This manuscript describes a protocol that applies comprehensive profiling for analysis of transcriptional programs induced in specific brain nuclei of rodents following behavioral paradigms. Herein, this approach is illustrated in the context of profiling genes induced in the nucleus accumbens (NAc) of mice following acute cocaine exposure, utilizing microfluidic qPCR arrays.
मस्तिष्क और दीर्घकालिक यादों का समेकन में अनुभव की एन्कोडिंग जीन प्रतिलेखन पर निर्भर करते हैं. एन्कोडिंग अनुभव में विशिष्ट जीन के समारोह की पहचान आणविक तंत्रिका विज्ञान के मुख्य उद्देश्यों में से एक है. इसके अलावा, विशिष्ट व्यवहार के साथ परिभाषित जीन की कार्यात्मक संघ neuropsychiatric विकारों के आधार को समझने के लिए निहितार्थ हैं. मजबूत प्रतिलेखन कार्यक्रमों की प्रेरण विभिन्न व्यवहार जोड़तोड़ निम्नलिखित चूहों के दिमाग में देखा गया है. कुछ आनुवंशिक तत्व अलग व्यवहार जोड़तोड़ के बाद और अलग मस्तिष्क नाभिक में खरीदे उपयोग कर रहे हैं, ट्रांसक्रिप्शनल कार्यक्रमों समग्र उत्प्रेरण उत्तेजनाओं और वे 1,2 अध्ययन कर रहे हैं जिसमें संरचना के लिए अद्वितीय हैं.
इस प्रकाशन में, एक प्रोटोकॉल व्यवहार में गड़बड़ी के जवाब में चूहों के मस्तिष्क नाभिक से मजबूत और व्यापक ट्रांसक्रिप्शनल रूपरेखा के लिए वर्णित है.प्रोटोकॉल तीव्र कोकीन अनुभव निम्नलिखित accumbens नाभिक में जीन अभिव्यक्ति की गतिशीलता के विश्लेषण के संदर्भ में प्रदर्शन किया है. विवो अनुभव में परिभाषित करने के बाद, लक्ष्य तंत्रिका ऊतक विच्छेदित है; शाही सेना शुद्धि के बाद, कई लक्ष्य जीन की व्यापक qPCR विश्लेषण के लिए प्रतिलेखन और microfluidic सरणियों का उपयोग रिवर्स. इस प्रोटोकॉल ऐसे छोटे मस्तिष्क के नमूने या यहां तक कि एकल कक्षों के रूप में व्यापक विश्लेषण शुरू सामग्री की मात्रा को सीमित करने के (50-500 जीन को संबोधित) की दिशा में सक्षम है.
प्रोटोकॉल कई नमूनों की समानांतर विश्लेषण (जैसे एकल कक्षों, दवा निम्नलिखित गतिशील विश्लेषण, वायरल या व्यवहार perturbations) के लिए सबसे फायदेमंद है. हालांकि, प्रोटोकॉल भी प्रोटीन या RNAseq द्वारा पूरे जीनोम के अध्ययन के लिए पहले नमूने के लक्षण वर्णन और गुणवत्ता आश्वासन के लिए सेवा करते हैं, साथ ही पूरे जीनोम के अध्ययन से प्राप्त आंकड़ों का सत्यापन कर सके.
