Эта статья предусматривает протокол для извлечения яда из пауков с помощью электрической стимуляции в целях: 1) проводить протеомный характеристику, 2) стимулировать экспрессию гена железы яд, и 3) выполнение функциональные исследования ядов. За этим следует описание яд железы microdissections для исследований экспрессии генов.
Ядов химически сложные выделения, как правило, включающие многочисленные белки и пептиды с различными физиологическими деятельности. Функциональная характеристика ядовитых белков имеет важные биомедицинские приложения, в том числе идентификации приводит наркотиков или зондов для клеточных рецепторов. Пауки являются большинство видов богатой клады ядовитые организмы, но яды лишь несколько видов хорошо понимал, в части из-за трудностей, связанных со сбором мельчайшие количества яда от мелких животных. Эта статья представляет собой протокол для сбора яда из пауков с помощью электрической стимуляции, демонстрируя процедуру на Западной черной вдовы (Latrodectus Геспер). Собранный яд полезен для различных последующих анализов в том числе прямой идентификации белков через масс-спектрометрии, функциональных анализов, и стимуляции экспрессии генов яд для транскриптомных исследований. Эта техника имеет преимущество над протоколами, которые изопоздно яд из целых железы гомогенатах, которые не отделяют подлинные компоненты яда из клеточных белков, которые не секретируемых как часть яда. Типичные результаты демонстрируют обнаружение известных пептидов из яда собранного образца с использованием масс-спектрометрии. Процедура сбора яда следуют протокола для рассечения яда паука желез, с результаты демонстрируют, что это приводит к характеристике яда-экспрессированных белков и пептидов на уровне последовательности.
Яды выделениями животных преимущественно вводят в другое животное для целей хищничества или обороны, а также имеют важные биологические приложения с биомедицинской актуальности 1-3. Только некоторые животные синтезировать яд, но его производство таксономически широко распространены беспозвоночных (например, книдарий, моллюсков-конусов, скорпионов, пауков и) и позвоночных (например, змей, некоторых рыб и млекопитающих), потому что он самостоятельно развивалась несколько раз в 1,4 , Биохимические характеристики ядов, как правило, показывают, что они состоят из широкого спектра белков и пептидов, которые в основном действуют на кровеносную и нервной систем, инъецированных животных, чтобы быстро доставить составные токсины 1. Небольшая часть ядовитых животных может представлять угрозу для человека, особенно видов с синантропных распределений 5. Изучение состава яда и функциональной деятельности играет важную роль вфункциональные характеристики позвоночных клеточных компонентов (в частности, нейронные ионные каналы) 6 и в выяснении фундаментальные клеточные процессы (например нейросекрета) 7. Кроме того, выберите яда пептиды обладают полезными свойствами в биомедицинских контекстах, в том числе их использование в качестве средства лечения рака и боли 8,9, и добываются на кандидатов приводит наркотиков и развития против змеиного яда. Ядов также играют заметную роль в экологическом и эволюционном исследований 1,4,10,11, таким образом, коллекция этих опасных выделений имеет множество утилит.
Есть> 40000 описанных видов пауков (порядка Пауки), и все, кроме одного из пауков семей более чем 100 обладают парных ядовитых желез, которые оканчиваются в клыков 12. Видовое разнообразие высокой пауков предполагает, что они представляют собой крупнейший клад ядовитых организмов. Однако биохимические характеристики ядов пауков есть лargely сосредоточено на небольшом количестве видов наиболее часто связанных с человеческой укуса. Последние протеомные и транскриптомных исследования ядов пауков указывают, что они, как правило, содержат много уникальных белков и пептидов 2,13,14. Достижения в области высокой пропускной кДНК последовательности и масс-спектрометрии пептидов дактилоскопии значительно облегчило открытие этих ядовитых белков 15. Тем не менее, такая работа начинается со сбора достаточного яда и / или ядовитых желез из пауков и подробной документации для таких методов мало 16.
