Bu makale 1 için elektrik stimülasyonu kullanarak örümcekler zehir çıkarılması için bir protokol), proteomik karakterizasyonu yapmak 2) zehir bezi gen ifadesini uyarmak, ve 3) zehirlerinin fonksiyonel çalışmalar yapmak sağlar. Bu gen ifadesi çalışmaları için zehir bezi microdissections bir açıklama ile takip edilmektedir.
Zehirleri kimyasal genellikle çeşitli fizyolojik faaliyetleri ile çok sayıda proteinler ve peptidler içeren karmaşık salgıları vardır. Zehir proteinlerinin fonksiyonel karakterizasyonu hücresel reseptörlere ilaç potansiyel ya da prob belirlenmesi dahil önemli biyomedikal uygulamalar vardır. Örümcekler zehirli organizmaların çoğu türlerin zengin clade vardır, ama sadece birkaç türün zehirleri nedeniyle küçük hayvanların zehrinin dakika miktarlarda toplama ile ilgili zorluk kısmen, iyi anlaşılmaktadır. Bu kağıt Batı kara dul (Karadul) hakkında prosedürünü gösteren, elektrik stimülasyonu kullanarak örümcekler zehir toplanması için bir protokol sunar. Toplanan zehir kütle spektrometresi ile doğrudan protein tanımlama, fonksiyon deneyleri ve transkriptomik çalışmalar için zehir gen ifadesinin uyarılması dahil çeşitli alt analizler için yararlıdır. Bu teknik o iso protokolleri üzerinde bir avantaja sahiptirzehirin bir parçası olarak salgılanan olmayan hücresel proteinlerden hakiki zehiri bileşenlerini ayıramazsınız kepekli bezi homojenatlarının, geç gelen zehir. Örnek sonuçlar kütle spektrometrisi kullanılarak, toplanmış numune bilinen venom peptidleri saptanmasını ortaya koymaktadır. Zehir toplama işlemi sonuçlar, bu sekansı düzeyinde venom ifade edilen proteinlerin ve peptidlerin karakterizasyonuna yol açtığını gösteren sahip örümcek zehir bezlerinin kesme için bir protokol takip eder.
Zehirleri ağırlıklı predasyon ve savunma amaçlı başka bir hayvana enjekte hayvan salgılar, ve, aynı zamanda biyomedikal alaka 1-3 önemli biyolojik uygulamaya sahiptir. Sadece bazı hayvanlar zehir sentezler, ancak bu evrim bağımsız çünkü üretim, omurgasızlar (örneğin, cnidarians, konik salyangoz, akrep ve örümcek) ve omurgalıların (örneğin, yılan, bazı balık ve memeliler) arasında taxonomically yaygın birden çok kez 1,4 . Zehirlerinin biyokimyasal karakterizasyonu tipik olarak, büyük oranda hızla kimyasal maddeler, 1 sunmak için enjekte edilen hayvanların dolaşım ve sinir sistemleri üzerinde etki, protein ve peptid çok çeşitli oluşmaktadır göstermektedir. Hayvanların zehirli küçük bir kısmı insanlarda, synanthropic dağılımları 5 ile özellikle türler için bir tehdit oluşturabilir. Zehir kompozisyon ve fonksiyonel aktivitelerin çalışma önemli bir rol oynadığıOmurgalı hücresel bileşenlerin (özellikle nöronal iyon kanalları) 6 ve temel hücresel süreçleri (örn Nörosekresyon) 7 durulaştırmada fonksiyonel karakterizasyonu. Ayrıca, seçim venom peptidleri kanseri ve ağrı 8,9 için tedavi olarak kullanımları da dahil olmak üzere, biyomedikal bağlamlarda faydalı özelliklere sahiptir ve aday ilaç potansiyel ve antivenomu geliştirilmesi için çıkartılmaktadır. Zehirleri de böylece bu tehlikeli sekresyon toplanması birçok yarar vardır, ekolojik ve evrimsel araştırma 1,4,10,11 belirgin rol oynarlar.
