Summary
इस अनुच्छेद 1 के क्रम में बिजली की उत्तेजना का उपयोग कर मकड़ियों से जहर की निकासी के लिए एक प्रोटोकॉल), प्रोटिओमिक लक्षण वर्णन आचरण 2) विष ग्रंथि जीन अभिव्यक्ति को बढ़ावा, और 3) विष के कार्यात्मक अध्ययन करते प्रदान करता है. इस जीन की अभिव्यक्ति के अध्ययन के लिए विष ग्रंथि microdissections के वर्णन के बाद है.
Abstract
विष रासायनिक आम तौर पर विभिन्न शारीरिक गतिविधियों के साथ कई प्रोटीन और पेप्टाइड्स शामिल जटिल स्राव हैं. विष प्रोटीन के कार्यात्मक लक्षण वर्णन सेलुलर रिसेप्टर्स के लिए दवा सुराग या जांच की पहचान सहित महत्वपूर्ण जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों, है. मकड़ियों विषैला जीवों के अधिकांश प्रजातियों अमीर क्लेड हैं, लेकिन केवल कुछ प्रजातियों के विष के कारण छोटे जानवरों से जहर की मात्रा मिनट का संग्रह के साथ जुड़े कठिनाई के भाग में, अच्छी तरह से समझ रहे हैं. इस पत्र में पश्चिमी काले विधवा (Latrodectus संध्या का तारा) पर प्रक्रिया का प्रदर्शन, बिजली की उत्तेजना का उपयोग कर मकड़ियों से विष के संग्रह के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है. एकत्र विष मास स्पेक्ट्रोमेट्री के माध्यम से प्रत्यक्ष प्रोटीन की पहचान, कार्यात्मक assays, और transcriptomic अध्ययन के लिए विष जीन अभिव्यक्ति की उत्तेजना सहित विभिन्न बहाव के विश्लेषण के लिए उपयोगी है. इस तकनीक कि आईएसओ प्रोटोकॉल से अधिक लाभ हैविष के हिस्से के रूप में स्रावित नहीं कर रहे हैं कि सेलुलर प्रोटीन से वास्तविक विष घटकों को अलग नहीं है जो पूरी ग्रंथि homogenates, से देर विष. प्रतिनिधि परिणाम मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग कर एकत्र नमूना से जाना जाता विष पेप्टाइड का पता लगाने के प्रदर्शित करता है. विष संग्रह प्रक्रिया के परिणाम इस क्रम स्तर पर विष-व्यक्त प्रोटीन और पेप्टाइड्स के लक्षण वर्णन की ओर जाता है कि प्रदर्शन के साथ, मकड़ी विष ग्रंथियों विदारक के लिए एक प्रोटोकॉल के बाद है.
Introduction
विष मुख्य रूप से शिकार या रक्षा उद्देश्यों के लिए एक और जानवर में इंजेक्शन पशु स्राव कर रहे हैं, और भी जैव चिकित्सा प्रासंगिकता 1-3 से महत्वपूर्ण जैविक आवेदन किया है. केवल कुछ जानवरों जहर synthesize, लेकिन यह विकसित स्वतंत्र रूप से किया गया है क्योंकि इसके उत्पादन, अकशेरुकी (जैसे, निडारियंस, कोन घोंघे, बिच्छू, और मकड़ियों) और रीढ़ (जैसे, सांप, कुछ मछली और स्तनधारियों) भर श्रेणी विभाजन व्यापक है कई बार 1,4 . विष का बायोकेमिकल लक्षण वर्णन आम तौर पर वे काफी हद तक तेजी घटक विषाक्त पदार्थों 1 वितरित करने के लिए इंजेक्शन पशुओं के संचार और नर्वस सिस्टम पर काम करते हैं, जो प्रोटीन और पेप्टाइड्स की एक विस्तृत विविधता से बना रहे हैं दिखा. विषैला जानवरों का एक छोटा सा अंश मानव, synanthropic वितरण 5 के साथ विशेष रूप से प्रजातियों के लिए खतरा पैदा हो सकता है. विष रचना और कार्यात्मक गतिविधियों का अध्ययन एक महत्वपूर्ण भूमिका में निभाई हैकशेरुकी सेलुलर घटकों (विशेष रूप से न्यूरोनल आयन चैनल) 6 का और मौलिक सेलुलर प्रक्रियाओं (जैसे neurosecretion) 7 elucidating में कार्यात्मक विशेषता. इसके अलावा, चुनिंदा विष पेप्टाइड्स कैंसर और दर्द 8,9 के लिए उपचार के रूप में उनके उपयोग सहित जैव चिकित्सा संदर्भों में उपयोगी गुणों, है, और उम्मीदवार दवा जाता है और विषरोधक विकास के लिए खनन कर रहे हैं. विष भी इस प्रकार इन खतरनाक स्राव का संग्रह कई सुविधाएं है, पारिस्थितिकी और विकासवादी अनुसंधान 1,4,10,11 में प्रमुख भूमिका निभाते हैं.
