Denne artikel indeholder en protokol til ekstraktion af gift fra edderkopper ved hjælp af elektrisk stimulation med henblik på at 1) udføre proteomiske karakterisering, 2) stimulere gift kirtel genekspression, og 3) udføre funktionelle undersøgelser af gifte. Dette efterfølges af en beskrivelse af gift kirtel microdissections for genekspressionsstudier.
Gifte er kemisk komplekse sekreter typisk omfatter talrige proteiner og peptider med forskellige fysiologiske aktiviteter. Funktionel karakterisering af venom proteiner har vigtige biomedicinske anvendelser, herunder fastlæggelse af narkotikarelaterede kundeemner eller prober til cellulære receptorer. Edderkopper er den mest artsrige clade af giftige organismer, men gifte på kun få arter er godt forstået, dels som følge af vanskelighederne forbundet med at indsamle små mængder af gift fra små dyr. Denne artikel præsenterer en protokol for indsamling af gift fra edderkopper ved hjælp af elektrisk stimulation, der viser proceduren på den vestlige sorte enke (Latrodectus hesperus). Den opsamlede gift er anvendelig til forskellige downstream analyser herunder direkte protein identifikation via massespektrometri, funktionelle assays, og stimulering af gift genekspression for transkriptomisk studier. Denne teknik har den fordel i forhold til protokoller, isosent gift fra hele homogenater kirtel, som ikke adskiller ægte gift bestanddele fra cellulære proteiner, som ikke udskilles som en del af giften. Repræsentative resultater viser påvisningen af kendte venom peptider fra den opsamlede prøve ved hjælp af massespektrometri. Proceduren gift samling efterfølges af en protokol til at dissekere edderkoppegift kirtler, og resultaterne viser, at dette fører til karakterisering af gift-udtrykte proteiner og peptider på sekvens niveau.
Gifte er dyresekreter overvejende injiceres i et andet dyr med henblik på prædation eller forsvar, og har også vigtige biologiske applikationer med biomedicinsk relevans 1-3. Kun visse dyr syntetisere gift, men dens produktion er taksonomisk udbredt på tværs af hvirvelløse dyr (fx cnidarianer, kegle snegle, skorpioner og edderkopper) og hvirveldyr (f.eks slanger, nogle fisk og pattedyr), fordi det uafhængigt har udviklet sig flere gange 1,4 . Biokemisk karakterisering af gifte viser de typisk er sammensat af en lang række proteiner og peptider, som stort set virker på kredsløbssygdomme og nervesystem injicerede dyr til hurtigt at levere bestanddele toksiner 1. En lille del af giftige dyr kan udgøre en trussel for mennesker, især arter med synanthropic distributioner 5. Studiet af gift sammensætning og funktionelle aktiviteter har spillet en vigtig rolle iden funktionelle karakterisering af hvirveldyr cellulære komponenter (især neuronale ionkanaler) 6 og i at belyse grundlæggende cellulære processer (f.eks neurosekretion) 7. Desuden skal du vælge gift peptider har nyttige egenskaber i biomedicinske sammenhænge, herunder deres anvendelser som behandlinger for kræft og smerte 8,9, og udvindes for kandidatlægemiddel kundeemner og antivenom udvikling. Gifte også spille fremtrædende roller i økologisk og evolutionær forskning 1,4,10,11, og dermed indsamlingen af disse farlige sekreter har mange forsyningsselskaber.
Der er> 40.000 beskrevne arter af edderkop (Order Araneae), og alle, men en af de mere end 100 spider familier besidder parret gift kirtler, der ender i hugtænder 12. Den høje artsdiversitet af edderkopper tyder på, at de repræsenterer den største clade giftige organismer. Men biokemisk karakterisering af edderkoppegifte har largely koncentreres om et lille antal arter oftest forbundet med menneskers envenomation. Seneste proteom og transkriptom studier af edderkoppegifte angiver, at de typisk indeholde mange unikke proteiner og peptider 2,13,14. Fremskridt i high-throughput cDNA sekventering og massespektrometri peptid fingeraftryk har i høj grad lettet opdagelsen af disse venom proteiner 15. Ikke desto mindre er dette arbejde begynder med indsamlingen af tilstrækkeligt gift og / eller gift kirtler fra edderkopper, og detaljeret dokumentation for sådanne teknikker er få 16.