40,000 tarif örümcek (Sipariş Araneae) türleri ve köpekdişlerimden 12 feshetme zehir bezleri eşleştirilmiş sahiptirler 100'den fazla örümcek ailelerinden birinin ancak tüm> vardır. Örümcekler yüksek tür çeşitliliği onlar zehirli organizmaların büyük clade temsil ettiğini göstermektedir. Ancak, örümcek zehirlerinin biyokimyasal karakterizasyonu vardır largely genellikle insan sokmalarının ile bağlantılı türlerin az sayıda konsantre edildi. Örümcek zehirlerinin son proteomik ve Transkriptomik çalışmalar bunlar genellikle birçok benzersiz proteinler ve peptidler 2,13,14 içerdiğini gösterir. Yüksek verimli cDNA dizileme ve kütle spektrometresi peptid parmak izi gelişmeler büyük ölçüde bu zehir proteinlerin 15 keşfini kolaylaştırdı. Yine de, böyle iş gibi tekniklere yönelik yeterli zehir ve / veya örümceklerin zehir bezlerinde ve detaylı belgelere koleksiyonu ile başlar 16 birkaçıdır.
Bu kağıt benzer büyüklükte örümcekler uygulanabilir kara dul örümcekleri gelen zehir ve zehir bezlerinin toplanması için bir protokol sunar. Ayrı bezlerinden venom toplanması diğer hücresel fonksiyonların gerçekleştirilmesi proteinlere karşı zehir salgılanan proteinlerin tanımlanmasını sağlar. Siyah dul ve diğer Latrodectus türler nedeniyle yaygın, bazen bol terleme, kas kasılmaları, hipertansiyon, nefes darlığı ve yamalı felç 5 eşlik insanlarda şiddetli ağrıya sebep olan son derece nörotoksik zehiri, en tehlikeli örümcekler arasında olmak olarak kabul edilmektedir. Burada sunulan zehir toplama protokolü kas kasılmaları ve zehir serbest bırakılmasını temin için anestezi örümcekler elektrik akımını sağlamak için elektro-stimülasyon kullanır. Zehir damlacıkları hızlı bir şekilde mikro-kapiller ile toplandı ve dondurucu depolama için tüpleri içine tevzi edilmiştir. Protokol tehlikeli prosedürleri gerektirdiğinden, sadece iyi eğitilmiş kişiler tarafından yapılmalıdır ve dikkatli kilit aşamada zorlanmaktadır. Toplanan zehir örneğin karakterizasyonu ve fizyolojik deneyler ya da işlevsel deneyler 18 oluşturan moleküllerin 2, izolasyonu gibi çok sayıda kullanımları vardır ve zehir gen ekspresyonunu 11 uyarmak için. Protokol descr ile sona eriyorzehir bezi diseksiyon ve venom özel genlerin klonlanması için yararlı koruma iption, sentezleme üzere, farklı örümcek 10,11 venom azalması takip eden 2-3 gün meydana geldiği gösterilmiştir.
Zehirleri bir fizyolojik açıdan reaktif proteinler, peptidler ve ilaç keşfi için uygulamaları ile diğer moleküllerin önemli bir kaynak, yanı sıra hücre ve ekolojik araştırma 1-3 temel alanlarını temsil etmektedir. Bununla birlikte, özellikle tehlikeli veya küçük hayvanların zehir toplama, zor bir iştir. Bu protokol zehir ve zehir bezleri kara dul örümcekleri alınabilir nasıl gösteriyor ve zehirinden klonlanmış zehir mudpit analizi ve cDNA'lann türetilen bir protein veritabanının bir kombinasyonu yoluyla, bu yaklaşımın başarısını 21 bezleri doğruluyor. Bu protokol kara dul ve orta ölçekli örümcekler, için iyi çalışırken diğer zehirlerden toplama teknikleri ancak, bu pipetler örneğin, 24. Bu ikinci yaklaşım bardağa köpekdişlerimden zehir direkt aspirasyon gibi büyük mygalomorph (tarantula gibi) örümcekler için istihdam edilmiştir , aggressi olmayan küçük ölçekli örümcekler için iyi çalışmazA.Ş..