40,000 वर्णित मकड़ी (आदेश Araneae) की प्रजातियों, और नुकीले 12 में समाप्त कि विष ग्रंथियों बनती अधिकारी 100 से अधिक मकड़ी परिवारों में से एक है, लेकिन सभी> कर रहे हैं. मकड़ियों के उच्च प्रजाति विविधता वे विषैला जीव की सबसे बड़ी क्लेड का प्रतिनिधित्व करते हैं कि पता चलता है. हालांकि, मकड़ी विष का जैव रासायनिक लक्षण वर्णन एल हैargely सबसे अधिक बार मानव envenomation के साथ जुड़े प्रजातियों की एक छोटी संख्या पर ध्यान केंद्रित किया. मकड़ी विष का हाल ही में प्रोटिओमिक और transcriptomic पढ़ाई वे आम तौर पर कई अद्वितीय प्रोटीन और पेप्टाइड 2,13,14 होते संकेत मिलता है. उच्च throughput सीडीएनए अनुक्रमण और मास स्पेक्ट्रोमेट्री पेप्टाइड फिंगरप्रिंटिंग के क्षेत्र में अग्रिम बहुत इन विष प्रोटीन 15 की खोज में मदद की है. फिर भी, इस तरह के काम में इस तरह की तकनीक के लिए पर्याप्त विष और / या मकड़ियों से विष ग्रंथियों, और विस्तृत प्रलेखन के संग्रह के साथ शुरू होता है 16 कुछ कर रहे हैं.
इस पत्र में समान आकार मकड़ियों के लिए लागू किया जा सकता है जो काले विधवा मकड़ियों से विष और विष ग्रंथियों के संग्रह के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है. अलग ग्रंथियों से विष का संग्रह अन्य सेलुलर कार्यों प्रदर्शन प्रोटीन के लिए विरोध के रूप में जहर में स्रावित होते हैं कि प्रोटीन की पहचान में सक्षम बनाता है. काले विधवाओं और अन्य एलatrodectus प्रजाति व्यापक रूप से की वजह से कभी कभी विपुल पसीना, मांसपेशियों में संकुचन, उच्च रक्तचाप, साँस लेने में कठिनाई और बद पक्षाघात 5 के साथ है जो मानव में गंभीर दर्द का कारण बनता है जो उनके अत्यधिक न्यूरोटौक्सिक जहर, के लिए सबसे खतरनाक मकड़ियों के बीच में होने के रूप में पहचाने जाते हैं. यहाँ प्रस्तुत विष संग्रह प्रोटोकॉल मांसपेशियों में संकुचन और विष की रिहाई बटोर anesthetized मकड़ियों के लिए मौजूदा बिजली देने के लिए विद्युत उत्तेजना का उपयोग करता है. जहर बूंदों जल्दी सूक्ष्म केशिकाओं के साथ एकत्र और फ्रीजर भंडारण के लिए ट्यूबों में तिरस्कृत कर रहे हैं. प्रोटोकॉल खतरनाक प्रक्रियाओं शामिल है, यह केवल अच्छी तरह से प्रशिक्षित व्यक्तियों द्वारा किया जाना चाहिए और सावधानी महत्वपूर्ण कदम पर आग्रह किया है. एकत्र विष ऐसे लक्षण वर्णन और शारीरिक प्रयोगों या कार्यात्मक assays के 18 के लिए घटक अणु 2, के अलगाव के रूप में कई का उपयोग करता है, और विष जीन अभिव्यक्ति 11 को प्रोत्साहित करने के लिए. प्रोटोकॉल एक Descr के साथ समाप्तविष ग्रंथि विच्छेदन और विष-विशिष्ट जीन की क्लोनिंग के लिए उपयोगी संरक्षण के iption, अभिव्यक्ति, जिनमें से अलग मकड़ियों 10,11 में जहर कमी निम्नलिखित 2-3 दिनों घटित दिखाया गया है.
Protocol
विद्युत उत्तेजक उपकरण 1. तैयारी
- आउटलेट और बाहरी संकेत इनपुट के लिए बाहरी पैर पेडल संलग्न करने के लिए विद्युत उत्तेजक शक्ति कॉर्ड कनेक्ट करें.
नोट: विद्युत तारों को ठीक से अछूता किया जाना चाहिए और उजागर धातु पहुंचाने वर्तमान छुआ नहीं होना चाहिए. सुरक्षा के लिए लेटेक्स या nitrile दस्ताने पहनें. पावर कॉर्ड संलग्न और तार संलग्न जब विद्युत उत्तेजक बिजली स्विच बंद की स्थिति में होना चाहिए. - विद्युत उत्तेजक पर लाल उत्पादन टर्मिनल के लिए सकारात्मक इलेक्ट्रोड कनेक्ट (polarity स्विच सामान्य मोड में है) और काला उत्पादन टर्मिनल के लिए नकारात्मक इलेक्ट्रोड कनेक्ट. नोट: प्रत्येक बिजली तार एक मगरमच्छ क्लिप में समाप्त होना चाहिए.