मस्तिष्क के गतिशील संगठन संज्ञानात्मक व्यवहार और लचीलापन सक्षम बनाता है. अनुभव मस्तिष्क 3 में न्यूरॉन्स के बीच कनेक्शन की संरचना और ताकत के संशोधनों के माध्यम से इनकोड. यह "अनुभव पर निर्भर plasticity" synaptic संरचना और शक्ति 4 के संशोधन के लिए आवश्यक प्रोटीन प्रदान करता है कि जीन की अभिव्यक्ति के विशिष्ट पैटर्न की प्रेरण का परिणाम है. दीर्घकालिक यादों के गठन मध्यस्थता जीन विनियामक नेटवर्क की पहचान ट्रांसक्रिप्शनल कार्यक्रमों के प्रमुख तत्वों की पहचान के लिए स्मृति गठन, साथ ही लक्ष्य के विनियमन के मौलिक सिद्धांतों में अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा कि उम्मीद के साथ, आणविक तंत्रिका विज्ञान के एक केंद्रीय सिद्धांत है neurodegenerative और neuropsychiatric विकारों का इलाज. Transcriptional कार्यक्रमों विकास के लिए महत्वपूर्ण हैं जो अलग चरित्र के जीन, सांकेतिक शब्दों में, जिनमें से प्रत्येक अस्थायी परिभाषित लहरों में प्रकाशितसंकेतन घटना 1,2 के परिणाम के कार्यान्वयन में ifferent चरणों. यह प्रेरित जीन की पूर्ण पूरक की पहचान, और उन्हें शामिल करने की गतिशीलता के अनुसार उनके संभावित समारोह में जानकारी हासिल करने के लिए इतनी के रूप में, एक विस्तृत लौकिक timescale पर ट्रांसक्रिप्शनल गतिशीलता पता करने के लिए महत्वपूर्ण है.
मादक पदार्थों की लत मस्तिष्क 5,6 में तंत्रिका सर्किट पर दुरुपयोग की दवाओं के लंबे समय से स्थायी प्रभाव की वजह से अनुभव पर निर्भर plasticity की एक मजबूत रूप है. दवाओं के लिए प्रारंभिक, तीव्र जोखिम की लत के विकास और जीर्ण उपयोग करने के लिए संक्रमण हो सकता है. प्रासंगिक जानकारी लत के विकास में एक महत्वपूर्ण तत्व है. ड्रग से जुड़े पर्यावरण संकेतों नशीली दवाओं के नशेड़ी के मन में महत्वपूर्ण महत्व आवंटित कर रहे हैं. दवा लालसा को पलटा पैदा कर सकते हैं अतीत दवा अनुभव की एक दवा abuser याद दिलाने प्रासंगिक जानकारी भी दवा जोखिम 7,8 से संयम की लंबी अवधि के बाद.इसलिए लत में महान नैदानिक चुनौती – लक्षण 9 थम जाने के बाद नशा की प्रवृत्ति भी लंबे समय डूबने के लिए.
कोकीन को व्यवहार संवेदीकरण मादक पदार्थों की लत के तंत्र के अध्ययन में उपयोगी कोकीन अनुभव का एक सरल मॉडल है. दुरुपयोग की दवाओं के लिए पुरानी जोखिम से प्रेरित लंबे समय से स्थायी संवेदीकरण के लिए यह व्यापक रूप से अध्ययन किया मॉडल में, कृन्तकों पहले खारा इंजेक्शन (intraperitoneal, आईपी) के आदी रहे हैं एक उपन्यास वातावरण में (उनकी हरकत गतिविधि पर नजर रखी है जिसमें एक खुले मैदान कक्ष) ; उनकी गतिविधि 10 (चित्रा 1) पर नजर रखी है, जबकि उसके बाद, वे खुले मैदान कक्षों में कोकीन के दैनिक इंजेक्शन प्राप्त करते हैं. इस व्यवहार प्रतिमान आम तौर पर एक perv के गठन का प्रदर्शन, कोकीन इंजेक्शन की समाप्ति के बाद के महीनों की अवधि के लिए बनाए रखा है, जो (8-12 गुना आधारभूत गतिविधि से ऊपर) हरकत व्यवहार 11, की एक मजबूत संवेदीकरण में परिणामदवा अनुभव के asive स्मृति ट्रेस.
