Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Extractie van Venom en Venom Gland Microdissections van Spinnen voor proteoom en transcriptoom Analyses

doi: 10.3791/51618 Published: November 3, 2014

Summary

Dit artikel geeft een protocol voor de winning van gif van spinnen met behulp van elektrische stimulatie om 1) uitvoeren van proteomics karakterisering, 2) het stimuleren van gifklier genexpressie, en 3) uitvoeren van functionele studies van vergiften. Daarna volgt een omschrijving van gifklier microdissections genexpressie studies.

Abstract

Vergiften chemisch complex afscheiding kenmerkend omvattende verschillende proteïnen en peptiden met verschillende fysiologische activiteiten. Functionele karakterisering van gif eiwitten heeft belangrijke biomedische toepassingen, met inbegrip van de identificatie van de drug leads of probes voor cellulaire receptoren. Spinnen zijn de meest soortenrijke clade van giftige organismen, maar het gif van slechts een paar soorten zijn goed begrepen, voor een deel te wijten aan de moeilijkheid in verband met het verzamelen van kleine hoeveelheden gif van kleine dieren. In deze paper wordt een protocol voor het verzamelen van gif van spinnen met behulp van elektrische stimulatie, waaruit de gevolgde procedure aan de westelijke zwarte weduwe (Latrodectus hesperus). De verzamelde gif is nuttig voor gevarieerde downstream analyses met inbegrip van directe identificatie eiwit via massaspectrometrie, functionele testen, en het stimuleren van gif genexpressie voor transcriptomische studies. Deze techniek heeft het voordeel boven protocollen isolaat gif uit totaal klier homogenaten die niet echt gif componenten van cellulaire eiwitten die niet worden uitgescheiden als deel van het gif doen scheiden. Representatieve resultaten tonen de detectie van bekende gif peptiden uit het verzamelde monster met massaspectrometrie. Het gif verzamelprocedure gevolgd door een protocol voor het ontleden spin gifklieren met resultaten tonen dat dit leidt tot de karakterisering van gif expressie gebrachte eiwitten en peptiden op het sequentieniveau.

Introduction

Vergiften zijn dierlijke afscheidingen overwegend geïnjecteerd in een ander dier voor de doeleinden van predatie of de verdediging, en hebben ook belangrijke biologische toepassingen met biomedische relevantie 1-3. Alleen bepaalde dieren synthetiseren gif, maar de productie taxonomisch wijdverspreid over ongewervelde (bijv cnidarians, kegel slakken, schorpioenen en spinnen) en vertebraten (bijvoorbeeld slangen, sommige vissen en zoogdieren), omdat het onafhankelijk is geëvolueerd meerdere keren 1,4 . Biochemische karakterisatie van vergiften tonen bijvoorbeeld zij bestaan ​​uit een groot aantal eiwitten en peptiden, die grotendeels werken op de bloedsomloop en het zenuwstelsel van geïnjecteerde dieren snel leveren bestanddeel toxines 1. Een klein deel van de giftige dieren kunnen een bedreiging voor de mens, met name soorten met synantrope distributies 5 vormen. De studie gif samenstelling en functionele activiteiten heeft een belangrijke rol gespeeldde functionele karakterisatie van gewervelde cellulaire componenten (met name neuronale ionenkanalen) 6 en ophelderen fundamentele cellulaire processen (bijv neurosecretie) 7. Bovendien selecteert gif peptiden hebben nuttige eigenschappen in biomedische contexten, met inbegrip van hun toepassingen als behandelingen voor kanker en pijn 8,9, en worden ontgonnen met kandidaat-medicijn leads en antivenom ontwikkeling. Venoms ook een prominente rol spelen in de ecologische en evolutionaire onderzoek 1,4,10,11, waardoor de verzameling van deze gevaarlijke afscheiding heeft vele nutsbedrijven.

Er zijn> 40.000 beschreven soorten spinnen (Orde Araneae), en alle, maar een van de meer dan 100 spin families bezitten gepaarde gifklieren die eindigen in giftanden 12. De hoge diversiteit aan spinnen soorten suggereert dat zij vertegenwoordigen de grootste clade van giftige organismen. Echter, biochemische karakterisering van spin gif heeft largely geconcentreerd op een klein aantal soorten het vaakst geassocieerd met menselijke envenomation. Recente proteoom en transcriptoom studies van spin gif geven ze vele unieke eiwitten en peptiden 2,13,14 bevatten doorgaans. Advances in high-throughput cDNA sequentie en massaspectrometrie peptide fingerprinting sterk vergemakkelijkt de ontdekking van deze gif eiwitten 15. Toch begint deze werkzaamheden met het verzamelen van voldoende gif en / of de gifklieren van de spinnen, en gedetailleerde documentatie voor dergelijke technieken zijn weinig 16.