- निम्नलिखित की सिफारिश की प्रारंभिक सेटिंग्स को सेट उत्तेजक: वोल्टेज = 7 वी, प्रति सेकंड आवृत्ति = 1 दालों, देरी = 0 मिसे, अवधि = 200 मिलीसेकेंड, जुड़वां दालों बंद = = नियमित स्विच, और मोड स्विच.
- Voltme को मगरमच्छ क्लिप संलग्न द्वारा इलेक्ट्रोड की टेस्ट उत्पादनआतंकवाद सकारात्मक और नकारात्मक परीक्षण होता है. उत्तेजक बिजली स्विच ऑन करें और पैर पेडल के साथ वर्तमान पहुँचा.
Immobilizing संदंश और अन्य सामग्री से 2. तैयारी
- तरल प्लास्टिक कोटिंग में फेदरवेट संदंश की एक शूल डुबकी और कोटिंग सूख जाने के लिए चार घंटे इंतजार. कसकर कपास धागा सिलाई की एक परत के साथ विरोध शूल की नोक से 15 मिमी लपेट, और एक गाँठ में अंत बांधने से धागा सुरक्षित.
नोट: प्लास्टिक कोटिंग वर्तमान मंदबुद्धि इन्सुलेशन प्रदान करता है, जबकि धागा, विद्युत चालकता को बढ़ावा देता है कि एक आवेदन नमकीन घोल को अवशोषित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. - तेज कैंची के साथ कुंद चमड़े के नीचे सुई की नोक कट और रेत कागज के साथ उद्घाटन चिकनी. ट्यूबिंग के माध्यम से एक निर्वात बेकार जाल (जैसे, वैक्यूम फिल्टर कुप्पी) के लिए सुई संलग्न.
नोट: सुई पानी दूर सक्शन और बहना, और उत्तेजक इलेक्ट्रोड के द्वारा बनाई गई सर्किट पूरा करने के लिए की सेवा करेंगे. सुई उद्घाटन म्यूसेंट clogging बिना निर्वात समाधान करने के लिए पर्याप्त अभी तक बड़े, मकड़ी नुकसान नहीं करने के लिए काफी छोटा हो (उदाहरण के लिए, 25 जी गेज में एक्स 1 आधा, माल की सूची देखें). - स्थिति फेदरवेट संदंश क्षैतिज शीर्ष पर संदंश की प्लास्टिक लेपित शूल साथ देखने का एक विदारक माइक्रोस्कोप के क्षेत्र के अंतर्गत एक चुंबकीय आधार या निर्धारित स्टैंड तंत्र के लिए सुरक्षित एक vinyl से ढके दो आयामी क्लैंप का उपयोग कर एक कसकर बंद की स्थिति में और धागा तल पर शूल लेपित.
नोट: दो आयामी दबाना एक दबाना धारक द्वारा चुंबकीय आधार करने के लिए एक स्थिर स्थिति में बनाए रखा है (माल की सूची देखें). एक रबर बैंड कसकर एक बार शुरू की मकड़ी के चारों ओर एक बंद की स्थिति में फेदरवेट संदंश रखने के लिए अतिरिक्त दबाव जोड़ने के लिए, अगले दबाना धारक को, फेदरवेट संदंश का prongs के चारों ओर सुरक्षित किया जा सकता है. - धागे के अपस्ट्रीम संदंश 'नीचे शूल को सकारात्मक इलेक्ट्रोड मगरमच्छ क्लिप संलग्न और धातु निर्वात सुई कुंद करने के लिए नकारात्मक मगरमच्छ क्लिप देते हैं. धागा और मगरमच्छ क्लिप और कुंद वैक्यूम सुई पर नकारात्मक नेतृत्व रखने के बीच संदंश शूल पर सकारात्मक नेतृत्व रखकर वाल्टमीटर के साथ मौजूदा टेस्ट सर्किट. प्रेस पैर पेडल पर्याप्त वर्तमान पता चला है सुनिश्चित करने और पर्याप्त वर्तमान पता चला है कि अगर सुराग निकालने के लिए.
- विष संग्रह के लिए कई microcapillary ट्यूब तैयार करें. एक लेम्प बर्नर लौ पर क्षैतिज संदंश से आयोजित अंत रखने, एक दस्ताने हाथ के साथ एक छोर पर और बाँझ धातु संदंश के साथ दूसरे छोर पर एक भी microcapillary ट्यूब पकड़ो. एक स्थिर स्थिति में दूसरे छोर पकड़े, जबकि दूर एक लम्बी नोक बनाने के लिए लौ से धातु संदंश के साथ microcapillary पर खींचो.
नोट: microcapillaries आसानी फ्रैक्चर कर सकते हैं के रूप में सुरक्षात्मक eyewear पहनते हैं. - एक पेट्री डिश में एक बढ़ते पोटीन पट्टी पर तैयार microcapillaries आराम करें. Microcapillary एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत समाप्त होता है की जांच करने और निष्फल धातु संदंश के साथ निकाला अंत में एक छोटा सा, beveled खोलने बनाने.
