के संचार और नर्वस सिस्टम पर काम करते हैं, जो प्रोटीन और पेप्टाइड्स की एक विस्तृत विविधता से बना रहे हैं दिखा. विषैला जानवरों का एक छोटा सा अंश मानव, synanthropic वितरण 5 के साथ विशेष रूप से प्रजातियों के लिए खतरा पैदा हो सकता है. विष रचना और कार्यात्मक गतिविधियों का अध्ययन एक महत्वपूर्ण भूमिका में निभाई हैकशेरुकी सेलुलर घटकों (विशेष रूप से न्यूरोनल आयन चैनल) 6 का और मौलिक सेलुलर प्रक्रियाओं (जैसे neurosecretion) 7 elucidating में कार्यात्मक विशेषता. इसके अलावा, चुनिंदा विष पेप्टाइड्स कैंसर और दर्द 8,9 के लिए उपचार के रूप में उनके उपयोग सहित जैव चिकित्सा संदर्भों में उपयोगी गुणों, है, और उम्मीदवार दवा जाता है और विषरोधक विकास के लिए खनन कर रहे हैं. विष भी इस प्रकार इन खतरनाक स्राव का संग्रह कई सुविधाएं है, पारिस्थितिकी और विकासवादी अनुसंधान 1,4,10,11 में प्रमुख भूमिका निभाते हैं.
40,000 वर्णित मकड़ी (आदेश Araneae) की प्रजातियों, और नुकीले 12 में समाप्त कि विष ग्रंथियों बनती अधिकारी 100 से अधिक मकड़ी परिवारों में से एक है, लेकिन सभी> कर रहे हैं. मकड़ियों के उच्च प्रजाति विविधता वे विषैला जीव की सबसे बड़ी क्लेड का प्रतिनिधित्व करते हैं कि पता चलता है. हालांकि, मकड़ी विष का जैव रासायनिक लक्षण वर्णन एल हैargely सबसे अधिक बार मानव envenomation के साथ जुड़े प्रजातियों की एक छोटी संख्या पर ध्यान केंद्रित किया. मकड़ी विष का हाल ही में प्रोटिओमिक और transcriptomic पढ़ाई वे आम तौर पर कई अद्वितीय प्रोटीन और पेप्टाइड 2,13,14 होते संकेत मिलता है. उच्च throughput सीडीएनए अनुक्रमण और मास स्पेक्ट्रोमेट्री पेप्टाइड फिंगरप्रिंटिंग के क्षेत्र में अग्रिम बहुत इन विष प्रोटीन 15 की खोज में मदद की है. फिर भी, इस तरह के काम में इस तरह की तकनीक के लिए पर्याप्त विष और / या मकड़ियों से विष ग्रंथियों, और विस्तृत प्रलेखन के संग्रह के साथ शुरू होता है 16 कुछ कर रहे हैं.
इस पत्र में समान आकार मकड़ियों के लिए लागू किया जा सकता है जो काले विधवा मकड़ियों से विष और विष ग्रंथियों के संग्रह के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है. अलग ग्रंथियों से विष का संग्रह अन्य सेलुलर कार्यों प्रदर्शन प्रोटीन के लिए विरोध के रूप में जहर में स्रावित होते हैं कि प्रोटीन की पहचान में सक्षम बनाता है. काले विधवाओं और अन्य एलatrodectus प्रजाति व्यापक रूप से की वजह से कभी कभी विपुल पसीना, मांसपेशियों में संकुचन, उच्च रक्तचाप, साँस लेने में कठिनाई और बद पक्षाघात 5 के साथ है जो मानव में गंभीर दर्द का कारण बनता है जो उनके अत्यधिक न्यूरोटौक्सिक जहर, के लिए सबसे खतरनाक मकड़ियों के बीच में होने के रूप में पहचाने जाते हैं. यहाँ प्रस्तुत विष संग्रह प्रोटोकॉल मांसपेशियों में संकुचन और विष की रिहाई बटोर anesthetized मकड़ियों के लिए मौजूदा बिजली देने के लिए विद्युत उत्तेजना का उपयोग करता है. जहर बूंदों जल्दी सूक्ष्म केशिकाओं के साथ एकत्र और फ्रीजर भंडारण के लिए ट्यूबों में तिरस्कृत कर रहे हैं. प्रोटोकॉल खतरनाक प्रक्रियाओं शामिल है, यह केवल अच्छी तरह से प्रशिक्षित व्यक्तियों द्वारा किया जाना चाहिए और सावधानी महत्वपूर्ण कदम पर आग्रह किया है. एकत्र विष ऐसे लक्षण वर्णन और शारीरिक प्रयोगों या कार्यात्मक assays के 18 के लिए घटक अणु 2, के अलगाव के रूप में कई का उपयोग करता है, और विष जीन अभिव्यक्ति 11 को प्रोत्साहित करने के लिए. प्रोटोकॉल एक Descr के साथ समाप्तविष ग्रंथि विच्छेदन और विष-विशिष्ट जीन की क्लोनिंग के लिए उपयोगी संरक्षण के iption, अभिव्यक्ति, जिनमें से अलग मकड़ियों 10,11 में जहर कमी निम्नलिखित 2-3 दिनों घटित दिखाया गया है.