Daha rutin, tutarlı ve hızlı olur böylece burada anlatılan zehir toplama protokolünün bir özellikle kritik yönü toplama sürecinin hazırlanması ve optimizasyonu başlangıç yılıdır. Protokol master başlangıçta zor olduğunu, ancak tekrarlanan denemeler ile, daha kolay ve daha hızlı hale gelir. Dikkat da tehlikeli örümcekler işleme, elektrik akımı, ince nokta cam mikro kılcal damarlar, ve şırınga iğneleri ve kullanımını içeren tüm kritik aşamalarında zorlanmaktadır. Bu mikro kılcal damarları şekillendirirken gözlük yanı sıra, nitril eldiven, laboratuvar önlüğü, uzun pantolon ve kapalı ayakkabı gibi uygun kişisel koruyucu ekipman giymek önemlidir.
Zehir toplama bir başka zorlu yönü tutarları li olabilir topladığı herhangi bir örümcek, özellikle Latrodectus türler tarafından üretilen zehirin az miktardaen iyi kişi başına 1-2 mikrolitre çokluğundan. Böyle bir protein jeller ya da işlevsel tahlilleri gibi alt uygulamalar için yeterlidir zehir elde edilmesi bir tüp içine birden fazla bireyden zehrin kombinasyonu da gerektirebilir. Bu gibi durumlarda, zehir sadece aynı cinsiyetten, ontogenetik sahnenin kişilerden kombine edilmeli ve nüfus bazı zehirlerinin 25, 26 yılında, interseks gelişimsel ve coğrafi değişkenlik tanınmalı. Örümcekler de az miktarda bezinin son tükenmesi yansıtıyor olabilir bireyler, arasında üretilen zehir miktarı ciddi çeşitlilik gösterebilir. Böylece son beslenmeden sonra zehiri birkaç gün toplamak için tavsiye edilebilir. Biraz zehir bırakılırsa, aşırı akım hemolimfi veya ölüm zehir kirlenmeye yol, manikür yırtılmasına neden olabilir örümcek, uygulanan olmamalıdır.
Örümcek si ile zehir örneklerin kirlenmesilk veya insan kaynakları da steril veya temiz ekipman kullanımı ile kaçınılmalıdır. Bu zorluklara rağmen, saf zehir toplama, canlı örümcek bırakarak, (diğer hücresel proteinlerden zehiri bileşenleri ayrı değil) ve örümcek öldürmek bezi homojenatlarından zehir elde yöntemler tercih edilir. Bu örnekleri hızlı bir şekilde protein parçalanmasını önlemek için dondurulmuş sağlamak için de önemlidir.
Venom ekstraksiyon, böylelikle zehir bezlerinde zehir gen ifadesini uyarıcı, sonraki zehir yapımını arttırır. Örümcekler zehir tükenmesi hayatta kalmak için bu protokol sağlar çünkü, bu nedenle, bezler disseke edilebilir birkaç gün sonra zehir gen ifadesi böyle transkript 10,11 klonlama gibi genetik çalışmalar için yeterli olması beklenen bir noktada (örümcek öldürme). Birçok önemli tedbirler de zehir bezi disseksiyonlarında alınmalıdır. Vurgu laboratuar donatı kullanılarak konulmalıdırent ve RNA aşağılamak RNases ücretsizdir reaktifler. Böylece RNaz ve DNA kontaminasyonu tamamen ortadan kaldırmak çözümler forseps ve diğer non-tek cihaz ve yüzeylerin silinmesi için tavsiye edilir. Disseksiyonları ayrıca doku RNA bütünlüğünü sağlamak için mümkün olduğunca çabuk ve doğrudan donmuş olarak yapılmalıdır. Bunların cephalothoraks ve karın hızlı bir şekilde ayrılır sonra son olarak, diseksiyon sadece anestezi örümcek üzerinde gerçekleştirilmelidir.