- लाबाँझ 0.5 मिलीलीटर ट्यूब की बेल चर संख्या. ट्यूब बाँझ बाँझ, विआयनीकृत पानी जोड़ें (जैसे, autoclaved विआयनीकृत पानी की 5 μl). बंद ट्यूब और बर्फ पर जगह ट्यूब.
- एक बीकर में नमकीन घोल तैयार करें और autoclaved पानी के साथ एक दूसरे बीकर भरें.
संदंश में मकड़ी के 3. स्थिरीकरण
- सीओ 2 टैंक को चालू करें और बंद प्लास्टिक का संग्रह शीशी से मकड़ी हस्तांतरण लंबी धातु संदंश का उपयोग कंपनी में 2 कक्ष (माल की सूची देखें).
नोट: काले विधवा मकड़ियों खतरनाक जहर है; हमेशा इस प्रोटोकॉल के दौरान दस्ताने पहनते हैं. - 5-10 मिनट के लिए या जब तक चैम्बर में मकड़ी रखें anesthetized और धीरे लंबे संदंश के साथ prodded जब कोई लंबे समय तक चलती है. खारा समाधान के साथ संदंश पर धागा गीला करने के लिए हस्तांतरण विंदुक का प्रयोग करें.
नोट: काला विधवाओं के लिए सीओ 2 संज्ञाहरण मापदंडों पर दिशा निर्देशों के लिए, स्पागना और मूर 19 को देखें. - सीओ 2 से anesthetized मकड़ी निकालते हैंकुंद विदारक संदंश और दस्ताने हाथ का उपयोग कर अपने पूर्वकाल पैरों से इसे उठा द्वारा चैम्बर. संदंश तंत्र featherweight को anesthetized मकड़ी ले जाएँ. बंद फेदरवेट संदंश की अलग कोणों और prongs के बीच में मकड़ी के cephalothorax जगह और prongs के स्थान पर कसकर आयोजित किया जाता है, लेकिन कुचल नहीं किया जा रहा है मकड़ी सुनिश्चित करने के लिए बंद बंद करने के लिए अनुमति देते हैं. सकारात्मक इलेक्ट्रोड नीचे शूल के साथ जुड़ा रहता है, जबकि मकड़ी धागा लेपित शूल पर आराम कर, (मकड़ी शरीर रचना के लिए मार्गदर्शन के लिए Foelix 20 देखें) नीचे की ओर पृष्ठवर्म पीठ की ओर से रखा गया है, और पृष्ठवर्म के उदर पक्ष प्लास्टिक कोटिंग सामना करना पड़ रहा है कि यह सुनिश्चित करें. मकड़ी से निपटने जब जल्दी से काम करते हैं.
- मकड़ी के chelicerae तक खुर्दबीन बढ़ाई, ध्यान, और प्रकाश स्रोत विदारक समायोजित करें और नुकीले स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं.
4. जहर संग्रह
- वैक्यूम ऑन करें और एक दूसरे कुंद इत्तला दे दी सिरिंज n का उपयोग पानी के घोल के साथ मकड़ी chelicerae स्प्रेeedle. दोष को दूर करने के लिए वैक्यूम सुई के साथ पानी दूर सक्शन.
- मकड़ी मंच से जुड़ी नकारात्मक इलेक्ट्रोड के साथ वैक्यूम सुई टच और पैर पेडल एक या अधिक बार साथ पल्स उद्धार. यदि आवश्यक हो तो वैक्यूम दूर बहना.
नोट: मकड़ी मंच chelicerae और endites (विस्तृत मकड़ी शरीर रचना के लिए Foelix 20 देखें) के बीच पृष्ठीय सतह पर chelicerae को मुंह पीछे अंदर है. नोट: प्रत्येक नाड़ी के साथ, मकड़ी के पैरों अनुबंध, और विष नुकीले से उभरते स्पष्ट बूंदों के रूप में दिखाई देगा. - लीजिए विष (समाधान केशिका में ले लिया जाएगा) पानी या बफर समाधान के साथ 0.5 मिलीलीटर ट्यूब में microcapillary टिप और स्थानांतरण केशिका टिप के साथ बूंदों.
नोट: hemolymph संदूषण और मौत का कारण हो सकता है जो केशिका साथ मकड़ी puncturing से बचें. इसके अलावा spinnerets से रेशम और गोंद के साथ केशिका के संक्रमण से बचने. - और डी (अंत संग्रह टिप के विपरीत पर) microcapillary ट्यूब एडाप्टर के साथ स्थानांतरण सिरिंज संलग्नवापस ट्यूब में ispense विष समाधान. बर्फ पर ट्यूब रखो.