Denne artikel præsenterer en protokol for indsamling af gift og gift kirtler fra sorte enke edderkopper, som kan anvendes på samme størrelse edderkopper. Indsamlingen af gift adskilt fra kirtler muliggør identifikation af proteiner, der udskilles i giften i modsætning til proteiner, der udfører andre cellulære funktioner. Sorte enker og andre Latrodectus arter er bredt anerkendt som værende blandt de mest farlige edderkopper på grund af deres yderst neurotoksisk gift, der forårsager alvorlige smerter hos mennesker, som er undertiden ledsaget af voldsomme svedeture, muskelsammentrækninger, hypertension, vejrtrækningsbesvær og fragmentarisk lammelse 5. Giften samling protokol præsenteres her bruger elektro-stimulation til at levere elektrisk strøm til bedøvede edderkopper til at fremkalde muskelsammentrækninger og udslip af gift. Venom dråber hurtigt opsamles med mikro-kapillærer og dispenseres i rør til opbevaring fryser. Fordi protokollen involverer farlige procedurer, bør det kun udføres af veluddannede individer, og forsigtighed presses på centrale trin. Den opsamlede gift har mange anvendelsesmuligheder, såsom karakterisering og isolering af konstituerende molekyler 2 af fysiologiske eksperimenter eller funktionelle assays 18, og for at stimulere gift genekspression 11. Protokollen slutter med en descr, hvis ekspression er blevet vist iption af gift kirtel dissektion og bevarelse anvendelige til kloning af gift-specifikke gener at forekomme 2-3 dage efter gift udtømning i forskellige edderkopper 10,11.
Gifte udgør en vigtig kilde til fysiologisk reaktive proteiner, peptider og andre molekyler med ansøgninger om drug discovery, samt for grundlæggende aspekter af cellulær og økologisk forskning 1-3. Men indsamling af gift, især fra farlige eller små dyr, er en udfordrende opgave. Denne protokol viser, hvordan gift og gift kirtler kan indsamles fra sorte enke edderkopper, og bekræfter succesen af denne tilgang via en kombination af MuDPIT analyse af giften og et protein database stammer fra cDNA'er klonet fra gift kirtler 21. Mens denne protokol fungerer godt for sorte enker og mellemstore edderkopper, andre gift indsamling teknikker er blevet anvendt for større mygalomorph (tarantula-lignende) edderkopper, såsom direkte aspiration af gift fra hugtænder i glas pipetter fx 24. Denne sidstnævnte fremgangsmåde, dog , ikke vil fungere godt for de mindre og mellemstore edderkopper, der ikke er aggressive.
En særlig kritisk aspekt af giften indsamlingen protokollen beskrevet her, er de indledende faser af forberedelse og optimering af indsamlingen, således at det bliver mere rutine, konsekvent og hurtigere. Protokollen er indledningsvis udfordrende at mestre, men med gentagne forsøg, bliver det lettere og hurtigere. Forsigtighed er også opfordrede på alle kritiske faser, der involverer håndtering af farlige edderkopper, anvendelse af elektrisk strøm, fin-punkts glas mikro kapillærer, og sprøjte nåle. Det er vigtigt at bære egnede personlige værnemidler såsom nitrilhandsker, en kittel, lange bukser og lukkede sko, samt briller, når udformningen af mikro kapillærer.
Et andet udfordrende aspekt gift samling er den lille mængde gift produceret af én edderkop, især Latrodectus arter, hvorfra de opkrævede beløb kan ligrænset til 1-2 mikroliter per individ i bedste fald. At opnå tilstrækkelig gift for downstream applikationer, såsom proteingeler eller funktionelle assays kan kræve en kombination af gift fra flere individer ind i et rør. I sådanne tilfælde bør gift kun kombineres fra individer af samme køn, ontogenetiske scene, og befolkning givet anerkendelse af interseksuel, udviklingsmæssige og geografisk variabilitet i nogle gifte 25, 26. Edderkopper kan også udvise betydelig variation i mængden af gift produceret blandt individer, hvor mindre mængder kan afspejle den seneste udtynding af kirtel. Således kan det være tilrådeligt at indsamle gift flere dage efter sidste fodring. Hvis lille gift er frigivet, bør overdreven strøm ikke anvendt til edderkoppen, som kan forårsage neglebånd til at briste, hvilket fører til forurening af giften med hæmolymfe eller død.
Forurening af venom prøver med edderkop silk eller humane kilder bør også undgås ved brug af sterile eller rent udstyr. På trods af disse udfordringer, indsamling af ren gift, forlader spider live, er at foretrække frem for metoder, der opnår gift fra kirtel homogenater (som ikke adskille venom komponenter fra andre cellulære proteiner) og dræbe edderkoppen. Det er også vigtigt at sikre, at prøverne hurtigt er frosset for at forhindre proteinnedbrydning.