स्वाभाविक रूप से एक प्रजाति की सफलता (जैसे खिला, सेक्स) के लिए आवश्यक व्यवहार को मजबूत करने में शामिल इनाम के तंत्रिका circuitry, दवा जुड़े व्यवहार 12,13 को सुदृढ़ करने के लिए दुरुपयोग की दवाओं द्वारा शोषण किया जाता है. दुरुपयोग की दवाओं का अनुभव बढ़ाया है जिसके द्वारा आणविक और सेलुलर तंत्र अन्य मस्तिष्क संरचना 14 में कथात्मक या अर्थ यादों के गठन के अंतर्निहित तंत्र के समान दिखाई देते हैं. इसलिए, व्यवहार संवेदीकरण मॉडल की मजबूती यह अनुभव पर निर्भर plasticity के तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक आकर्षक मॉडल प्रणाली बनाता है.
नाभिक accumbens (एनएसी) मस्तिष्क का इनाम circuitry के एक केंद्रीय करनेवाला है, और बड़े पैमाने पर की लत 5,6 के विकास के साथ संबद्ध किया गया है. लत के गठन के नाभिक accumbens में उपन्यास प्रोटीन का प्रतिलेखन पर निर्भर करता है, और मजबूतस्पष्ट रूप से संरचित प्रतिलेखन कार्यक्रमों की duction कोकीन अनुभव 15-19 निम्नलिखित एनएसी में मनाया जाता है. कोकीन प्रदर्शन करने के लिए तीव्र ट्रांसक्रिप्शनल प्रतिक्रिया मजबूत प्रेरण प्रोत्साहन के लिए अनुकूल है और नए प्रोटीन के उत्पादन को निर्देशित करने के क्रम में कई स्तरों पर कार्य करने की संभावना है कि दवा 6,19-22 के लिए जोखिम से प्रेरित संरचनात्मक और electrophysiological परिवर्तन के लिए जिम्मेदार हैं.
मस्तिष्क में अनुभव पर निर्भर plasticity की आणविक तंत्र के अध्ययन को बढ़ावा देने के क्रम में, एक प्रोटोकॉल व्यवहार हेरफेर निम्नलिखित मस्तिष्क के ऊतकों के नमूनों में प्रतिलेखन गतिशीलता के व्यापक विश्लेषण के लिए वर्णित है. ट्रांसक्रिप्शनल विश्लेषण के लिए microfluidic गतिशील सरणियों उपयोग, कोकीन को व्यवहार संवेदीकरण – प्रोटोकॉल Citri प्रयोगशाला में अध्ययन व्यवहार अनुभव के संदर्भ में यह साफ है. वर्णित प्रोटोकॉल जाहिर टी का अध्ययन करने के लिए ही सीमित नहीं हैवह व्यवहार संवेदीकरण के संदर्भ में accumbens नाभिक है, लेकिन व्यवहार मानदंड और मस्तिष्क क्षेत्रों की एक बड़ी संख्या के लिए लागू किया जा सकता है. वास्तव में, इस प्रोटोकॉल मस्तिष्क के बाहर शरीर के ऊतकों को लागू किया जा सकता है, और अनुभवों या जीव की जोड़तोड़ की एक किस्म का अध्ययन किया.
प्रोटोकॉल मोटे तौर पर चार चरणों में बांटा गया है. पहले चरण में, पशु व्यवहार प्रतिमान के अधीन है; दूसरे चरण में ऊतक microdissected है; तीसरे चरण में – mRNA, शुद्ध-लिखित रिवर्स और जांच की, और अंतिम चरण में डेटा का विश्लेषण किया जाता है.