नोट: पास के एक sharps कंटेनर में अपशिष्ट केशिकाओं के निपटान के. - मकड़ी के करीब अपनी टोपी, के साथ साथ, खुले प्लास्टिक एकत्रित शीशी रखें. कुंद विदारक संदंश एक हाथ में आयोजित की और ध्यान से खुला फेदरवेट कुंद संदंश और जल्दी से करीब टोपी के साथ शीशी का संग्रह में मकड़ी रपट, दूसरे हाथ से prongs के संदंश के साथ सावधानी से मकड़ी पैर समझ. जब समाप्त -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में अगले मकड़ी और दुकान विष युक्त ट्यूबों के साथ आगे बढ़ें.
नोट: वापस शीशी में संदंश से मकड़ी जब चलती सावधानी बरतें जारी है. यकीन एकत्रित शीशी और टोपी अपनी तेजी से हस्तांतरण के लिए मकड़ी के लिए आस-पास है बनाओ और दस्ताने पहनते हैं.
5. विष ग्रंथि Dissections
- दो से तीन दिनों विष संग्रह के बाद, कंपनी में 2 कक्ष (3.1 कदम देखें) मकड़ी anesthetize. माइक्रोस्कोप विदारक के बगल में तरल नाइट्रोजन वाहक और जगह भरें.
नोट: कएन तरल नाइट्रोजन, उपयोग नेत्र सुरक्षा और क्रायोजेनिक दस्ताने के साथ काम करना. - साफ विच्छेदन क्षेत्र और RNase और डीएनए संदूषण समाप्त कि समाधान के साथ विदारक संदंश. बफर (जैसे, 1x खारा सोडियम साइट्रेट (एसएससी) बफर) विदारक साथ खुर्दबीन विदारक के नीचे रखा एक छोटा सा पेट्री डिश भरें.
- सीओ 2 चैम्बर से स्थानांतरण मकड़ी पकवान पेट्री और जल्दी से पेट से cephalothorax अलग संदंश का उपयोग करने के लिए.
- संदंश के साथ विदारक माइक्रोस्कोप के तहत cephalothorax पकड़ो और देखने के क्षेत्र में chelicerae स्थिति. Chelicerae के पार्श्व पहलुओं को पृष्ठवर्म शामिल होने छल्ली कटौती करने के लिए संदंश की एक दूसरी जोड़ी के तेज सिरों का प्रयोग करें. Laterally संदंश की दूसरी जोड़ी का उपयोग chelicerae समझ, और विष ग्रंथियों बाहर खींच रहे हैं जब तक धीरे आगे पीछे tug.
- Chelicerae से अलग ग्रंथियों एक cyrosafe 0.5 मिलीलीटर ट्यूब और हस्तांतरण (या छोड़ अगर वांछित chelicerae से जुड़ी). प्लेस Closतरल नाइट्रोजन में एड ट्यूब.
नोट: प्रत्येक विच्छेदन कोई अधिक 15 मिनट लेना चाहिए. - जब तक समाप्त अतिरिक्त मकड़ियों के साथ विच्छेदन दोहराएँ. -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में तरल नाइट्रोजन से स्थानांतरण ट्यूबों.
Representative Results
विष और विष ग्रंथि dissections का संग्रह अक्सर अनुक्रम स्तर 10,11,15 में विष प्रोटीन और पेप्टाइड चिह्नित करने के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं. एकत्र विष भी उनके कार्यात्मक गतिविधियों 18 निर्धारित करने के लिए शारीरिक assays में इस्तेमाल किया जा सकता है. विष का संग्रह जिससे आरटी-पीसीआर 10,11 के माध्यम से विशिष्ट विष टेप की क्लोनिंग की सुविधा, विष ग्रंथि जीन अभिव्यक्ति को प्रोत्साहित करेंगे. विष प्रोटीन की पहचान भी विष ग्रंथि सीडीएनए पुस्तकालयों 15,21 से उत्पन्न अनुक्रम डेटाबेस के साथ मानक मास स्पेक्ट्रोमेट्री तकनीक को एकीकृत करके एक उच्च throughput ढंग से पूरा किया जा सकता है. इस तरह के काम, विष और ऊपर विस्तृत प्रोटोकॉल का उपयोग एकत्र ग्रंथियों से शुरू अपने प्रभाव का प्रदर्शन का एक उदाहरण है, चित्रा 1 में सचित्र है.