In deze paper wordt een protocol voor het verzamelen van gif en gifklieren van zwarte weduwe spinnen, die kan worden toegepast op vergelijkbare grootte spinnen. De collectie gif afzonderlijk van de klieren kunnen identificatie van eiwitten die worden uitgescheiden in het gif in tegenstelling tot eiwitten uitvoeren van andere cellulaire functies. Zwarte weduwen en andere Latrodectus soorten worden algemeen erkend als een van de meest gevaarlijke spinnen vanwege hun zeer neurotoxisch gif, wat ernstige pijn veroorzaakt bij mensen, die soms gepaard gaat met overmatig zweten, spiersamentrekkingen, hoge bloeddruk, ademhalingsproblemen en fragmentarisch verlamming 5. Het gif collectie protocol hier gepresenteerde maakt gebruik van elektro-stimulatie van elektrische stroom te leveren aan verdoofd spiders om spiersamentrekkingen en het vrijkomen van gif ontlokken. Venom druppels worden snel verzameld met micro-capillairen en loopt vervolgens in buizen voor vriezer bewaren. Omdat het protocol betreft gevaarlijke procedures, mag het alleen worden uitgevoerd door goed opgeleide personen en voorzichtigheid wordt aangedrongen op belangrijke stappen. De verzamelde gif heeft talrijke toepassingen, zoals de karakterisering en isolatie van samenstellende moleculen 2 om fysiologische experimenten of functionele testen 18 en gif genexpressie 11 stimuleren. Het protocol wordt afgesloten met een description van gifklier dissectie en behoud bruikbaar voor het kloneren van gif-specifieke genen, waarvan de expressie is aangetoond dat het plaatsvindt 2-3 dagen na gif depletie in verschillende spinnen 10,11.

Protocol

1. Voorbereiding van de Electro-stimulator Apparatus

  1. Sluit elektro-stimulator netsnoer in het stopcontact en sluit de externe voetpedaal om het externe ingangssignaal.
    Opmerking: Elektrische draden zijn goed geïsoleerd en blootgestelde metalen leveren van stroom mag niet worden aangeraakt. Draag latex of nitril handschoenen voor bescherming. Elektro-stimulator stroomschakelaar moet in OFF positie wanneer het bevestigen netsnoer en bevestigen van kabels.
  2. Sluit de positieve elektrode naar rood-uitgang op elektro-stimulator (wanneer polariteitsschakelaar is in de normale modus) en sluit de negatieve elektrode naar de zwarte uitgang. Opmerking: Elke elektrode draad moet eindigen in een alligator clip.
  3. Stel stimulator aan de volgende aanbevolen initiële instellingen: spanning = 7 V, Frequentie = 1 pulsen per seconde, delay = 0 milliseconden, duur = 200 milliseconden, twee pulsen schakelen = reguliere en mode switch = off.
  4. Test output van de elektroden door het aanbrengen van krokodillenklemmen aan voltmeter positieve en negatieve test leads. Schakel de stimulator uit-schakelaar en leveren stroom met voetpedaal.

