Cet article fournit un protocole pour l'extraction du venin des araignées à l'aide de la stimulation électrique pour 1) procéder à la caractérisation protéomique, 2) stimuler venin expression du gène de la glande, et 3) réaliser des études fonctionnelles des venins. Ceci est suivi par une description de microdissections de la glande à venin pour des études d'expression génique.
Les venins sont chimiquement sécrétions complexes comprenant typiquement de nombreuses protéines et de peptides ayant des activités physiologiques variés. Caractérisation fonctionnelle des protéines de venin a des applications biomédicales importantes, y compris l'identification de pistes de drogue ou des sondes pour les récepteurs cellulaires. Les araignées sont le plus riche en espèces du clade des organismes venimeux, mais les venins de seulement quelques espèces sont bien comprises, en partie en raison de la difficulté liée à la collecte de quantités infimes de venin de petits animaux. Cet article présente un protocole pour la collecte du venin des araignées à l'aide de la stimulation électrique, décrivant la procédure sur la veuve noire de l'Ouest (de Latrodectus hesperus). Le venin recueilli est utile pour des analyses en aval variés, y compris l'identification directe de la protéine par spectrométrie de masse, analyses fonctionnelles, et la stimulation de l'expression du gène de venin pour les études transcriptomiques. Cette technique a l'avantage sur les protocoles que l'ISOvenin de fin à partir d'homogénats de glande entiers, qui ne séparent pas les composants de venin de véritables protéines cellulaires qui ne sont pas sécrétés dans le cadre du venin. Les résultats représentatifs montrent la détection de peptides de venin connus de l'échantillon prélevé à l'aide de la spectrométrie de masse. La procédure de collecte de venin est suivie d'un protocole pour la dissection des glandes à venin d'araignée, avec des résultats démontrant que cela conduit à la caractérisation de protéines et de peptides venin exprimée au niveau de la séquence.
Les venins sont sécrétions animales principalement injectées dans un autre animal à des fins de prédation ou de la défense, et avoir également des applications biologiques importantes avec pertinence biomédicale 1-3. Seuls certains animaux synthétisent venin, mais sa production est répandue à travers taxonomique des invertébrés (par exemple, les cnidaires, les escargots de cône, les scorpions et les araignées) et vertébrés (par exemple, des serpents, des poissons et mammifères), car il a évolué indépendamment plusieurs fois 1,4 . La caractérisation biochimique de venins montrent typiquement elles sont composées d'une grande variété de protéines et de peptides, qui agissent principalement sur les systèmes circulatoire et nerveux des animaux injectés de fournir rapidement des toxines constituantes 1. Une petite fraction des animaux venimeux peut constituer une menace pour les êtres humains, en particulier les espèces dont la répartition synanthropes 5. L'étude de la composition du venin et des activités fonctionnelles a joué un rôle important dansla caractérisation fonctionnelle des composants cellulaires de vertébrés (en particulier les canaux ioniques neuronaux 6) et dans la compréhension des processus cellulaires fondamentaux de la neurosécrétion (par exemple 7). En outre, certains peptides de venin ont des propriétés utiles dans des contextes biomédicaux, y compris leurs utilisations comme traitements pour le cancer et la douleur 8,9, et sont exploités à des candidats pistes de développement de médicaments et de sérum antivenimeux. Venins jouent également un rôle de premier plan dans la recherche écologique et évolutive 1,4,10,11, donc la collecte de ces sécrétions dangereux a de nombreux utilitaires.
Il ya> 40.000 espèces décrites d'araignées (Araneae d'ordre), et tous sauf un des plus de 100 familles d'araignées possèdent paires glandes à venin qui se terminent dans 12 crocs. La diversité des espèces d'araignées élevé suggère qu'ils représentent le plus grand clade des organismes venimeux. Cependant, la caractérisation biochimique de venins d'araignées a largely concentré sur un petit nombre d'espèces le plus souvent associés à une envenimation humaine. Des études récentes protéomique et transcriptomique de venins d'araignées indiquent qu'ils contiennent généralement beaucoup de protéines et de peptides 2,13,14 uniques. Les progrès dans le séquençage de l'ADNc à haut débit et la spectrométrie de masse peptide empreintes digitales a grandement facilité la découverte de ces protéines de venin 15. Néanmoins, ce travail commence par la collecte de venin suffisante et / ou des glandes à venin des araignées, et de la documentation détaillée de ces techniques sont peu nombreux 16.