जहर एल से एकत्र संध्या का तारा वयस्क महिलाओं समाधान में एक को trypsin के साथ पचा और अधीन थामिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस / एमएस) के लिए एचपीएलसी (उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी) जो लिंक mudpit विश्लेषण,. यहाँ mudpit विश्लेषण एरिज़ोना प्रोटिओमिक्स कंसोर्टियम विश्वविद्यालय द्वारा किया गया था. (स्पेक्ट्रा से अनुमानित बेटी आयनों) का पता चला पेप्टाइड्स की जनता और उनके अलग टुकड़ों सैद्धांतिक रूप से एल से निर्मित एक जीन अभिव्यक्ति पुस्तकालय से प्राप्त सीडीएनए दृश्यों के अनुवाद से भविष्यवाणी पेप्टाइड दृश्यों की तुलना में थे संध्या का तारा विष ग्रंथियों 21 (ग्रंथियों विच्छेदन प्रोटोकॉल द्वारा हासिल किया गया ऊपर वर्णित). इस प्रयोग में, 36 प्रोटीन 99.9% संभावना दहलीज पर, सब एकत्र स्पेक्ट्रा से पता चला है, और कम से कम एक पेप्टाइड का पता लगाया निहित थे. पता चला प्रोटीन के एक प्रोटीन अनुक्रम (चित्रा 1 बी) के 35% को कवर, तीन विशेष पेप्टाइड्स के लिए इसी, 43 कुल स्पेक्ट्रा (चित्रा 1 ए में दिखाया कापी स्पेक्ट्रा) द्वारा समर्थित है. एक collecte से अनुवादित पता लगाया प्रोटीन ( डी सीडीएनए) एल से latrodectin करने के लिए एक शीर्ष BLASTp मारा गया इस प्रयोग में पाया प्रोटीन के साथ अमीनो एसिड अनुक्रम स्तर पर 2 ई-46 के एक ई स्कोर के साथ tredecimguttatus (परिग्रहण P49125.1), और शेयर 80% पहचान. भी अल्फा-latrotoxin कम आणविक भार प्रोटीन के रूप में जाना जाता है जो Latrodectin, काले विधवा की एक मान्यता प्राप्त जहर घटक प्रस्तुत प्रोटोकॉल की प्रभावशीलता की पुष्टि, 22, 23 मकड़ियों है. जहर से पहचान कुछ प्रोटीन कोई बम विस्फोट हिट पाया जाता है, जिसके लिए दृश्यों के अनुरूप हैं. अज्ञात प्रोटीन एक विष संदूषक का प्रतिनिधित्व करता है, या क्योंकि यह कारण मकड़ियों के लिए उपलब्ध सीमित जीनोमिक संसाधनों के साथ ही उनके प्रोटीन के लिए सीमित कार्यात्मक जानकारी के लिए इस तरह के एक परिणाम है कि क्या यह स्पष्ट नहीं है. फिर भी, जीन या प्रोटीन अभिव्यक्ति यह एक वास्तविक विष घटक है कि क्या प्रकट करना चाहिए अन्य ऊतकों के सापेक्ष विष ग्रंथियों में इस तरह के एक उपन्यास प्रोटीन की प्रचुरता की जांच का विश्लेषण करती है.
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चित्रा 1: मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग कर काले विधवा विष से पहचान Latrodectin पेप्टाइड (ए) प्रतिनिधि स्पेक्ट्रा (43 में से एक) एल की mudpit विश्लेषण के एमएस / एमएस भाग के माध्यम से पता चला. संध्या का तारा भाग बी स्पेक्ट्रा में दिखाया गया एक एकत्र सीडीएनए अनुक्रम की भविष्यवाणी अनुवाद करने के लिए सौंपा गया था जो विष जन शीर्ष पर पत्र के साथ, (CGEEDFGEEIVK) माता पिता पेप्टाइड fragmenting द्वारा उत्पादित क्षैतिज अक्ष पर पाया बेटी आयनों का अनुपात (मी / z) को चार्ज करने से पता चलता है भाग एक में जो स्पेक्ट्रा के लिए बेटी आयन जनता पर आधारित पेप्टाइड अनुक्रम का संकेत है. (बी) प्रोटीन अनुक्रम, लाल बोल्ड में दिखा, सौंपा और पाठ भाग एक में दिखाया गया स्पेक्ट्रा, अतिरिक्त लाल पाठ (बोल्ड नहीं) से इसी अनुक्रम को रेखांकित किया गया था इस प्रोटीन में एक और पेप्टाइड अन्य एकत्र सपा के साथ पाया प्रतिनिधित्व करता हैectra. प्रोटीन अनुक्रम विच्छेदित विष ग्रंथियों से प्राप्त एक सीडीएनए अनुक्रम से अनुवाद किया है.
Discussion
विष एक physiologically प्रतिक्रियाशील प्रोटीन, पेप्टाइड्स और दवाओं की खोज के लिए आवेदन पत्र के साथ अन्य अणुओं का महत्वपूर्ण स्रोत है, साथ ही के लिए सेलुलर और पारिस्थितिक अनुसंधान 1-3 के बुनियादी पहलुओं का प्रतिनिधित्व करते हैं. हालांकि, विशेष रूप से खतरनाक या छोटे जानवरों से विष का संग्रह, एक चुनौतीपूर्ण कार्य है. इस प्रोटोकॉल विष और विष ग्रंथियों काले विधवा मकड़ियों से एकत्र किया जा सकता है दर्शाता है कि कैसे, और विष से क्लोन विष का mudpit विश्लेषण और cDNAs से ली गई एक प्रोटीन डेटाबेस का एक संयोजन के माध्यम से इस दृष्टिकोण की सफलता 21 ग्रंथियों की पुष्टि करता है. इस प्रोटोकॉल काले विधवाओं और मध्यम आकार मकड़ियों, के लिए अच्छी तरह से काम करता है जबकि अन्य विष संग्रह तकनीकों हालांकि, इस तरह pipettes जैसे, 24. यह बाद दृष्टिकोण गिलास में नुकीले से जहर की प्रत्यक्ष आकांक्षा के रूप में बड़ा mygalomorph (टारेंटयुला की तरह) मकड़ियों, के लिए नियोजित किया गया है , aggressi नहीं कर रहे हैं कि छोटे आकार मकड़ियों के लिए अच्छी तरह से काम नहीं चलेगाve.