2. Voorbereiding voor het immobiliseren van tang en andere materialen

  1. Dompel een riek van vedergewicht pincet in vloeibare kunststof coating en wacht vier uur aan coating te laten drogen. Wikkel 15 mm van het uiteinde van de tegenpartij riek met een enkele laag van katoen naaigaren, en veilig draad door koppelverkoop het einde in een knoop.
    : De draad wordt gebruikt om een ​​toegepaste zoutoplossing die elektrische geleidbaarheid bevordert absorberen, terwijl de kunststof coating isolatie vertragen stroom.
  2. Snijd puntje van stompe injectienaald met een scherpe schaar en glad de opening met schuurpapier. Bevestig de naald aan een vacuüm sifon (bijvoorbeeld vacuüm filtreerkolf) via buizen.
    Opmerking: De naald weg zal zuigen water en braken, en zal dienen om het circuit gecreëerd door de stimulator elektrodes te voltooien. De naald opening must zijn klein genoeg om de spin niet schadelijk, maar toch groot genoeg om vacuüm oplossing zonder verstopping (bijvoorbeeld, 25 G x 1 ½ in gauge, zie Materials List).
  3. Positie vedergewicht forceps horizontaal in een goed gesloten positie met een vinyl tweeledige klem bevestigd aan een magnetische basis of vaste stand apparaat onder gezichtsveld een dissectie microscoop met kunststof beklede prong pincet boven en draad bekleed uitsteeksel onder.
    Opmerking: De tweeledige klem wordt gehandhaafd in een stilstaande positie om de magnetische voet door een klem houder (zie Materials List). Een rubberen band kan stevig worden vastgemaakt rond tanden van de tang vedergewicht, naast de klemhouder, om extra druk aan het vedergewicht forceps in een gesloten positie rond de spin eenmaal ingevoerd add.
  4. Bevestig positieve elektrode alligator clip naar beneden tand tang 'stroomopwaarts van draad en bevestig negatieve alligator clip op metalen vacuüm naald stomp. Testcircuit stroom met voltmeter door het plaatsen van positieve draad op een tang tand tussen de draad en de alligator clip en het plaatsen van negatieve draad op botte vacuüm naald. Druk op het voetpedaal om voldoende stroom wordt gedetecteerd en verwijderd leads als er voldoende stroom wordt gedetecteerd.
  5. Bereid verschillende microcapillaire buizen voor gif collectie. Houd één microcapillaire buis aan één uiteinde voorzien van een gehandschoende hand en aan de andere kant met een steriele metalen tang, het plaatsen van de tang-held einde horizontaal boven een bunsenbrander vlam. Trek aan de microcapillaire met de metalen tang uit de buurt van de vlam tot een langgerekte tip te creëren, terwijl het andere uiteinde in een stilstaande positie.
    Opmerking: Draag een veiligheidsbril als microcapillairen gemakkelijk kunnen breken.
  6. Rusten bereid microcapillairen op een montage kit strip in een petrischaaltje. Onderzoeken microcapillaire eindigt onder een dissectie microscoop en een kleine, schuine opening aan het eind trok met gesteriliseerd metalen tang.
  7. Label variabel aantal steriele 0,5 ml buisjes. Voeg steriel, gedeïoniseerd water buizen steriel (bijvoorbeeld 5 ul geautoclaveerd gedeioniseerd water). Sluiten buizen en plaats buisjes op ijs.
  8. Bereid zoutoplossing in een beker en vul een tweede beker met geautoclaveerd water.

3. Immobilisatie van Spin in tang

  1. Schakel CO 2 tank en breng spin uit gesloten plastic verzamelen flacon (zie Materials List) in CO 2 kamer met behulp van lange metalen tang.
    Opmerking: zwarte weduwe spinnen gevaarlijk gif; Draag altijd handschoenen tijdens dit protocol.
  2. Houd spin in kamer voor 5-10 minuten of totdat verdoofde en beweegt niet meer toen zachtjes porde met een lange pincet. Gebruik transferpipet naar draad nat op een tang met een zoutoplossing.
    Opmerking: Voor richtlijnen over CO 2 anesthesie parameters voor zwarte weduwen, verwijzen naar Spagna en Moore 19.
  3. Ophalen verdoofde spin van CO 2kamer door picking it up door zijn voorste poten met behulp van bot ontleden tang en handschoenen aan. Verplaats verdoofd spider om tang apparaat vedergewicht. Afzonderlijke tanden van gesloten vedergewicht pincet en plaats kopborststuk van de spin in tussen de tanden en laat de tanden te dicht shut om spin te zorgen is stevig op zijn plaats gehouden, maar niet wordt geplet. Zorg ervoor dat de spin wordt geplaatst rugschild dorsum kant naar beneden (zie Foelix 20 voor gids voor spin anatomie), rustend op draad gecoat riek, en buikzijde het kopborststuk's met uitzicht op de plastic coating, terwijl de positieve elektrode blijft gehecht aan onderkant riek. Werk snel bij de omgang met spin.
  4. Pas dissectiemicroscoop vergroting, focus, en de lichtbron tot cheliceren van de spin en de tanden zijn duidelijk zichtbaar.