Sonuç olarak, bu makalede örümcek zehir ve zehir bezleri elde etmek için doğrulanmış bir protokol sağlar. Zehir ve venom bezleri proteomik ve transkriptomik yaklaşımlar kullanılarak, protein ve peptid bileşenlerinin izolasyonu ve karakterizasyonu için izin verir. Buna ek olarak, zehir numuneler bileşen moleküllerinin biyomedikal ve farmakolojik potansiyelini belirlemek fonksiyon deneyleri, başlangıç noktasını temsil edebilir. Neredeyse bütün örümcekler zehir üretirler ve geniş dalgıçbireysel türler tarafından sentezlenen zehiri bileşenlerinin versitesi zehir moleküllerin geniş bir çeşitlilik henüz 13 keşfedilmeyi ileri sürüyor. Bu duruma göre, bu protokol, örümcek zehirleri bulunan biyolojik olarak aktif moleküllerin zengin bir kaynak araştırmak için araçlar sağlar.
The authors have nothing to disclose.
Ben bu protokolün geliştirilmesi onların yardım için aşağıdaki kişilere teşekkür: Chuck Kristensen, Greta binford'un, Alex K. Lancaster, Konrad Zinsmaier ve Mays Imad. Kütle spektrometresi ve proteomik verileri AZCC için SWEHSC, NIH / NCI hibe CA023074 için NIEHS hibe ES06694 tarafından desteklenen Arizona Proteomiks Konsorsiyumu tarafından ve Arizona Üniversitesi BIO5 Enstitüsü tarafından satın alındı. Bu iş için fon Jessica E. garb hibe 1F32GM83661-01 ve 1R15GM097714-01 gelen Sağlık Ulusal Enstitüleri (Genel Ulusal Tıp Enstitüsü) sağlandı.
Nerve and muscle stimulator (electro-stimulator) | Grass Technologies | SD9 | http://www.grasstechnologies.com/products/stimulators/stimsd9.html |
Voltmeter | RadioShack | 22-223 | any generic voltmeter/multimeter can be substituted |
Pointed Featherweight Forceps | Bioquip | 4748 | |
Plasti Dip | Performix | Available at Ace Hardware | |
21 G X 1 1/2in Precision Glide hypodermic syringe needle | BD Medical | 305190 | |
Vacuum filter flask 1L | Nalgene | DS4101-1000 | smaller flask sizes may also work |
Buchner Two Piece funnel, 90 mm | Nalgene | 4280-0900 | |
5 microlitter Capillary Bores (Micro capillaries) | VWR | 53508-375 | |
Mounting putty strip | Loctite | Available at Ace Hardware | |
Fisherbrand* General-Purpose Extra-Long Forceps Length: 11-13/16 in. | Fisher | 10-316C | |
SSC Buffer, 20X (pH 7.0), Molecular Grade | Promega | V4261 | can be made from stock chemicals (150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate) |
Eppendorf safe-lock tubes 0.5 mL tubes (cryogenic safe) | Eppendorf | 22363611 | |
Nalgene Dewar, 1L, HDPE, Liquid nitrogen benchtop flask | Thermo Scientific | 4150-1000 | |
Rnase Away | VWR | 53225-514 | |
Ultra Fine Tweezers (dissecting forceps) | EMS | 78310-0 | similar high-quality fine point forceps can be substituted |
Foot switch/pedal | Linemaster Switch Corp. | 491-S | |
Two-pronged extension clamp, with vinyl covered sleeves, 8.5 inches | VWR | 21570-007 | similar models could be substituted |
Clamp Holder | VWR | 89084-746 | similar models could be substituted, must accommodate diameter of extension clamp rod |
Magnetic base (holds extension clamp via clamp holder) | VWR | 300042-270 | similar apparatus able to securely hold extension clamp in fixed position may be substituted |
Plastic Collecting Vials (large/40 dram) | Bioquip | 8940 | |
Cotton sewing thread | Threadart.com | THRCOT9 | similar product could be substituted |