यह अधिक दिनचर्या, लगातार और तेज हो जाता है इतना है कि यहाँ वर्णित विष संग्रह प्रोटोकॉल में से एक विशेष रूप से महत्वपूर्ण पहलू संग्रह प्रक्रिया की तैयारी और अनुकूलन के प्रारंभिक चरणों है. प्रोटोकॉल गुरु को शुरू में चुनौती दे रहा है, लेकिन दोहराया परीक्षण के साथ, यह आसान है और तेजी हो जाता है. सावधानी भी खतरनाक मकड़ियों की हैंडलिंग, विद्युत धारा, ठीक बिंदु कांच सूक्ष्म केशिकाओं, और सिरिंज सुई के इस्तेमाल को शामिल सभी महत्वपूर्ण चरणों में से आग्रह किया है. यह सूक्ष्म केशिकाओं को आकार देने जब Eyewear, साथ ही इस तरह के nitrile दस्ताने, एक प्रयोगशाला कोट, लंबे पैंट और बंद जूते के रूप में उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनने के लिए महत्वपूर्ण है.
विष संग्रह करने के लिए एक और चुनौतीपूर्ण पहलू मात्रा ली हो सकता एकत्र जहाँ से किसी भी एक मकड़ी, विशेष रूप से Latrodectus प्रजातियों, द्वारा उत्पादित विष की छोटी राशि हैपर सबसे अच्छा व्यक्ति प्रति 1-2 microliters के लिए mited. ऐसे प्रोटीन जैल या कार्यात्मक assays के रूप में नीचे की ओर अनुप्रयोगों के लिए पर्याप्त विष प्राप्त एक ट्यूब में कई व्यक्तियों से विष के संयोजन की आवश्यकता हो सकती. ऐसे मामलों में, विष केवल एक ही लिंग, व्यष्टिविकास चरण के व्यक्तियों से जोड़ा जाना चाहिए, और जनसंख्या कुछ विष 25, 26 में, intersexual विकास और भौगोलिक परिवर्तनशीलता की मान्यता दी. मकड़े भी कम मात्रा ग्रंथि की हाल ही में कमी को प्रतिबिंबित कर सकते जहां व्यक्तियों, बीच में उत्पादित जहर की मात्रा में काफी भिन्नता प्रदर्शित कर सकते हैं. इस प्रकार यह उनकी आखिरी खिलाने के बाद जहर कई दिनों इकट्ठा करने के लिए सलाह दी जा सकती. थोड़ा जहर जारी की है, तो अत्यधिक वर्तमान hemolymph या मौत के साथ विष के प्रदूषण के लिए अग्रणी, छल्ली टूटना कारण हो सकता है जो मकड़ी, के लिए लागू नहीं किया जाना चाहिए.
मकड़ी एसआई के साथ जहर नमूनों का संदूषणलालकृष्ण या मानव सूत्रों ने यह भी बाँझ या स्वच्छ उपकरणों के उपयोग के माध्यम से परहेज किया जाना चाहिए. इन चुनौतियों के बावजूद, शुद्ध विष का संग्रह, जिंदा मकड़ी छोड़ने, (अन्य सेलुलर प्रोटीन से विष घटकों को अलग नहीं है) और मकड़ी को मारने ग्रंथि homogenates से विष प्राप्त है कि तरीकों के लिए बेहतर है. यह नमूने जल्दी से प्रोटीन गिरावट को रोकने के लिए जमे हुए हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए भी महत्वपूर्ण है.
विष की निकासी जिससे विष ग्रंथि में जहर जीन अभिव्यक्ति उत्तेजक, बाद में जहर उत्पादन को बढ़ावा देता है. मकड़ियों जहर कमी जीवित रहने के लिए इस प्रोटोकॉल की अनुमति देता है क्योंकि इस प्रकार, उनके ग्रंथियों विच्छेदित किया जा सकता है कई दिनों के बाद जहर जीन अभिव्यक्ति ऐसे प्रतिलिपि 10,11 क्लोनिंग के रूप में आनुवंशिक अध्ययन, के लिए पर्याप्त होने की उम्मीद है जहां एक बिंदु पर (मकड़ी हत्या). कई महत्वपूर्ण सावधानियां भी विष ग्रंथि dissections में लिया जाना चाहिए. जोर प्रयोगशाला equipm के प्रयोग पर रखा जाना चाहिएईएनटी और शाही सेना नीचा कि RNases के लिए स्वतंत्र हैं कि अभिकर्मकों. इस प्रकार यह RNase और डीएनए संदूषण को खत्म करने कि समाधान के साथ संदंश और अन्य गैर डिस्पोजेबल उपकरण और सतहों साफ करने के लिए सिफारिश की है. dissections के आगे ऊतक की शाही सेना अखंडता को सुनिश्चित करने के लिए जल्दी से जल्दी और सीधे जमे हुए के रूप में किया जाना चाहिए. उनके cephalothorax और पेट जल्दी से अलग हो रहे हैं के बाद अंत में, dissections ही, anesthetized मकड़ियों पर प्रदर्शन किया जाना चाहिए.