विष एक physiologically प्रतिक्रियाशील प्रोटीन, पेप्टाइड्स और दवाओं की खोज के लिए आवेदन पत्र के साथ अन्य अणुओं का महत्वपूर्ण स्रोत है, साथ ही के लिए सेलुलर और पारिस्थितिक अनुसंधान 1-3 के बुनियादी पहलुओं का प्रतिनिधित्व करते हैं. हालांकि, विशेष रूप से खतरनाक या छोटे जानवरों से विष का संग्रह, एक चुनौतीपूर्ण कार्य है. इस प्रोटोकॉल विष और विष ग्रंथियों काले विधवा मकड़ियों से एकत्र किया जा सकता है दर्शाता है कि कैसे, और विष से क्लोन विष का mudpit विश्लेषण और cDNAs से ली गई एक प्रोटीन डेटाबेस का एक संयोजन के माध्यम से इस दृष्टिकोण की सफलता 21 ग्रंथियों की पुष्टि करता है. इस प्रोटोकॉल काले विधवाओं और मध्यम आकार मकड़ियों, के लिए अच्छी तरह से काम करता है जबकि अन्य विष संग्रह तकनीकों हालांकि, इस तरह pipettes जैसे, 24. यह बाद दृष्टिकोण गिलास में नुकीले से जहर की प्रत्यक्ष आकांक्षा के रूप में बड़ा mygalomorph (टारेंटयुला की तरह) मकड़ियों, के लिए नियोजित किया गया है , aggressi नहीं कर रहे हैं कि छोटे आकार मकड़ियों के लिए अच्छी तरह से काम नहीं चलेगाve.
यह अधिक दिनचर्या, लगातार और तेज हो जाता है इतना है कि यहाँ वर्णित विष संग्रह प्रोटोकॉल में से एक विशेष रूप से महत्वपूर्ण पहलू संग्रह प्रक्रिया की तैयारी और अनुकूलन के प्रारंभिक चरणों है. प्रोटोकॉल गुरु को शुरू में चुनौती दे रहा है, लेकिन दोहराया परीक्षण के साथ, यह आसान है और तेजी हो जाता है. सावधानी भी खतरनाक मकड़ियों की हैंडलिंग, विद्युत धारा, ठीक बिंदु कांच सूक्ष्म केशिकाओं, और सिरिंज सुई के इस्तेमाल को शामिल सभी महत्वपूर्ण चरणों में से आग्रह किया है. यह सूक्ष्म केशिकाओं को आकार देने जब Eyewear, साथ ही इस तरह के nitrile दस्ताने, एक प्रयोगशाला कोट, लंबे पैंट और बंद जूते के रूप में उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनने के लिए महत्वपूर्ण है.