Эта статья представляет собой протокол для сбора яда и ядовитых желез из черная вдова пауков, которые могут быть применены к подобного размера пауков. Сбор яда отдельно от желез позволяет идентифицировать белки, которые секретируются в яд, в отличие от белков, выполняющих другие клеточные функции. Черные вдовы и другие Lвиды atrodectus широко признаны одними из самых опасных пауков в связи с их высокой нейротоксической яда, который вызывает сильную боль у человека, который иногда сопровождается обильным потоотделением, мышечных сокращений, гипертонии, затрудненное дыхание и пятнистый паралича 5. Протокол коллекция яд, представленные здесь использует электростимуляции доставить электрический ток для анестезии пауков, чтобы вызвать мышечные сокращения и высвобождения яда. Капли яда быстро собрали с микро-капилляров и разливают в пробирки для хранения морозильной. Поскольку протокол включает опасные процедуры, она должна быть выполнена только с помощью хорошо обученных людей, и осторожность призвал на ключевых шагов. Собранный яд имеет множество применений, таких как характеристики и изоляции учредительных молекул 2, для физиологических экспериментов или функциональных анализов 18, и, чтобы стимулировать экспрессию гена яда 11. Протокол завершается DESCRiption из яда железы диссекции и сохранение полезной для клонирования яда-специфических генов, экспрессия которых было показано, что происходит в 2-3 дней после яда истощение в различных пауков 10,11.
Ядов представляют собой важный источник физиологически реактивных белков, пептидов и других молекул с приложениями для открытия новых лекарств, а также для фундаментальных аспектов клеточного и экологических исследований 1-3. Тем не менее, сбор яда, особенно от опасных или мелких животных, является сложной задачей. Этот протокол показывает, как яд и ядовитых желез могут быть собраны из черная вдова пауков, и подтверждает успех этого подхода через комбинации MuDPIT анализа яда и базы данных белка, полученного из кДНК клонированного из ядовитых желез 21. Хотя этот протокол работает хорошо для черных вдов и средних пауков, другие методы сбора яда были использованы для увеличения mygalomorph (тарантулов, как) пауков, например, прямой аспирации яда от клыков в стеклянные пипетки например, 24. Этот последний подход, однако , не будет хорошо работать для меньшего размера пауков, которые не aggressiве.
Один особенно важный аспект протокола сбора яда, описанной здесь начальные фазы подготовки и оптимизации процесса сбора, так что она становится все более рутинной, последовательным и быстрее. Протокол изначально сложным в освоении, но при повторных испытаниях, становится легче и быстрее. Внимание также призвал на всех критических этапах, связанных с обращение с опасными пауками, использование электрического тока, тонкой точка стеклянные микро капилляров и шприцев иглы. Важно носить соответствующие средства индивидуальной защиты, такие как нитриловые перчатки, лабораторный халат, длинные брюки и закрытые туфли, а также очки при формировании микро капилляров.
Другой аспект сложной сбора яда является небольшое количество яда получены любым одним паука, в частности видов, Latrodectus, из которого суммы собранных может быть Liраничена 1-2 мкл на индивида в лучшем случае. Получение достаточного яд для последующих применений, таких как белковые гели или функциональных анализов может потребоваться сочетание яда из нескольких индивидуумов в одну пробирку. В таких случаях, яд должен сочетаться только с особями того же пола, стадии онтогенеза, и население, учитывая признание межполовых, развития и географической изменчивости в некоторых ядов 25, 26. Пауки могут также проявлять значительные различия в размере яда производится среди лиц, где меньшие количества могут отражать недавнее истощение железы. Таким образом, может быть целесообразным, чтобы собрать яда через несколько дней после их последнего кормления. Если немного яда освобождается, чрезмерного тока не должна применяться к пауку, что может привести кутикула к разрыву, что приводит к загрязнению ядом с гемолимфы или смерти.
Загрязнение образцов яда паука сиLk или человека источники также следует избегать за счет использования стерильных или чистых оборудования. Несмотря на эти проблемы, сбор чистого яда, оставляя паука живьем, предпочтительнее методов, которые получают яд от железы гомогенатах (которые не отдельные компоненты яда от других клеточных белков) и убить паука. Исключительно важно также, чтобы гарантировать, что образцы быстро замораживали, чтобы предотвратить деградацию белков.