Udvindingen af gift fremmer senere gift produktionen og derved stimulere gift genekspression i giften kirtel. Således fordi denne protokol giver mulighed for edderkopper til at overleve gift udtømning, deres kirtler kan dissekerede flere dage senere (dræbe spider) i et punkt, hvor gift genekspression forventes at være tilstrækkeligt til genetiske undersøgelser, såsom afskrift kloning 10,11. Skal også tages flere vigtige forholdsregler i giften kirtel dissektioner. Der bør lægges vægt på ved hjælp af lab udstent og reagenser, som er fri for RNaser, som nedbryder RNA. Det anbefales derfor at tørre tang og andre ikke-disponible udstyr og overflader med løsninger, der eliminerer RNase og DNA-kontaminering. De dissektioner bør udføres så hurtigt som muligt og umiddelbart frosset til yderligere at sikre RNA integritet af vævet. Endelig bør dissektioner kun udføres på bedøvede edderkopper, efter deres cephalothorax og underliv er hurtigt adskilt.
Afslutningsvis denne artikel giver en verificeret protokol til at opnå edderkoppegift og gift kirtler. Venom og gift kirtler mulighed for isolering og karakterisering af deres protein- og peptid-komponenter ved hjælp af proteomik og transkriptomisk tilgange. Derudover kan venom prøver repræsentere udgangspunktet for funktionelle assays, som er bestemmende for biomedicin og farmakologiske potentialet i deres konstituerende molekyler. Næsten alle edderkopper producerer gift, og den brede dykkerfoldighed af venom komponenter syntetiseret af de enkelte arter tyder på en bred mangfoldighed af venom molekyler endnu at blive opdaget 13. Derfor denne protokol giver værktøjer til at undersøge den rig kilde til biologisk aktive molekyler til stede i edderkoppegifte.
The authors have nothing to disclose.
Jeg takker følgende personer for deres assistance i udviklingen af denne protokol: Chuck Kristensen, Greta Binford, Alex K. Lancaster, Konrad Zinsmaier og Mays Imad. Massespektrometri og proteomics data blev erhvervet af Arizona Proteomics Consortium støttet af NIEHS tilskud ES06694 til SWEHSC, NIH / NCI tilskud CA023074 til AZCC og af BIO5 Institute på University of Arizona. Finansieringen af dette arbejde blev leveret fra National Institutes of Health (National Institute for Almen Medicin) fra tilskud 1F32GM83661-01 og 1R15GM097714-01 til Jessica E. Garb.
Nerve and muscle stimulator (electro-stimulator) | Grass Technologies | SD9 | http://www.grasstechnologies.com/products/stimulators/stimsd9.html |
Voltmeter | RadioShack | 22-223 | any generic voltmeter/multimeter can be substituted |
Pointed Featherweight Forceps | Bioquip | 4748 | |
Plasti Dip | Performix | Available at Ace Hardware | |
21 G X 1 1/2in Precision Glide hypodermic syringe needle | BD Medical | 305190 | |
Vacuum filter flask 1L | Nalgene | DS4101-1000 | smaller flask sizes may also work |
Buchner Two Piece funnel, 90 mm | Nalgene | 4280-0900 | |
5 microlitter Capillary Bores (Micro capillaries) | VWR | 53508-375 | |
Mounting putty strip | Loctite | Available at Ace Hardware | |
Fisherbrand* General-Purpose Extra-Long Forceps Length: 11-13/16 in. | Fisher | 10-316C | |
SSC Buffer, 20X (pH 7.0), Molecular Grade | Promega | V4261 | can be made from stock chemicals (150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate) |
Eppendorf safe-lock tubes 0.5 mL tubes (cryogenic safe) | Eppendorf | 22363611 | |
Nalgene Dewar, 1L, HDPE, Liquid nitrogen benchtop flask | Thermo Scientific | 4150-1000 | |
Rnase Away | VWR | 53225-514 | |
Ultra Fine Tweezers (dissecting forceps) | EMS | 78310-0 | similar high-quality fine point forceps can be substituted |
Foot switch/pedal | Linemaster Switch Corp. | 491-S | |
Two-pronged extension clamp, with vinyl covered sleeves, 8.5 inches | VWR | 21570-007 | similar models could be substituted |
Clamp Holder | VWR | 89084-746 | similar models could be substituted, must accommodate diameter of extension clamp rod |
Magnetic base (holds extension clamp via clamp holder) | VWR | 300042-270 | similar apparatus able to securely hold extension clamp in fixed position may be substituted |
Plastic Collecting Vials (large/40 dram) | Bioquip | 8940 | |
Cotton sewing thread | Threadart.com | THRCOT9 | similar product could be substituted |