विष संग्रह करने के लिए एक और चुनौतीपूर्ण पहलू मात्रा ली हो सकता एकत्र जहाँ से किसी भी एक मकड़ी, विशेष रूप से Latrodectus प्रजातियों, द्वारा उत्पादित विष की छोटी राशि हैपर सबसे अच्छा व्यक्ति प्रति 1-2 microliters के लिए mited. ऐसे प्रोटीन जैल या कार्यात्मक assays के रूप में नीचे की ओर अनुप्रयोगों के लिए पर्याप्त विष प्राप्त एक ट्यूब में कई व्यक्तियों से विष के संयोजन की आवश्यकता हो सकती. ऐसे मामलों में, विष केवल एक ही लिंग, व्यष्टिविकास चरण के व्यक्तियों से जोड़ा जाना चाहिए, और जनसंख्या कुछ विष 25, 26 में, intersexual विकास और भौगोलिक परिवर्तनशीलता की मान्यता दी. मकड़े भी कम मात्रा ग्रंथि की हाल ही में कमी को प्रतिबिंबित कर सकते जहां व्यक्तियों, बीच में उत्पादित जहर की मात्रा में काफी भिन्नता प्रदर्शित कर सकते हैं. इस प्रकार यह उनकी आखिरी खिलाने के बाद जहर कई दिनों इकट्ठा करने के लिए सलाह दी जा सकती. थोड़ा जहर जारी की है, तो अत्यधिक वर्तमान hemolymph या मौत के साथ विष के प्रदूषण के लिए अग्रणी, छल्ली टूटना कारण हो सकता है जो मकड़ी, के लिए लागू नहीं किया जाना चाहिए.
मकड़ी एसआई के साथ जहर नमूनों का संदूषणलालकृष्ण या मानव सूत्रों ने यह भी बाँझ या स्वच्छ उपकरणों के उपयोग के माध्यम से परहेज किया जाना चाहिए. इन चुनौतियों के बावजूद, शुद्ध विष का संग्रह, जिंदा मकड़ी छोड़ने, (अन्य सेलुलर प्रोटीन से विष घटकों को अलग नहीं है) और मकड़ी को मारने ग्रंथि homogenates से विष प्राप्त है कि तरीकों के लिए बेहतर है. यह नमूने जल्दी से प्रोटीन गिरावट को रोकने के लिए जमे हुए हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए भी महत्वपूर्ण है.
विष की निकासी जिससे विष ग्रंथि में जहर जीन अभिव्यक्ति उत्तेजक, बाद में जहर उत्पादन को बढ़ावा देता है. मकड़ियों जहर कमी जीवित रहने के लिए इस प्रोटोकॉल की अनुमति देता है क्योंकि इस प्रकार, उनके ग्रंथियों विच्छेदित किया जा सकता है कई दिनों के बाद जहर जीन अभिव्यक्ति ऐसे प्रतिलिपि 10,11 क्लोनिंग के रूप में आनुवंशिक अध्ययन, के लिए पर्याप्त होने की उम्मीद है जहां एक बिंदु पर (मकड़ी हत्या). कई महत्वपूर्ण सावधानियां भी विष ग्रंथि dissections में लिया जाना चाहिए. जोर प्रयोगशाला equipm के प्रयोग पर रखा जाना चाहिएईएनटी और शाही सेना नीचा कि RNases के लिए स्वतंत्र हैं कि अभिकर्मकों. इस प्रकार यह RNase और डीएनए संदूषण को खत्म करने कि समाधान के साथ संदंश और अन्य गैर डिस्पोजेबल उपकरण और सतहों साफ करने के लिए सिफारिश की है. dissections के आगे ऊतक की शाही सेना अखंडता को सुनिश्चित करने के लिए जल्दी से जल्दी और सीधे जमे हुए के रूप में किया जाना चाहिए. उनके cephalothorax और पेट जल्दी से अलग हो रहे हैं के बाद अंत में, dissections ही, anesthetized मकड़ियों पर प्रदर्शन किया जाना चाहिए.