4. Venom Collection

  1. Schakel vacuüm en spray spider chelicerae met water oplossing met behulp van een tweede stompe getipt spuit needle. Zuig weg water met vacuüm naald om onzuiverheden te verwijderen.
  2. Raak het vacuüm naald met aangehechte negatieve elektrode aan spider rostrum en leveren puls met voetpedaal één of meerdere keren. Vacuum weg braken indien nodig.
    Opmerking: spider rostrum is in de mond van posterior naar chelicerae op dorsale oppervlak tussen chelicerae en endites (zie Foelix 20 voor gedetailleerde spider anatomie). Opmerking: Bij elke puls, zal de spin benen contract, en gif zichtbaar als heldere druppels die uit giftanden.
  3. Verzamel gif druppels met microcapillaire tip en overdracht capillaire tip in 0,5 ml buis met water of bufferoplossing (oplossing zal worden meegezogen in capillair).
    Let op: niet te beschadigen spin met capillaire wat kan leiden tot hemolymph besmetting en dood. Ook besmetting van capillaire voorkomen met zijde en lijm van spintepels.
  4. Hechten overdracht spuiten met buisadapter om microcapillaire (aan het eind tegenover collectie tip) en dispense gif oplossing terug in de buis. Zet buis op ijs.
    Opmerking: Verwijdering van afval haarvaten in een nabijgelegen naaldencontainer.
  5. Plaats open plastiek verzamelen flacon, samen met de pet, dicht bij de spin. Pak het spin benen met stompe dissectie tang gehouden in de ene hand en zorgvuldig geopend vedergewicht tang tanden met de andere hand, glijden spin in het verzamelen flacon met stompe tang en snel dicht cap. Ga verder met de volgende spin en store-gif die buizen in -80 ° C vriezer wanneer u klaar bent.
    Opmerking: blijven voorzichtig te zijn bij het verplaatsen van de spin van de tang terug in de flacon. Zorg ervoor dat het verzamelen flesje en de dop is in de buurt om de spin voor de snelle overdracht en handschoenen dragen.

5. Venom Gland Dissecties

  1. Twee tot drie dagen na het gif collectie, verdoven spin in CO 2 kamer (zie stap 3.1). Vul vloeibare stikstof vervoerder en naast dissectiemicroscoop.
    Opmerking: when het werken met vloeibare stikstof, bescherming gebruik oog en cryogene handschoenen.
  2. Schone dissectie gebied en ontleden tang met oplossing die RNase en DNA besmetting elimineert. Vul een kleine petrischaal onder dissectiemicroscoop met ontleden buffer (bijvoorbeeld 1x zoutoplossing-natriumcitraat (SSC) buffer) geplaatst.
  3. Transfer spin van CO 2 kamer tot petrischaaltje en een tang om het kopborststuk snel scheiden van de buik.
  4. Houd het kopborststuk onder de dissectiemicroscoop met een pincet en plaats de chelicerae in gezichtsveld. Gebruik de scherpe uiteinden van een tweede pincet om opperhuidbesnoeiing toetreding tot de schaal van de laterale aspecten van de cheliceren. Lateraal begrijpen chelicerae behulp van de tweede pincet en trek zachtjes heen en weer tot gifklieren worden uitgetrokken.
  5. Afzonderlijke klieren uit de chelicerae (of laat gehecht aan chelicerae indien gewenst) en overbrengen in een cyrosafe 0,5 ml tube. Plaats closed buis in vloeibare stikstof.
    Opmerking: elke dissectie mag niet meer dan 15 minuten duren.
  6. Herhaal dissectie met extra spinnen tot het werk klaar. Overdrachtsbuizen van vloeibare stikstof in -80 ° C vriezer.

Representative Results

De collectie van gif en gif klier dissecties worden vaak uitgevoerd om gif eiwitten en peptiden karakteriseren op de volgorde niveau 10,11,15. Verzameld gif kan ook worden gebruikt in assays fysiologische hun functionele activiteiten 18 bepalen. De collectie gif zal gifklier genexpressie stimuleren, waardoor de klonering van specifieke toxine transcripten via RT-PCR 10,11 vergemakkelijken. Identificatie van gif eiwitten kunnen ook in een high-throughput wijze worden bereikt door integratie standaard massaspectrometrie technieken sequentie databases gegenereerd gifklier cDNA-bibliotheken 15,21. Een voorbeeld van deze werkzaamheden, uitgaande van gif en klieren verzameld via het protocol hierboven beschreven, tonen de effectiviteit, is in figuur 1.