Cet article présente un protocole pour la collecte de venin et glandes à venin de la veuve noire, qui peut être appliqué à des araignées de taille similaire. La collection de venin séparément à partir des glandes permet l'identification des protéines qui sont sécrétées dans le venin, par opposition à des protéines qui effectuent d'autres fonctions cellulaires. Veuves noires et autres Latrodectus espèces sont largement reconnus comme étant parmi les araignées les plus dangereuses en raison de leur venin neurotoxique très, ce qui provoque des douleurs sévères chez l'homme, qui est parfois accompagnée par une transpiration abondante, des contractions musculaires, hypertension, difficulté à respirer et une paralysie inégale 5. Le protocole de collecte de venin présenté ici utilise des électro-stimulation à fournir du courant électrique à des araignées anesthésiés pour provoquer des contractions et la libération de venin musculaires. gouttelettes de Venom sont rapidement collectées par des micro-capillaires et distribués dans des tubes pour le stockage de congélateur. Parce que le protocole comporte des procédures dangereuses, il ne doit être effectuée par des personnes bien formées et prudence est de mise lors des étapes clés. Le venin recueilli a de nombreuses utilisations, telles que la caractérisation et l'isolement de molécules constitutives 2, pour les expériences ou les essais fonctionnels physiologiques 18, et pour stimuler l'expression du gène de venin 11. Le protocole se termine par une description de glande à venin dissection et conservation utile pour le clonage de gènes spécifiques de venins, a été démontré que l'expression de ce qui se produire à 2-3 jours après l'épuisement du venin d'araignées de différentes 10,11.
Venins représentent une source importante de protéines physiologiquement réactifs, des peptides et autres molécules ayant des applications pour la découverte de médicaments, ainsi que pour les aspects fondamentaux de la recherche cellulaire et écologique 1-3. Toutefois, la collecte de venin, en particulier des animaux dangereux ou petits, est une tâche difficile. Ce protocole montre comment venin et glandes à venin peuvent être collectées à partir de la veuve noire, et confirme le succès de cette approche par une combinaison d'analyse MudPIT du venin et une base de données de protéines dérivées à partir d'ADNc cloné à partir de glandes à venin 21. Bien que ce protocole fonctionne bien pour les veuves noires et les araignées de taille moyenne, d'autres techniques de collecte de venin ont été employées pour agrandir mygalomorphes araignées (tarentule comme), telles que l'aspiration directe du venin des crocs en verre pipettes par exemple, 24. Cette dernière approche, cependant , ne fonctionne pas bien pour les petites entreprises qui ne sont pas des araignées aggressive.
Un aspect particulièrement important du protocole de collecte de venin est décrit ici les phases initiales de la préparation et de l'optimisation du processus de collecte de sorte qu'il devient plus systématique, uniforme et plus rapide. Le protocole est d'abord difficile à maîtriser, mais avec des essais répétés, il devient plus facile et plus rapide. La prudence est également demandé à toutes les phases critiques impliquant la manipulation d'araignées dangereuses, l'utilisation du courant électrique, à pointe fine verre micro capillaires et les aiguilles de seringues. Il est important de porter un équipement de protection individuelle approprié comme des gants en nitrile, une blouse de laboratoire, des pantalons longs et des chaussures fermées, ainsi que des lunettes lors de l'élaboration des micro capillaires.
Un autre aspect de défis à la collecte de venin est le venin petite quantité de produit par l'une quelconque d'araignée, en particulier des espèces Latrodectus, à partir de laquelle les montants peuvent être collectées limited à 1-2 microlitres par personne au mieux. L'obtention de venin suffisante pour les applications en aval, tels que les gels de protéine ou des essais fonctionnels peuvent nécessiter la combinaison de venin provenant de plusieurs individus dans un tube. Dans ce cas, le venin ne soit accompagnée de personnes du même sexe, le stade ontogénétique, et la population bénéficie de la reconnaissance de la variabilité intersexuelle, développement et géographique dans certains venins 25, 26. Les araignées peuvent également présenter des variations considérables de la quantité de venin produit entre les individus, où des quantités moindres peuvent refléter la diminution récente de la glande. Ainsi, il peut être conseillé de recueillir venin plusieurs jours après leur dernier repas. Si peu de venin est libéré, un courant excessif ne devrait pas appliqué à l'araignée, qui peut causer la cuticule à la rupture, conduisant à la contamination du venin avec hémolymphe ou la mort.
La contamination des échantillons de venin avec araignée sisources lk ou droits devraient également être évités grâce à l'utilisation de matériel stérile ou propre. Malgré ces difficultés, la collecte de venin pur, en laissant l'araignée vivant, est préférable aux méthodes qui obtiennent venin à partir d'homogénats de glandes (qui ne se séparent pas des composants de venin provenant d'autres protéines cellulaires) et tuent l'araignée. Il est également essentiel de veiller à ce que les échantillons sont congelés rapidement pour éviter la dégradation des protéines.