अंत में, इस लेख मकड़ी विष और विष ग्रंथियों प्राप्त करने के लिए एक सत्यापित प्रोटोकॉल प्रदान करता है. विष और विष ग्रंथियों प्रोटिओमिक और transcriptomic दृष्टिकोण का उपयोग कर अपने प्रोटीन और पेप्टाइड घटकों के अलगाव और लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देते हैं. इसके अलावा, विष के नमूने उनके घटक अणुओं के जैव चिकित्सा और औषधीय क्षमता का निर्धारण जो कार्यात्मक assays के शुरुआती बिंदु का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं. लगभग सभी मकड़ियों विष का उत्पादन, और विस्तृत गोताखोरव्यक्तिगत प्रजातियों द्वारा संश्लेषित विष घटकों की चर्चाएं विष के अणुओं की एक विशाल विविधता अभी तक 13 की खोज की जा रहे हैं पता चलता है. तदनुसार, इस प्रोटोकॉल मकड़ी विष में मौजूद जैविक रूप से सक्रिय अणुओं की समृद्ध स्रोत की जांच के लिए उपकरण प्रदान करता है.
The authors have nothing to disclose.
मैं इस प्रोटोकॉल के विकास में उनकी सहायता के लिए निम्नलिखित व्यक्तियों धन्यवाद: चक Kristensen, ग्रेटा Binford, एलेक्स लालकृष्ण लंकास्टर, कोनराड Zinsmaier, और Mays इमाद. मास स्पेक्ट्रोमेट्री और प्रोटिओमिक्स डेटा AZCC को SWEHSC, एनआईएच / NCI अनुदान CA023074 को NIEHS अनुदान ES06694 द्वारा समर्थित एरिजोना प्रोटिओमिक्स कंसोर्टियम द्वारा और एरिजोना विश्वविद्यालय के BIO5 संस्थान द्वारा हासिल किया गया. इस काम के लिए अनुदान जेसिका ई आड़ को अनुदान 1F32GM83661-01 और 1R15GM097714-01 से राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (जनरल मेडिसिन के राष्ट्रीय संस्थान) से प्रदान किया गया.
Nerve and muscle stimulator (electro-stimulator) | Grass Technologies | SD9 | http://www.grasstechnologies.com/products/stimulators/stimsd9.html |
Voltmeter | RadioShack | 22-223 | any generic voltmeter/multimeter can be substituted |
Pointed Featherweight Forceps | Bioquip | 4748 | |
Plasti Dip | Performix | Available at Ace Hardware | |
21 G X 1 1/2in Precision Glide hypodermic syringe needle | BD Medical | 305190 | |
Vacuum filter flask 1L | Nalgene | DS4101-1000 | smaller flask sizes may also work |
Buchner Two Piece funnel, 90 mm | Nalgene | 4280-0900 | |
5 microlitter Capillary Bores (Micro capillaries) | VWR | 53508-375 | |
Mounting putty strip | Loctite | Available at Ace Hardware | |
Fisherbrand* General-Purpose Extra-Long Forceps Length: 11-13/16 in. | Fisher | 10-316C | |
SSC Buffer, 20X (pH 7.0), Molecular Grade | Promega | V4261 | can be made from stock chemicals (150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate) |
Eppendorf safe-lock tubes 0.5 mL tubes (cryogenic safe) | Eppendorf | 22363611 | |
Nalgene Dewar, 1L, HDPE, Liquid nitrogen benchtop flask | Thermo Scientific | 4150-1000 | |
Rnase Away | VWR | 53225-514 | |
Ultra Fine Tweezers (dissecting forceps) | EMS | 78310-0 | similar high-quality fine point forceps can be substituted |
Foot switch/pedal | Linemaster Switch Corp. | 491-S | |
Two-pronged extension clamp, with vinyl covered sleeves, 8.5 inches | VWR | 21570-007 | similar models could be substituted |
Clamp Holder | VWR | 89084-746 | similar models could be substituted, must accommodate diameter of extension clamp rod |
Magnetic base (holds extension clamp via clamp holder) | VWR | 300042-270 | similar apparatus able to securely hold extension clamp in fixed position may be substituted |
Plastic Collecting Vials (large/40 dram) | Bioquip | 8940 | |
Cotton sewing thread | Threadart.com | THRCOT9 | similar product could be substituted |