ट्रांसक्रिप्शनल गतिशीलता के अध्ययन के संदर्भ में अनुभव के सटीक समय और परिभाषा नियंत्रित करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण प्रयोगात्मक मापदंडों शायद रहे हैं. इस कारण से, चुनाव के हमारे व्यवहार मॉडल है कि कोकीन के लिए व्यवहार संवेदीकरण, अनुभव के मापदंडों से अधिक प्रयोगकर्ता नियंत्रण के उच्च स्तर में सक्षम बनाता है जो एक प्रणाली की हैCE. अनुभव पर निर्भर plasticity या स्मृति गठन के विभिन्न मॉडलों सटीक समय सक्षम और पता है कि अतिरिक्त व्यवहार मानदंड उपलब्ध हैं. इन मॉडलों को डर कंडीशनिंग 23, तीव्र पर्यावरण संवर्धन 24,25, उपन्यास वस्तु की खोज 26 और अंधेरे पालन 27 निम्नलिखित दृश्य अनुभव शामिल हैं. फिर भी, कोकीन को व्यवहार संवेदीकरण एक लगातार मजबूत व्यवहार हेरफेर कोकीन अनुभव 28 के बाद के महीनों के लिए रहता है, जो एक अत्यंत व्यापक स्मृति ट्रेस बनाने, है.
मस्तिष्क नाभिक accumbens की पुस्तिका microdissection द्वारा पीछा किया, sectioned है. यह तेजी से तैयार मस्तिष्क के स्लाइस से मार्गदर्शन microdissection व्यवहार प्रतिमान के लिए प्रासंगिक ऊतक निकालने का सबसे विश्वसनीय और तेजी से विधि प्रदान करता है कि हमारे अनुभव रहा है, और अनुभव के साथ, ऊतक की सीमाओं को मान्यता दी आसानी से स्पष्ट हो गया है और. वैकल्पिक रूप से, ठीक स्लाइस prepar हो सकता हैलेजर कब्जा microdissection द्वारा पीछा एड,. इस विधि अत्यधिक रुचि के क्षेत्र का चित्रण परिभाषित सक्षम बनाता है, यह, (इस प्रकार अस्थिर mRNA की हानि खतरे में डाल) थकाऊ धीमी है और महंगा समर्पित उपकरण (एक लेजर कब्जा सेटअप के साथ लगे एक माइक्रोस्कोप) की आवश्यकता है. यहां परिभाषित प्रोटोकॉल भी पैच pipettes 29 का उपयोग नेत्रहीन पहचान कोशिकाओं की कोशिका द्रव्य का मार्गदर्शन आकांक्षा से, एकल कोशिका ट्रांसक्रिप्शनल विश्लेषण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. यह ज्यादातर मामलों में, ऊतक के भीतर कोशिकाओं की केवल एक subpopulation वास्तव में अनुभव का जवाब देने में शामिल रहे हैं कि बहुत संभव है, जबकि वर्णित प्रोटोकॉल एक जनसंख्या औसत प्रदान करता है कि नोट करना महत्वपूर्ण है. यह अनुभव का जवाब देने के विशेष सेल आबादी के भीतर से एक चयनात्मक तरीके से प्रतिलेखन प्रोफाइल के लिए ब्याज की है, लेकिन इन तरीकों की चर्चा मौजूदा दायरे के बाहर है.
MRNA शुद्धि के लिए, रिवर्स प्रतिलेखन और qPCR क्वेरी, ऊतकव्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट के उपयोग द्वारा पीछा ठीक सुई, के माध्यम से इसे पारित द्वारा बाधित है (अधिक जानकारी के लिए, 8 तालिका देखें). चुनाव उच्च गुणवत्ता शाही सेना और बहाव के अनुप्रयोगों से मजबूत परिणाम की विश्वसनीय निकासी सुनिश्चित जो इन तरीकों के साथ अनुभव द्वारा सूचित किया है.