Venom verzameld van L. hesperus volwassen vrouwtjes werd gedigereerd met trypsine en onderworpen aan een in oplossingMuDPIT analyse, die HPLC (hogedrukvloeistofchromatografie) verbindt met tandem massaspectrometrie (MS / MS). Hier werd de MuDPIT analyse uitgevoerd door de Universiteit van Arizona Proteomics Consortium. Massa's gedetecteerd peptiden en hun gedistantieerd fragmenten (dochter ionen, afgeleid uit spectra) werden vergeleken met peptidensequenties theoretisch voorspeld uit vertalingen van cDNA sequenties verkregen van een genexpressie bibliotheek opgebouwd uit L. hesperus gifklieren (klieren werden verworven door de dissectie protocol hierboven beschreven) 21. In dit experiment werden 36 eiwitten gedetecteerd alle spectra verzameld bij 99,9% waarschijnlijkheid drempel, en die ten minste één peptide gedetecteerd. Eén van de gedetecteerde eiwitten wordt ondersteund door 43 totale spectra (voorbeeld spectra getoond in Figuur 1A), overeenkomend met drie exclusieve peptiden, die 35% van de eiwitsequentie (Figuur 1B). De gedetecteerde eiwit (vertaald uit een collecte d cDNA) heeft een top BLASTP hit te latrodectin van L. tredecimguttatus (GenBank P49125.1), een e-score van 2e-46, en deelt 80% identiteit op het aminozuursequentie niveau de waargenomen in dit experiment eiwit. Latrodectin, ook bekend als alfa-Alfa-latrotoxine laag molecuulgewicht eiwit is een erkende giftcomponent zwarte weduwespinnen 22, 23, controle van de doeltreffendheid van de gepresenteerde protocol. Sommige eiwitten geïdentificeerd uit het gif overeenkomen met sequenties waarvoor geen BLAST hit wordt gevonden. Het is onduidelijk of dergelijke is het gevolg van de beperkte genomische middelen voor spinnen en de beperkte functionele informatie voor hun proteïnen, of omdat het onbekende eiwit is een gif contaminant. Niettemin gen of proteïne-expressie-analysen onderzoeken de overvloed van dergelijke nieuwe eiwit in gifklieren opzichte van andere weefsels moet blijken of het een echt giftcomponent.

ent "fo: keep-together.within-page =" always "> Figuur 1
Figuur 1: Latrodectin peptide geïdentificeerd van zwarte weduwe gif met behulp van massaspectrometrie (A) Vertegenwoordiger spectra (één van 43) gedetecteerd via MS / MS gedeelte van MuDPIT analyse van L.. hesperus gif dat werd toegewezen voorspeld vertaling van een collectie cDNA sequentie getoond in deel B Spectra toont massa-verhouding (m / z) van gedetecteerde dochter ionen heffen op de horizontale as door fragmenteren ouderpeptide (CGEEDFGEEIVK), met letters boven waarin de peptidesequentie op basis dochter ion massa. (B) Eiwit sequentie waarmee spectra in deel A werd toegewezen, waarin met rode, vetgedrukte en onderstreepte tekst de overeenkomstige sequentie van de in deel A spectra extra rode tekst (niet vet) vertegenwoordigt een peptide in dit eiwit gedetecteerd met andere verzamelde spECTRA. De eiwitsequentie is vertaald uit een cDNA sequentie verkregen uit ontleed gifklieren.

Discussion

Vergiften een belangrijke bron van fysiologisch reactieve proteïnen, peptiden en andere moleculen met de toepassingen voor geneesmiddelenonderzoek, maar ook de fundamentele aspecten van cellulaire en ecologisch onderzoek 1-3. Echter, het verzamelen van gif, in het bijzonder van gevaarlijke of kleine dieren, is een uitdagende taak. Dit protocol laat zien hoe gif en gifklieren kunnen worden afgehaald bij zwarte weduwe spinnen, en bevestigt het succes van deze aanpak via een combinatie van MuDPIT analyse van het gif en een eiwit databank afgeleid van cDNA's gekloond van gifklieren 21. Hoewel dit protocol werkt goed voor zwarte weduwen en middelgrote spinnen, andere gif verzameling technieken zijn gebruikt voor grotere mygalomorph (tarantula-achtige) spinnen, zoals directe aspiratie van gif uit giftanden in glas pipetten bv, 24. Deze laatste benadering is echter , zal niet goed werken voor kleinere spinnen die niet aggressive.