अंत में, इस लेख मकड़ी विष और विष ग्रंथियों प्राप्त करने के लिए एक सत्यापित प्रोटोकॉल प्रदान करता है. विष और विष ग्रंथियों प्रोटिओमिक और transcriptomic दृष्टिकोण का उपयोग कर अपने प्रोटीन और पेप्टाइड घटकों के अलगाव और लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देते हैं. इसके अलावा, विष के नमूने उनके घटक अणुओं के जैव चिकित्सा और औषधीय क्षमता का निर्धारण जो कार्यात्मक assays के शुरुआती बिंदु का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं. लगभग सभी मकड़ियों विष का उत्पादन, और विस्तृत गोताखोरव्यक्तिगत प्रजातियों द्वारा संश्लेषित विष घटकों की चर्चाएं विष के अणुओं की एक विशाल विविधता अभी तक 13 की खोज की जा रहे हैं पता चलता है. तदनुसार, इस प्रोटोकॉल मकड़ी विष में मौजूद जैविक रूप से सक्रिय अणुओं की समृद्ध स्रोत की जांच के लिए उपकरण प्रदान करता है.
Disclosures
लेखक का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है और कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है.
Acknowledgments
मैं इस प्रोटोकॉल के विकास में उनकी सहायता के लिए निम्नलिखित व्यक्तियों धन्यवाद: चक Kristensen, ग्रेटा Binford, एलेक्स लालकृष्ण लंकास्टर, कोनराड Zinsmaier, और Mays इमाद. मास स्पेक्ट्रोमेट्री और प्रोटिओमिक्स डेटा AZCC को SWEHSC, एनआईएच / NCI अनुदान CA023074 को NIEHS अनुदान ES06694 द्वारा समर्थित एरिजोना प्रोटिओमिक्स कंसोर्टियम द्वारा और एरिजोना विश्वविद्यालय के BIO5 संस्थान द्वारा हासिल किया गया. इस काम के लिए अनुदान जेसिका ई आड़ को अनुदान 1F32GM83661-01 और 1R15GM097714-01 से राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (जनरल मेडिसिन के राष्ट्रीय संस्थान) से प्रदान किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nerve and muscle stimulator (electro-stimulator) | Grass Technologies | SD9 | http://www.grasstechnologies.com/products/stimulators/stimsd9.html |
| Voltmeter | RadioShack | 22-223 | any generic voltmeter/multimeter can be substituted |
| Pointed Featherweight Forceps | Bioquip | 4748 | |
| Plasti Dip | Performix | Available at Ace Hardware | |
| 25 G x 1½ in Precision Glide hypodermic syringe needle | BD Medical | 305127 | |
| Vacuum filter flask 1 L | Nalgene | DS4101-1000 | smaller flask sizes may also work |
| Buchner Two Piece funnel, 90 mm | Nalgene | 4280-0900 | |
| 5 μl Capillary Bores (Micro capillaries) | VWR | 53508-375 | |
| Mounting putty strip | Loctite | Available at Ace Hardware | |
| Fisherbrand General-Purpose Extra-Long Forceps Length: 11-13/16 in. | Fisher | 10-316C | |
| SSC Buffer, 20x (pH 7.0), Molecular Grade | Promega | V4261 | can be made from stock chemicals (150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate) |
| Eppendorf safe-lock tubes 0.5 ml tubes (cryogenic safe) | Eppendorf | 22363611 | |
| Nalgene Dewar, 1 L, HDPE, Liquid nitrogen benchtop flask | Thermo Scientific | 4150-1000 | |
| Rnase Away | VWR | 53225-514 | |
| Ultra Fine Tweezers (dissecting forceps) | EMS | 78310-0 | similar high-quality fine point forceps can be substituted |
| Foot switch/pedal | Linemaster Switch Corp. | 491-S | |
| Two-pronged extension clamp, with vinyl covered sleeves, 8.5 inches | VWR | 21570-007 | similar models could be substituted |
| Clamp Holder | VWR | 89084-746 | similar models could be substituted, must accommodate diameter of extension clamp rod |
| Magnetic base (holds extension clamp via clamp holder) | VWR | 300042-270 | similar apparatus able to securely hold extension clamp in fixed position may be substituted |
| Plastic Collecting Vials (large/40 dram) | Bioquip | 8940 | |
| Cotton sewing thread | Joann fabric and craft store | 7245855 | similar product could be substituted |
References
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