प्रोटोकॉल गतिशील सरणियों का उपयोग उच्च throughput qPCR के लिए वर्णित है, वहीं नमूने अंत बिंदु पीसीआर, कम throughput qPCR, जीन अभिव्यक्ति प्रोटीन या गहरी अनुक्रमण का उपयोग जीन की अभिव्यक्ति के लिए जांच की जा सकती. उच्च throughput qPCR गतिशील सरणियों के उपयोग के लिए वरीयता mRNA व्यवहार मानदंड निम्नलिखित अक्सर सीमित मात्रा है मस्तिष्क नाभिक से प्राप्त है कि इस तथ्य के कारण है. गतिशील सरणियों एक ही प्रयोग में समानांतर नमूनों की एक बड़ी संख्या से टेप के कुशल व्यापक विश्लेषण सक्षम बनाता है एक मंच प्रदान करते हैं. Microfluidic प्रणाली की प्रारंभिक अधिग्रहण (सामान्यतः एक संस्थागत पु बादrchase), प्रयोगों को चलाने के लिए अपेक्षाकृत सस्ती हैं. इस विश्लेषण के बाद, नमूने के आगे क्वेरी गतिशील सरणियों गुणवत्ता आश्वासन के लिए एक व्यापक संदर्भ प्रदान करने के साथ (प्रोटीन या RNAseq द्वारा) उपन्यास टेप के लिए खोज करने के लिए और अधिक महंगा प्लेटफार्मों का उपयोग किया जा सकता है. अंत में, डेटा विश्लेषण के लिए, मानक दृष्टिकोण का उपयोग कर रहे हैं. उत्पन्न हो सकती है कि मुद्दों के संबंध में विशिष्ट संकेत प्रोटोकॉल के पाठ में चर्चा की जाएगी.
इस प्रोटोकॉल कई शर्तों और प्रतिकृति का अध्ययन ब्याज की अपनी प्रणाली की गहन जांच में रुचि जांचकर्ताओं के लिए सबसे उपयुक्त है. प्रोटोकॉल भी पहले से ही वे बार बार क्वेरी में रुचि रखते हैं, जो ब्याज के 50-500 जीन, के एक सबसेट पर (माइक्रोएरे या RNAseq प्रयोगों के माध्यम से) में honed है जो जांचकर्ताओं के लिए सबसे उपयुक्त है.
व्यवहार मानदंड निम्नलिखित मस्तिष्क के ऊतकों से जीन अभिव्यक्ति के सफल लक्षण वर्णन पर निर्भर करता है: व्यवहार प्रतिमान के दौरान चूहों का 1) सावधानी से निपटने; ब्याज की ऊतक के 2) त्वरित और सटीक विच्छेदन; 3) आ?…
The authors have nothing to disclose.
This work has been funded by the Israel Science Foundation Grant (ISF # 393/12), Israel Centers of Research Excellence Grant (I-CORE 1796/12), German-Israel Foundation Grant (GIF # 2299-2291.1/2011) and the Marie Curie Career Integration Grant (FP7-PEOPLE-2013-CIG #618201). Initial steps in the project were funded by an AXA postdoctoral fellowship to AC. We acknowledge the generous startup funds provided by the Edmond and Lily Safra Center for Brain Sciences.
Critical reading by members of the Citri lab is greatly appreciated.
Virusol | Oriek Medical | J29D | |
Isoflurane, USP 100% | MINRAD INC | NDC 60307-110-25 | |
RNeasy plus Universal Mini Kit | QIAGENE | 73404 | |
QIAshredder | QIAGENE | 79654 | |
High Capacity cDNA Reverse Transcription kit | Invitrogene | AB-4368814 | |
TE Buffer | Invitrogene | 1355656 | |
Behaviour Chamber (MDF; 50X45cm) | Self assembled | ||
Inner Perspex box (30X30cm) | Self assembled | ||
camera and video recorder | Campden Inst | CMD-80051 | |
Media Recorder software | Noldus | NDS-NMR3-00M | |
Iris Scissors | FST | FST-14062-09 | |
Sagital Brain slicer with a 0.5mm section | Brain Tree Scientific | BS-AL-505S | |
Bioanalyzer | Agilent Technologies | The Agilent 2100 Bioanalyzer | |
Thermal cycler | Bio-Rad | 1852048 | |
Inverted microspun spatula | Bochem Instrument GmbH | 3213 | |
Biomark HD Reader | Fluidigm | BMHD-BMKHD | |
Dynamic array Chip for 96.96gene expression | Fluidigm | BMK-M-96.96 |