Een bijzonder kritisch aspect van het gif verzameling protocol hier beschreven is de eerste fase van voorbereiding en optimalisering van de collectie proces zodat het meer routinematige, consistente en sneller. Het protocol is in eerste instantie een uitdaging om te beheersen, maar met herhaalde proeven, wordt het gemakkelijker en sneller. Voorzichtigheid is ook aangedrongen op alle kritieke fases die de hantering van gevaarlijke spinnen, het gebruik van elektrische stroom, fine-point glazen micro haarvaten, en injectienaalden. Het is belangrijk om de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen te dragen zoals nitril handschoenen, een laboratoriumjas, lange broek en gesloten schoenen, alsook een veiligheidsbril bij het vormgeven van micro haarvaten.

Een uitdagend aspect aan gif collectie is de kleine hoeveelheid gif geproduceerd door één spin, vooral Latrodectus soorten, waarvan de bedragen worden verzameld, kunnen li zijnmited 1-2 microliter per individu best. Verkrijgen van voldoende gif voor verdere toepassingen, zoals proteïne gels of functionele testen kunnen de combinatie van gif uit meerdere individuen in één buis vereist. In dergelijke gevallen moet het gif alleen worden gecombineerd uit personen van hetzelfde geslacht, ontogenetische podium, en de bevolking gezien de erkenning van intersexual, ontwikkelingsstoornissen en geografische variabiliteit in sommige vergiften 25, 26. Spinnen kunnen vertonen ook aanzienlijke variatie in de hoeveelheid gif geproduceerd tussen individuen, waarbij kleinere hoeveelheden de recente uitputting van de klier kunnen weerspiegelen. Zo kan het raadzaam zijn om gif meerdere dagen te verzamelen na hun laatste voeding zijn. Bij geringer gif vrijkomt, dienen overmatig stroom niet toegepast op de spin, die kan de cuticula scheuren, waardoor verontreiniging van het gif met hemolymfe of dood.

Besmetting van gif monsters met spin silk of menselijke bronnen moet ook worden vermeden door gebruik van steriele of schoon materiaal. Ondanks deze uitdagingen, de verzameling van pure gif, het verlaten van de spin leeft, is te verkiezen boven methoden die gif te verkrijgen van klier homogenates (die geen gif componenten hoeft te scheiden van andere cellulaire eiwitten) en doodt de spin. Het is ook essentieel dat de steekproeven snel bevroren om eiwitafbraak te voorkomen.

De winning van gif bevordert latere gif productie, waardoor gif genexpressie stimuleren in het gif klier. Aldus omdat protocol maakt spinnen gif uitputting overleven, de klieren worden ontleed enkele dagen later (doden van de spin) op een plaats waar gif genexpressie wordt verwacht voldoende genetische studies, zoals transcript klonen 10,11 zijn. Een aantal belangrijke voorzorgsmaatregelen moeten ook worden genomen in gifklier dissecties. De nadruk moet op het gebruik van lab equipm worden geplaatstent en reagentia die vrij zijn van RNases dat RNA afbreken zijn. Zo is het raadzaam om te vegen pincet en andere herbruikbare apparatuur en oppervlakken met oplossingen die RNase en DNA verontreiniging te elimineren. Dissecties moet zo snel mogelijk en direct bevroren worden uitgevoerd om verder te zorgen RNA integriteit van het weefsel. Tenslotte moet ontledingen alleen worden uitgevoerd op verdoofd spinnen, na cephalothorax en buik snel gescheiden.

Tot slot, dit artikel geeft een geverifieerd protocol om spin gif en gifklieren verkrijgen. Venom en gifklieren zorgen voor de isolatie en karakterisering van hun eiwitten en peptiden onderdelen met behulp van proteomics en transcriptomische benaderingen. Bovendien kan gif monsters het uitgangspunt van functionele assays, die de biomedische en farmacologische potentie van de samenstellende moleculen te bepalen vertegenwoordigen. Bijna alle spinnen produceren gif, en de brede duikersiteit van gif componenten gesynthetiseerd door individuele soorten suggereert een enorme verscheidenheid aan gif moleculen worden nog ontdekt worden 13. Derhalve is dit protocol geeft een aantal instrumenten om de rijke bron van biologisch actieve moleculen in spin gif onderzoeken.