Добыча яда способствует последующему производство яда, тем самым стимулируя экспрессию генов яда в ядовитой железы. Таким образом, из-за этого протокола позволяет пауки выжить истощение яда, их желез может быть расчленены на несколько дней позже (убийство паука) в точке, где экспрессия гена яд, как ожидается, будет достаточно для генетических исследований, таких как расшифровка клонирование 10,11. Несколько важных мер предосторожности должны быть приняты в яд железы вскрытий. Акцент должен быть сделан на использовании лабораторного ОснасткаЛОР и реагенты, которые свободны от РНКаз которые разрушают РНК. Таким образом, рекомендуется протереть щипцов и других не-одноразовое оборудование и поверхностей с помощью решений, устраняющих РНКазы и ДНК загрязнения. В вскрытия должна быть выполнена как можно быстрее и непосредственно замороженные в дальнейшем обеспечить целостность РНК из ткани. Наконец, вскрытия должна быть выполнена только на наркозом пауков, после их головогрудь и брюшко быстро разошлись.
В заключение этой статьи предусматривает проверить протокол для получения яда паука и ядовитых желез. Venom и ядовитых желез позволяют выделения и характеристики их белковых и пептидных компонентов с использованием протеомные и транскриптомных подходы. Кроме того, образцы яда может представлять начальную точку функциональных анализов, определяющих биомедицинских и фармакологических потенциал своих учредительных молекул. Почти все пауки производят яд, а широкая дайверплотность яда компонентов, синтезируемых отдельных видов предполагает обширное разнообразие молекул яда еще предстоит открыть 13. Соответственно, этот протокол обеспечивает средства, чтобы исследовать богатый источник биологически активных молекул, присутствующих в ядов пауков.
The authors have nothing to disclose.
Я благодарность следующим людям за их помощь в развитии этого протокола: Чак Кристенсен, Грета Бинфорд, Алекс К. Ланкастер, Конрад Zinsmaier и Mays Имада. Масс-спектрометрия и протеомика данные были приобретены Аризона протеомики консорциума при поддержке NIEHS гранта ES06694 к SWEHSC, NIH / NCI грант CA023074 к AZCC и по BIO5 института Университета Аризоны. Финансирование этой работы была предоставлена из Национального института здоровья (National Institute общей медицины) от грантов 1F32GM83661-01 и 1R15GM097714-01 до Джессика Е. наряд.
Nerve and muscle stimulator (electro-stimulator) | Grass Technologies | SD9 | http://www.grasstechnologies.com/products/stimulators/stimsd9.html |
Voltmeter | RadioShack | 22-223 | any generic voltmeter/multimeter can be substituted |
Pointed Featherweight Forceps | Bioquip | 4748 | |
Plasti Dip | Performix | Available at Ace Hardware | |
21 G X 1 1/2in Precision Glide hypodermic syringe needle | BD Medical | 305190 | |
Vacuum filter flask 1L | Nalgene | DS4101-1000 | smaller flask sizes may also work |
Buchner Two Piece funnel, 90 mm | Nalgene | 4280-0900 | |
5 microlitter Capillary Bores (Micro capillaries) | VWR | 53508-375 | |
Mounting putty strip | Loctite | Available at Ace Hardware | |
Fisherbrand* General-Purpose Extra-Long Forceps Length: 11-13/16 in. | Fisher | 10-316C | |
SSC Buffer, 20X (pH 7.0), Molecular Grade | Promega | V4261 | can be made from stock chemicals (150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate) |
Eppendorf safe-lock tubes 0.5 mL tubes (cryogenic safe) | Eppendorf | 22363611 | |
Nalgene Dewar, 1L, HDPE, Liquid nitrogen benchtop flask | Thermo Scientific | 4150-1000 | |
Rnase Away | VWR | 53225-514 | |
Ultra Fine Tweezers (dissecting forceps) | EMS | 78310-0 | similar high-quality fine point forceps can be substituted |
Foot switch/pedal | Linemaster Switch Corp. | 491-S | |
Two-pronged extension clamp, with vinyl covered sleeves, 8.5 inches | VWR | 21570-007 | similar models could be substituted |
Clamp Holder | VWR | 89084-746 | similar models could be substituted, must accommodate diameter of extension clamp rod |
Magnetic base (holds extension clamp via clamp holder) | VWR | 300042-270 | similar apparatus able to securely hold extension clamp in fixed position may be substituted |
Plastic Collecting Vials (large/40 dram) | Bioquip | 8940 | |
Cotton sewing thread | Threadart.com | THRCOT9 | similar product could be substituted |