L'extraction de venin favorise la production de venin ultérieur, stimulant ainsi l'expression du gène de venin dans la glande à venin. Ainsi, parce que ce protocole permet d'araignées pour survivre venin épuisement, leurs glandes peuvent être disséqués quelques jours plus tard (tuer l'araignée) à un point où il est prévu l'expression du gène de venin suffisante pour des études génétiques, tels que la transcription clonage 10,11. Plusieurs précautions doivent également être prises dans les dissections de glandes à venin. L'accent devrait être mis sur l'utilisation laboratoire équipement et des réactifs qui sont exempts de RNases qui dégradent l'ARN. Ainsi, il est recommandé d'essuyer des pinces et autres instruments non jetables et les surfaces avec des solutions qui éliminent la contamination de RNase et ADN. Les dissections doivent être effectuées aussi rapidement que possible et directement congelé pour assurer davantage l'intégrité de l'ARN du tissu. Enfin, les dissections ne doivent être effectuées sur les araignées anesthésiés, après son céphalothorax et l'abdomen sont rapidement séparés.
En conclusion, cet article fournit un protocole vérifié pour obtenir venin d'araignée et glandes à venin. Venom et glandes à venin permettent l'isolement et la caractérisation de leurs protéines et de peptides composants en utilisant une approche protéomique et transcriptomique. En outre, des échantillons de venin peuvent représenter le point de départ d'analyses fonctionnelles, qui déterminent le potentiel biomédical et pharmacologique de leurs molécules constitutives. Presque toutes les araignées produisent venin, et la large plongeursité des composants du venin synthétisés par espèce suggère une grande diversité de molécules de venin sont encore à découvrir 13. Par conséquent, ce protocole fournit des outils pour étudier la riche source de molécules biologiquement actives présentes dans les venins d'araignée.
The authors have nothing to disclose.
Je remercie les personnes suivantes pour leur aide dans l'élaboration de ce protocole: Chuck Kristensen, Greta Binford, Alex K. Lancaster, Konrad Zinsmaier, et Mays Imad. Données de spectrométrie de masse et protéomique ont été acquis par l'Arizona protéomique Consortium soutenu par NIEHS subvention ES06694 à la SWEHSC, NIH / NCI subvention CA023074 à l'AZCC et par l'Institut BIO5 de l'Université de l'Arizona. Le financement de ce travail a été fourni par le National Institutes of Health (Institut national de médecine générale) de subventions 1F32GM83661-01 et 1R15GM097714-01 à Jessica E. Garb.
Nerve and muscle stimulator (electro-stimulator) | Grass Technologies | SD9 | http://www.grasstechnologies.com/products/stimulators/stimsd9.html |
Voltmeter | RadioShack | 22-223 | any generic voltmeter/multimeter can be substituted |
Pointed Featherweight Forceps | Bioquip | 4748 | |
Plasti Dip | Performix | Available at Ace Hardware | |
21 G X 1 1/2in Precision Glide hypodermic syringe needle | BD Medical | 305190 | |
Vacuum filter flask 1L | Nalgene | DS4101-1000 | smaller flask sizes may also work |
Buchner Two Piece funnel, 90 mm | Nalgene | 4280-0900 | |
5 microlitter Capillary Bores (Micro capillaries) | VWR | 53508-375 | |
Mounting putty strip | Loctite | Available at Ace Hardware | |
Fisherbrand* General-Purpose Extra-Long Forceps Length: 11-13/16 in. | Fisher | 10-316C | |
SSC Buffer, 20X (pH 7.0), Molecular Grade | Promega | V4261 | can be made from stock chemicals (150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate) |
Eppendorf safe-lock tubes 0.5 mL tubes (cryogenic safe) | Eppendorf | 22363611 | |
Nalgene Dewar, 1L, HDPE, Liquid nitrogen benchtop flask | Thermo Scientific | 4150-1000 | |
Rnase Away | VWR | 53225-514 | |
Ultra Fine Tweezers (dissecting forceps) | EMS | 78310-0 | similar high-quality fine point forceps can be substituted |
Foot switch/pedal | Linemaster Switch Corp. | 491-S | |
Two-pronged extension clamp, with vinyl covered sleeves, 8.5 inches | VWR | 21570-007 | similar models could be substituted |
Clamp Holder | VWR | 89084-746 | similar models could be substituted, must accommodate diameter of extension clamp rod |
Magnetic base (holds extension clamp via clamp holder) | VWR | 300042-270 | similar apparatus able to securely hold extension clamp in fixed position may be substituted |
Plastic Collecting Vials (large/40 dram) | Bioquip | 8940 | |
Cotton sewing thread | Threadart.com | THRCOT9 | similar product could be substituted |