Disclosures

De auteur heeft niets te onthullen en geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

Ik dank de volgende personen voor hun hulp bij de ontwikkeling van dit protocol: Chuck Kristensen, Greta Binford, Alex K. Lancaster, Konrad Zinsmaier en Mays Imad. Massaspectrometrie en proteomics data werden verworven door de Arizona Proteomics Consortium ondersteund door NIEHS subsidie ​​ES06694 de SWEHSC, NIH / NCI subsidie ​​CA023074 de AZCC en door de BIO5 Instituut van de Universiteit van Arizona. De financiering van dit werk werd geleverd door de National Institutes of Health (Nationaal Instituut voor Algemene Geneeskunde) uit subsidies 1F32GM83661-01 en 1R15GM097714-01 aan Jessica E. Garb.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nerve and muscle stimulator (electro-stimulator)  Grass Technologies SD9 http://www.grasstechnologies.com/products/stimulators/stimsd9.html
Voltmeter RadioShack 22-223 any generic voltmeter/multimeter can be substituted
Pointed Featherweight Forceps Bioquip 4748
Plasti Dip Performix Available at Ace Hardware
25 G x 1½ in Precision Glide hypodermic syringe needle BD Medical 305127
Vacuum filter flask 1 L Nalgene DS4101-1000 smaller flask sizes may also work
Buchner Two Piece funnel, 90 mm Nalgene 4280-0900
5 μl Capillary Bores (Micro capillaries) VWR 53508-375
Mounting putty strip  Loctite Available at Ace Hardware
Fisherbrand General-Purpose Extra-Long Forceps Length: 11-13/16 in. Fisher 10-316C
SSC Buffer, 20x (pH 7.0), Molecular Grade Promega V4261 can be made from stock chemicals (150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate)
Eppendorf safe-lock tubes 0.5 ml tubes (cryogenic safe) Eppendorf 22363611
Nalgene Dewar, 1 L, HDPE, Liquid nitrogen benchtop flask Thermo Scientific 4150-1000
Rnase Away VWR 53225-514
Ultra Fine Tweezers (dissecting forceps) EMS 78310-0 similar high-quality fine point forceps can be substituted
Foot switch/pedal Linemaster Switch Corp. 491-S
Two-pronged extension clamp, with vinyl covered sleeves, 8.5 inches VWR 21570-007 similar models could be substituted
Clamp Holder VWR 89084-746 similar models could be substituted, must accommodate diameter of extension clamp rod
Magnetic base (holds extension clamp via clamp holder) VWR 300042-270 similar apparatus able to securely hold extension clamp in fixed position may be substituted
Plastic Collecting Vials (large/40 dram) Bioquip 8940
Cotton sewing thread Joann fabric and craft store 7245855 similar product could be substituted

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fry, B. G., et al. The toxicogenomic multiverse: convergent recruitment of proteins into animal venoms. Annu. Rev. Genom. Hum. G. 10, 483-511 (2009).
  2. Escoubas, P., Quinton, L., Nicholson, G. M. Venomics: unravelling the complexity of animal venoms with mass spectrometry. J. Mass. Spectrom. 43, (3), 279-295 (2008).
  3. Twede, V. D., Miljanich, G., Olivera, B. M., Bulaj, G. Neuroprotective and cardioprotective conopeptides: An emerging class of drug leads. Curr. Opin. Drug Disc. 12, (2), 231-239 (2009).
  4. Casewell, N. R., Wüster, W., Vonk, F. J., Harrison, R. A., Fry, B. G. Complex cocktails: the evolutionary novelty of venoms. Trends Ecol. Evol. 28, (4), 219-229 (2013).
  5. Vetter, R. S., Isbister, G. K. Medical aspects of spider bites. Annu. Rev. Entomol. 53, 409-429 (2008).
  6. Adams, M. E., Myers, R. A., Imperial, J. S., Olivera, B. M. Toxityping rat brain calcium channels with omega-toxins from spider and cone snail venoms. Biochemistry. 32, (47), 12566-12570 (1993).
  7. Silva, J. -P., et al. Latrophilin 1 and its endogenous ligand Lasso/Teneurin-2 form a high-affinity transsynaptic receptor pair with signaling capabilities. PNAS. 108, (29), 12113-12118 (2011).
  8. Williams, J. A., Day, M., Heavner, J. E. Ziconotide: an update and review. Expert Opin. Pharmacother. 9, (9), 1575-1583 (2008).
  9. Veiseh, M., et al. Tumor paint: a chlorotoxin:Cy5.5 bioconjugate for intraoperative visualization of cancer foci. Cancer Res. 67, (14), 6882-6888 (2007).
  10. Binford, G. J., et al. Molecular evolution, functional variation, and proposed nomenclature of the gene family that includes sphingomyelinase D in sicariid spider venoms. Mol. Biol. Evol. 26, (3), 547-566 (2009).
  11. Garb, J. E., Hayashi, C. Y. Molecular evolution of α-latrotoxin, the exceptionally potent vertebrate neurotoxin in black widow spider venom. Mol. Biol. Evol. 30, (5), 999-1014 (2013).
  12. Platnick, N. I. The World Spider Catalog., Version 14.0., DOI: 10.5531/db.iz.0001. Available online at: http://research.amnh.org/entomology/spiders/catalog/index.html (2013).
  13. Sollod, B. L., Wilson, D., Zhaxybayeva, O., Gogarten, J. P., Drinkwater, R., King, G. F. Were arachnids the first to use combinatorial peptide libraries. Peptides. 26, (1), 131-139 (2005).
  14. King, G. F., Hardy, M. C. Spider-venom peptides: Structure, pharmacology, and potential for control of insect pests. Annu. Rev. Entomol. 58, (1), 475-496 (2013).
  15. Escoubas, P., Sollod, B., King, G. F. Venom landscapes: Mining the complexity of spider venoms via a combined cDNA and mass spectrometric approach. Toxicon. 47, (6), 650-663 (2006).
  16. Kristensen, C. Comments on the natural expression and artificial extraction of venom gland components from spiders. Toxin Rev. 24, (3-4), 257-270 (2005).
  17. Ushkaryov, Y. A., Volynski, K. E., Ashton, A. C. The multiple actions of black widow spider toxins and their selective use in neurosecretion studies. Toxicon. 43, (5), 527-542 (2004).
  18. Graudins, A., et al. Cloning and activity of a novel α-latrotoxin from red-back spider venom. Biochem. Pharmacol. 83, (1), 170-183 (2012).
  19. Spagna, J. C., Moore, A. M. F. Safe immobilization by CO2 of Latrodectus hesperus (Arachnida: Theridiidae). Pan-Pac. Entomo. l. 74, (4), 210-213 (1998).
  20. Foelix, R. Biology of Spiders. Oxford University Press. (2010).
  21. Haney, R. A., Ayoub, N. A., Clarke, T. H., Hayashi, C. Y., Garb, J. E. Dramatic expansion of the black widow toxin arsenal uncovered by multi-tissue transcriptomics and venom proteomics. BMC Genomics. 15, 366 (2014).
  22. Pescatori, M., Bradbury, A., Bouet, F., Gargano, N., Mastrogiacomo, A., Grasso, A. The cloning of a cDNA encoding a protein (latrodectin) which co-purifies with the α-latrotoxin from the black widow spider Latrodectus tredecimguttatus (Theridiidae). Eur. J. Biochem. 230, (1), 322-328 (1995).
  23. Grasso, A., Pescatori, M. Structural and functional studies of latrodectin from the venom of black widow spider (Latrodectus tredecimguttatus). Adv. Exp. Med. Biol. 391, 237-243 (1996).
  24. Szeto, T. H., et al. Isolation of a funnel-web spider polypeptide with homology to mamba intestinal toxin 1 and the embryonic head inducer Dickkopf-1. Toxicon. 38, 429-442 (2000).
  25. Binford, G. J. An analysis of geographic and intersexual chemical variation in venoms of the spider Tegenaria agrestis (Agelenidae). Toxicon. 39, 955-968 (2001).
  26. Alape-Girón, A., et al. Snake venomics of the lancehead pitviper Bothrops asper: geographic, individual, and ontogenetic variations. J. Proteome. Res. 7, (8), 3556-3571 (2008).
Extractie van Venom en Venom Gland Microdissections van Spinnen voor proteoom en transcriptoom Analyses
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Garb, J. E. Extraction of Venom and Venom Gland Microdissections from Spiders for Proteomic and Transcriptomic Analyses. J. Vis. Exp. (93), e51618, doi:10.3791/51618 (2014).More

Garb, J. E. Extraction of Venom and Venom Gland Microdissections from Spiders for Proteomic and Transcriptomic Analyses. J. Vis. Exp. (93), e51618, doi:10.3791/51618 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter