Uitgebreide analyse van de transcriptie van Brain Dynamics Monsters Na Behavioral Experience

Abstract

De codering van de ervaringen in de hersenen en de consolidatie van de lange-termijn geheugen is afhankelijk van gen transcriptie. Het identificeren van de functie van specifieke genen in het coderen ervaring is een van de belangrijkste doelstellingen van de moleculaire neurowetenschappen. Bovendien is de functionele organisatie van bepaalde genen met specifieke gedragingen heeft implicaties voor het begrijpen van de basis van neuropsychiatrische aandoeningen. Inductie van robuuste transcriptie's waargenomen in de hersenen van muizen na verscheidene gedrags manipulaties. Terwijl sommige genetische elementen herhaaldelijk worden gebruikt volgende verschillende gedragsmatige manipulaties en in verschillende hersenkernen transcriptionele programma's algemeen uniek voor het inducerende prikkels en de structuur waarin ze worden bestudeerd ^1,2.

In deze publicatie wordt een protocol beschreven voor robuuste en uitgebreide transcriptie profilering van hersenkernen van muizen in reactie op gedrags-manipulatie. Hetprotocol wordt aangetoond in het kader van de analyse van genexpressie dynamiek in de nucleus accumbens na acute cocaïne bieden. Na een bepaalde in vivo ervaring, het doelwit zenuwweefsel wordt ontleed; gevolgd door RNA-zuivering, reverse transcriptie en het gebruik van microfluïdische arrays voor een uitgebreide analyse van qPCR meerdere target genen. Dit protocol is gericht uitgebreide analyse (adressering 50-500 genen) beperken hoeveelheden uitgangsmateriaal, zoals kleine hersenstalen of enkele cellen.

Het protocol is het meest voordelig voor parallelle analyse van meerdere monsters (bijvoorbeeld enkele cellen, dynamische analyse na de farmaceutische, virale of gedragsproblemen verstoringen). Echter, kan het protocol ook dienen voor de karakterisering en de kwaliteitsborging van de monsters voorafgaand aan het hele genoom studies van microarrays of RNAseq, alsook de validering van gegevens die zijn verkregen uit het hele genoom studies.

Introduction

Dynamische organisatie van de hersenen in staat stelt cognitieve en gedragsmatige flexibiliteit. Ervaringen worden gecodeerd door wijzigingen in de structuur en sterkte van verbindingen tussen neuronen in de hersenen ^3. Deze "ervaringsafhankelijke plasticiteit" is het resultaat van inductie van specifieke patronen van genexpressie die de benodigde eiwitten voorziet modificatie van synaptische structuur en sterkte ^4. De identificatie van gen-regulatorische netwerken via de vorming van lange-termijn geheugen is een van de kernelementen van de moleculaire neurowetenschappen, met de verwachting dat de identificatie van de dominante elementen van de transcriptie-programma inzicht zal geven in de fundamentele beginselen die vorming van het geheugen, maar ook doelen voor behandeling van neurodegeneratieve en neuropsychiatrische aandoeningen. Transcriptionele programma ontvouwen in temporeel gedefinieerde golven, die elk coderen voor genen van andere aard, die belangrijk zijn voor different momenten in de uitvoering van de resultaten van de signalering evenement ^1,2. Het is daarom belangrijk om transcriptionele dynamiek richten op een uitgebreide tijdelijke tijdschema, teneinde de volledige complement van genen geïnduceerd identificeren en inzicht in de potentiële functie volgens de dynamiek van de inductie.

Drugsverslaving is een robuuste vorm van ervaring-afhankelijke plasticiteit veroorzaakt door de langdurige effecten van drugs op de neurale circuits in de hersenen ^5,6. Eerste, acute blootstelling aan middelen kan leiden tot de ontwikkeling van verslaving en de overgang naar chronisch gebruik. Contextuele informatie is een cruciaal element in de ontwikkeling van verslaving. Drugs geassocieerd omgevingsfactoren zijn groot belang toegekend in de hoofden van drugsgebruikers. Contextuele informatie herinneren een drugsgebruiker van verleden drugservaring kan terugval naar drugs verlangen opwekken, zelfs na lange periodes van onthouding van drugs blootstelling ^7,8.Vandaar de grote klinische uitdaging in verslaving - de neiging van verslaafden om nog lang recidief na ontwenningsverschijnselen zijn verdwenen ^9.

Sensitisatie is een eenvoudig model van cocaïne ervaring nuttig voor de studie van de mechanismen van drugsverslaving. In deze breed bestudeerde model voor de langdurige sensibilisatie veroorzaakt door chronische blootstelling aan drugs worden knaagdieren eerst gewend aan saline injecties (intraperitoneaal, IP) in een nieuwe omgeving (open veld kamer waarin de locomotorische activiteit bewaakt) ; dan krijgen ze dagelijkse injecties van cocaïne in het open veld kamers terwijl hun activiteit bewaakt ¹⁰ (figuur 1). Deze gedrags paradigma resulteert typisch in een robuuste sensibilisatie van locomotorische gedrag (8-12 voudig boven uitgangswaarde activiteit) ^11, die gedurende een periode van maanden na beëindiging van cocaïne injecties, waaruit de vorming van een pervasive geheugen sporen van drugs ervaring.

De neurale circuits van de beloning, van nature betrokken bij het ​​versterken van het gedrag van essentieel belang voor het succes van een soort (bijvoorbeeld voeding, geslacht), wordt uitgebuit door drugs tot drugs geassocieerd gedrag ^12,13 versterken. De moleculaire en cellulaire mechanismen die de ervaring van misbruik van drugs wordt versterkt lijken op de mechanismen die ten grondslag liggen aan de vorming van declaratieve of semantische herinneringen in andere hersenstructuren ¹⁴ te zijn. Daarom is de robuustheid van de sensitisatie model maakt het aantrekkelijk modelsysteem mechanismen ervaring plasticiteit onderzoeken.

De nucleus accumbens (NAC) is een centrale integrator van de hersenen van de beloning circuits, en is uitgebreid in verband met de ontwikkeling van verslaving ^5,6. De vorming van verslaving afhankelijk transcriptie van nieuwe eiwitten in de nucleus accumbens en robuustductie van duidelijk gestructureerde transcriptie programma's wordt waargenomen in de NAC volgende cocaïne ervaring ^15-19. De acute transcriptionele respons op blootstelling aan cocaïne is waarschijnlijk om te functioneren op verschillende niveaus om aan te passen aan de sterke inductie stimulans en om de productie van nieuwe eiwitten die zijn verantwoordelijk voor de structurele en elektrofysiologische veranderingen geïnduceerd door blootstelling aan het geneesmiddel ^6,19-22.

Om de studie van moleculaire mechanismen ervaring plasticiteit van de hersenen te bevorderen, wordt een protocol beschreven voor de uitgebreide analyse van transcriptie dynamica in hersenweefsel monsters na gedragsbeïnvloeding. Het protocol wordt weergegeven in de context van de gedrags ervaring bestudeerd in de Citri lab - sensitisatie, gebruik microfluïdische dynamische arrays voor transcriptionele analyse. De beschreven protocol is uiteraard niet beperkt tot het bestuderen thij nucleus accumbens in de context van sensitisatie, maar kan worden toegepast op een groot aantal gedragsparadigma's en hersengebieden. In feite kan dit protocol worden toegepast lichaamsweefsels buiten de hersenen en diverse ondergaat of manipulaties van het organisme onderzocht.

Het protocol is ruwweg verdeeld in vier stappen. In de eerste stap wordt het dier blootgesteld aan de gedrags paradigma; in de tweede stap het weefsel gemicrodissecteerde; in de derde stap - mRNA wordt gezuiverd, reverse getranscribeerd en gemerkt, en in de laatste stap de gegevens worden geanalyseerd.

In de context van transcriptionele dynamiek bestuderen, de precieze timing en definitie van de ervaring zijn waarschijnlijk de belangrijkste experimentele parameters te controleren. Daarom onze gedragsmodel keuze is die van sensitisatie, een systeem dat hoge experimentator regelaar maakt over de parameters van de experience. Bijkomende gedrags-paradigma's die precieze timing en adressen te activeren verschillende modellen van ervaring-afhankelijke plasticiteit of vorming van het geheugen beschikbaar zijn. Deze modellen zijn voorzien van angst conditionering ^23, acute kooiverrijking ^24,25, nieuw object exploratie ²⁶ en visuele ervaring volgende donkere opfok ^27. Toch sensitisatie is een solide en samenhangend gedrags manipulatie, waardoor een sterk doordringende geheugen trace die duurt maanden na cocaïne ervaring ^28.

De hersenen is verdeeld, gevolgd door handmatige microdissectie van de nucleus accumbens. Het is onze ervaring dat handmatige microdissection van snel voorbereid hersenplakjes biedt de meest betrouwbare en snelle methode voor het extraheren van het weefsel aan de gedrags-paradigma relevant, en met ervaring, de grenzen van het weefsel zichtbaar worden en dat makkelijk te herkennen. Als alternatief zou fijne plakjes prepar zijned, gevolgd door laser-microdissectie. Hoewel deze methode maakt het mogelijk zeer gedefinieerde afbakening van de regio van belang, het is traag (en dus het risico van verlies van labiele mRNA), vervelend en vereist dure speciale apparatuur (een microscoop voorzien van een laser-capture setup). Het protocol hierin gedefinieerd kan ook worden aangepast om eencellige transcriptionele analyse handmatig aspiratie van cytoplasma visueel geïdentificeerde cellen middels patch pipetten ^29. Het is belangrijk op te merken dat de beschreven protocol verschaft een populatiegemiddelde, terwijl het zeer waarschijnlijk dat in de meeste gevallen slechts een subpopulatie van de cellen in het weefsel daadwerkelijk betrokken als reactie op de ervaring. Het is van belang transcriptie profileren selectieve wijze vanuit specifieke celpopulaties reageren op de ervaring, maar bespreking van deze benaderingen is dan de huidige scope.

Voor mRNA-zuivering, reverse-transcriptie en qPCR opvragen, het weefselwordt verstoord door het door fijne naalden, gevolgd door het gebruik van in de handel verkrijgbare kits (voor meer informatie, zie Tabel 8). De keuze wordt geïnformeerd door de ervaring met deze methodieken, die betrouwbare extractie van hoge kwaliteit RNA en robuuste resultaten van downstream-toepassingen te verzekeren.

Terwijl het protocol beschreven voor high-throughput qPCR behulp dynamische arrays kunnen monsters worden gesondeerd genexpressie middels eindpunt PCR, low-throughput qPCR genexpressie microarrays of diepe sequencing. De voorkeur voor high-throughput qPCR behulp dynamische arrays komt door het feit dat mRNA verkregen hersenkernen volgende gedragsparadigma's vaak beperken hoeveelheden. Dynamische arrays bieden een platform dat efficiënte uitgebreide analyse van transcripten mogelijk maakt uit een groot aantal parallelle monsters in een enkel experiment. Na de eerste overname van de microfluïdische systeem (meestal een institutionele purchase), experimenten relatief lage bedrijfskosten. Naar aanleiding van deze analyse, kan verdere bevraging van de monsters worden uitgevoerd met behulp duurder platforms om te zoeken naar nieuwe transcripties (door microarrays of RNAseq) met de dynamische arrays bieden een uitgebreide referentie voor kwaliteitsborging. Tenslotte, voor gegevensanalyse, standaard benaderingen worden gebruikt. Specifieke aanwijzingen met betrekking tot problemen die zich kunnen voordoen zal in de tekst van het protocol worden besproken.

Dit protocol is het meest geschikt voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in een grondig onderzoek van hun systeem van belang, het bestuderen van meerdere voorwaarden en herhalingen. Het protocol is ook het meest geschikt voor onderzoekers die reeds in zijn aangescherpt (door middel van microarray of RNAseq experimenten) op een subset van 50-500 genen van belang, dat ze geïnteresseerd zijn in herhaaldelijk bevragen.

Protocol

OPMERKING: Het protocol volgt het dier zorg richtlijnen van de Hebreeuwse Universiteit van Jeruzalem.

1 Bereiding van ACSF Solution

1. Bereid ACSF oplossing zoals beschreven in Tabel 1. Voeg 1 L in DDH ₂ O (> 18 MQ zuiverheid), waardoor osmolariteit tot ~ 300 mOsm / L met geschikte toevoeging van water en NaCl.

2 Apparatuur en Room Set Up

De apparatuur voor de monitoring van cocaïne geïnduceerde locomotorisch gedrag bestaat uit het gedrag van de kamers (50 x 45 cm) bedraad met een inwendige lichtbron, ventilator en een camera (of infrarood sensoren), en uitgerust met een inwendige perspex doos (30 x 30 cm) in waarbij de muizen vrij kunnen bewegen terwijl hun voortbeweging wordt bewaakt. De gedrags-testen moeten worden uitgevoerd tussen 1 uur na lichten op tot 1 uur vóór lichten uit, op een regelmatige licht / donker-cyclus. De dieren moeten consequent elke dag getraind worden op hetzelfde moment.

1. Reinig de kamers na elk experiment met een ontsmettingsmiddel door muis, en / of geur verwijderen reagens om olfactorische cue vertekening te voorkomen en een goede ontsmetting.

BELANGRIJK: Tijdens de behandeling van de muizen stil, rustig en voorzichtig.

3 Animal Voorbereiding

1. Huis 5 C57BL6 mannelijke muizen (6-12 weken oud; ~ 25-35 gram gewicht) per kooi, in een kamer met een 12 uur licht / donker cyclus en vrije toegang tot voedsel en water, volgens de normen en eisen van de lokale Animal zorg begeleiding en protocollen Comite. Vóór de start van het experiment, wegen de muizen en meld de gegevens. Cocaïne wordt later toegediend overeenkomstig het gewicht van de muizen.
2. De overdracht van alle kooien met muizen in de gedrags-kamer 30 min voor aanvang van de eerste proef.
3. Gewennen allemuizen in het experiment Experimenter hanteren, injecties en toezicht bij het gedrag opstart. Dit wordt bereikt door 3 opeenvolgende dagelijkse intraperitoneale injecties van 250 pl zoutoplossing zoals hieronder beschreven.
4. Dien een intraperitoneale injectie van 250 ul zoutoplossing. Onmiddellijk na de injectie, plaatst u de muis in een gedrag kamer om de locomotorische activiteit te monitoren gedurende 15 minuten. Herhaal deze actie voor 3 opeenvolgende dagen, op hetzelfde tijdstip iedere dag.
5. Op de vierde dag, verdeel de muizen in twee groepen. Bereid een voorraadoplossing van cocaïne 2 mg / ml in zoutoplossing. Dien een enkele injectie van cocaïne-oplossing (uiteindelijke 20 mg / kg) aan de experimentele groep overeenkomstig het gewicht van de muis (bijvoorbeeld een muis 25 g - injecteer 250 pl, dat 30 g muis krijgt 300 pi). Dien zoutoplossing om de controlegroep. Onmiddellijk na de injectie, plaatst u de muis voor 20 min in een gedrag kamer voor monitoring van bewegingsactiviteit (typicbondgenoot, zijn de eerste 15 min gecontroleerd).
6. Na cocaïne injectie offeren de muizen op verschillende tijdstippen (0, 1, 2, 4, 8 en 24 uur na injectie). Belangrijker is, zorg ervoor dat referentie-muizen (0 tijdstip) elke injectie niet krijgt op deze dag. Door zijn betekenis, is het noodzakelijk om herhalingen van de referentiegroep omvatten.

4 Dissectie van de nucleus accumbens

1. Verdoven van de muizen met isofluraan op het juiste moment na de cocaïne / zoutoplossing injectie. De isofluraan moet direct worden afgevoerd uit de kamer. Daarom moet de procedure worden uitgevoerd in een zuurkast.
2. Bewaken van de diepte van de anesthesie door het testen van de achterste voet reflex. Knijp de poot van een terugtrekking reactie van het dier te lokken. Een dier dat een reflex toont is niet een chirurgische anesthesieniveau en niet in staat om inslapen.
3. Extractie van de hersenen:
   1. Euthanaseren de muis door onthoofding.
   <li> Verwijder de huid boven het midden van de schedel en snijd de schedel met een scherpe schaar.
   2. Plaats de schaar op het punt waar het ruggenmerg komt de hersenen (foramen magnum) en maak twee zijdelingse sneden.
   3. Vanaf hetzelfde punt, maak een lange sagittale versnijding in de pijlnaad. Bij het bereiken van de bulbus olfactorius, clip naar links en rechts.
   4. Met een pincet, verwijder de schedel zorgvuldig, grijpen elke helft van de schedel stevig en trekken naar de kant, zorg ervoor dat u drukt op of schade aan de hersenen.
   5. Verwijder de hersenen terwijl doorsnijden van het craniale zenuwen via een omgekeerde micro lepel spatel.
4. Plaats de hersenen in een ijskoude ACSF oplossing voor 1-2 minuten om te relaxen en te verharden.
5. Verwijder de hersenen uit de ACSF, lont overtollig vocht met een papieren handdoek, maak een coronale snede tussen de kleine hersenen en de rest van de hersenen en lijm de hersenen, met de rostrale deel naar boven op de vibratome podium.
6. Het snijden van de NAC: Handhaaf ACSF oplossingen bij ijskoude temperaturen in het snijden kamer van de vibratome. Sectie bij 200 micrometer tot de nucleus accumbens (NAC) is duidelijk geïdentificeerd volgens de Paxinos en Franklin Mouse Brain Atlas (ongeveer 1,8 mm anterior naar Bregma, aandacht te besteden aan de vorm van het corpus callosum, de ligging en de vorm van de voorste commissuur en de ventrikels, en de totale morfologie van de hersenpreparaat). Op dit moment maken twee 400 urn secties, waarvan de NAC wordt ontleed.
7. Onder een stereoscoop, gebruik een fijne tanden om de NAC gebied ontleden uit de plakjes. De definitie van de NAC is volgens de Paxinos en Franklin muizenhersenen atlas, en kon gemakkelijk in de juiste vakken worden doorsneden door vier snelle passes van het blad op het weefsel. (Figuur 2).
8. Plaats NAC secties direct in 900 ul Trizol lysisreagens in een microcentrifugebuis en bewaar bij -80 ° C tot RNA extractie.

5 RNA-extractie en cDNA reverse transcriptie

1. Ontdooi de buizen die nucleus accumbens gedeelten in Trizol lysis reagens bij kamertemperatuur en homogeniseer het lysaat met een 1 ml spuit verbonden 25 G naald totdat het weefsel volledig gehomogeniseerd (minstens 15-20 keer). De eerste paar ronden moeilijk, en vereist duwen het weefsel tegen de wand van de buis om het breken in kleine stukjes die de punt van de naald kon komen.
2. Om homogenisatie garanderen, pipet het lysaat in een Qiashredder mini centrifugekolom en centrifugeer bij 12.000 xg gedurende 1 minuut.
3. Pipet het lysaat in nieuwe microcentrifugebuis en pak het RNA volgens de instructies van de fabrikant. Bewaar het RNA bij -80 ° C tot gebruik.
4. Meet de RNA-concentratie, analyseren de integriteit en de kwaliteit van het gebruik van een Bioanalyzer of gelijkwaardige apparatuur. Gebruik 100-500 ng RNA voor elke ronde van cDNA voorbereiding met random hexameerprimers.

6 Primer Ontwerp en Primer testen

1. Het kiezen van goede primers: Voor een optimale primer paar voor qPCR van mRNA-transcripten, volgt u deze eisen (Figuur 3):
   1. Ontwerp van primers die niet meer dan 17-28 basen. Vermijd nucleotide herhalingen als ze bevorderen mispriming.
   2. Ontwerp primers met smelttemperatuur _(Tm) tussen 56-68 ° C (optimaal 60-64 ° C). De T _m in het primerpaar moet binnen 1 ° C van elkaar.
   3. Wees ervan bewust dat het product grootte idealiter zou moeten zijn tussen de 80 en 150bp.
   4. Zorg ervoor dat ten minste een van de primers omvat een exon-exon junctie of de amplicon bevat een groot intron (intron-spanning), amplificatie van genomisch DNA te vermijden verontreinigingen.
   5. Gebruik een betrouwbare software gebaseerd op Primer3 (voor voorbeelden zie tabel 2) om de primer ontwerp te verbeteren.
2. Het testen van de prIMERS: Om de specificiteit en efficiëntie van de primers dient een controle qPCR reactie worden uitgevoerd:
   1. Gebruik een positief monster (met cDNA template voor alle relevante primer paren) en titreer de cDNA (bijvoorbeeld acht drie-voudige verdunningen van een initiële concentratie van ~ 10 ng) in tweevoud parallel reacties. Onder meer een no-template controle, die controleert op besmetting binnen de voor de reactie oplossingen.
   2. Bereken primer efficiëntie met de formule: (10 ^{(- 1 / helling)} -1) x 100, zodat de curve van de optimale helling - 3,333 (ie 10 ^{(- 1 / 3,333)} = 2) (figuur 4).
   3. Bepaal de specificiteit van de versterking. Specifieke amplificatie wordt aangetoond door een prominente piek bij al deze smeltcurven van de geamplificeerde producten, terwijl off-target amplificatie als een duidelijke afwijking fr lijktOM de enkele grote piek.

7 qPCR Analyse

1. Voorversterking:
   1. Uitgebreide qPCR analyse is gebaseerd op parallelle opvragen beperken hoeveelheden RNA met een groot aantal primerparen. Daarom is een stap van pre-amplificatie is essentieel. In deze stap, de cDNA ondergaat 14-18 cycli van pre-amplificatie met een mengsel van de primers die worden gebruikt voor het opvragen van het monster in de toekomst (tot 800 primerparen).
   2. Verdun alle primers in TE (laag EDTA) aan 50 uM voor specifieke Target Amplification (STA).
   3. Pool samen 1 pi aliquots van alle 50 uM primer sets worden opgenomen in de STA reactie tot 800 assays.
   4. Bereid voormengsel en monsters voor STA zoals beschreven in Tabel 3. Zijn toegestaan ​​voor vergist bereiden mix voor 110% van het aantal monsters dat moet worden geamplificeerd.
   5. Aliquot 3.75 ul STA pre-mix voor elk monster. Voeg 1,25 picDNA aan elk.
   6. Vortex de reacties en centrifuge meng gedurende 10 sec.
   7. Plaats de STA reacties in een PCR-apparaat en de cyclus, zoals aangegeven in tabel 4.
2. Exonuclease I (ExoI) behandeling:
   1. Verdun het Exo I zoals aangegeven in tabel 5.
   2. Voeg 2 pi van verdunde ExoI (4 U / pl) aan elke 5 ul STA reactie, vortex, spin down (> 6.000 xg) en plaats in een PCR-apparaat bij 37 ° C gedurende 30 minuten en vervolgens bij 80 ° C gedurende 15 minuten.
   3. Verdun de eindproducten tot een geschikte concentratie te testen. Gebruik TE buffer (voeg 43 ul TE-buffer om de 7 pl monster TSA).
   4. Bewaar de verdunde STA producten bij -20 ° C of onmiddellijk te gebruiken.
3. Primer en monster setup voor qPCR:
   1. Bereid monsters getoond in Tabel 6. Bereid mix volgens de bij dit experiment chip en samples toevoegen nodig.
   2. Agitate Sample Mix oplossingen minimaal 20 seconden en centrifugeer (> 6000 xg) gedurende ten minste 30 sec. Bereide reacties kunnen worden opgeslagen korte perioden bij 4 ° C totdat de chip kunt leggen.
   3. Bereid de testen zoals beschreven in Tabel 7.
   4. Schud het Assay Mix minimaal 20 seconden en centrifugeer (> 6000 xg) gedurende ten minste 30 seconden te spinnen neer alle componenten.
      BELANGRIJK: Vortex grondig en centrifuge alle monster en test oplossingen voor pipetteren in de chip inhammen. Doet u dit niet kan leiden tot een afname van de kwaliteit van de gegevens.
      OPMERKING: De eindconcentratie van elke primer 5 uM in de inlaat en 500 nM in de uiteindelijke reactie.
4. Priming en laden Dynamic Array IFC (geïntegreerd fluïdumkringloop) chip. De IFC chip heeft inlaten voor monstername, testen, alsmede met specifieke inlaten (accumulatoren) voor stuurleiding vloeistof (minerale olie) gebruikt om de microfluïdische kamers druk (Figure 4A).
   1. Injecteer bedieningsleiding fluïdum in elke accumulator op de chip.
   2. Verwijder de blauwe beschermfolie ontdoen van de bodem van de chip.
   3. Plaats de chip in de juiste IFC controller (controller MX voor 48.48 Dynamic Array IFC of de IFC controller HX voor 96.96 Dynamic Array IFC), voer de Prime (113x) script voor de 48.48 Dynamic Array IFC of de Prime (136x) script voor de 96.96 Dynamic Array IFC om prime de chip.
   4. Wanneer het script klaar is, verwijder het gegronde chip van de IFC-controller.
   5. Pipet 5 pi van elke Assay Mix en 5 ul van elk monster Mix in hun inlaten.
   6. Breng de chip naar de IFC-controller.
   7. Met behulp van de IFC-controller software, voert u de Load Mix (113x) script voor de 48.48 Dynamic Array IFC) of Load Mix (136x) script voor de 96.96 Dynamic Array IFC aan de monsters en analyses te laden in de chip. Wanneer de belasting Mix script klaar is, verwijder de belastinged chip van de IFC-controller.
   8. Laad de chip op het PCR-apparaat, maakt u een nieuwe chip run (volgens de fabrikant richtlijnen), met inbegrip van smeltcurveanalyse. Met behulp van de PCR-apparaat software, ervoor te zorgen dat de reactiekamers behoren worden erkend, en laat de reactie uit te voeren naar de voltooiing.

8 Data Analysis

1. Kwaliteitsborging: Om de kwaliteit van gegevens te waarborgen, controleert de kwaliteit van de primers door het aanpakken verdunningskrommes (zoals hierboven beschreven). Controleer de specificiteit van amplificatie door het bekijken van de smeltcurven van amplicons, de pieken waarvan er optimaal goed uitgelijnd ^29.
2. Visualisatie: Voor visualisatie van grote hoeveelheden data obtained by high-throughput qPCR gebruik door programmatuur gegenereerde heatmaps, waarbij expressie kleurcode van intensiteit. Daarnaast tonen de transcriptie dynamiek van enkele genen als bekleed puntgrafieken.
3. Publicatie: In het publicerende resultaten genexpressie, is het aangeraden om de MiQE richtlijnen volgen voor de publicatie van kwantitatieve real-time PCR-experimenten, waarin de minimale informatie die moet worden opgegeven voor een qPCR experiment om de relevantie, nauwkeurigheid, juiste interpretatie, en reproduceerbaarheid te waarborgen.

Representative Results

De kwaliteit van de door die dit protocol results cruciaal hangt af van een aantal parameters. Een goede experimentele planning leidt tot minimale verstoring van de experimentele muizen, zodat de geteste ervaring (in dit voorbeeld, dat blootstelling aan cocaïne) de meest dominante ervaring in hun recente geschiedenis en derhalve resulteert in een sterke en specifieke transcriptionele programma. Figuur 1 beschrijft de experimentele plan voor sensitisatie, het definiëren van de tijdstippen volgende cocaïne ervaring waarbij de nucleus accumbens wordt doorsneden van muizen en geanalyseerd. De volgende cruciale punt is dat het definiëren van de exacte grenzen voor excisie van de echte weefsel voor analyse. Figuur 2 beschrijft de grenzen van de nucleus accumbens in coronale en sagittale secties. Bij voorkeur is de dissectie moet zodanig worden uitgevoerd dat een dunne marge NAc weefsel buiten de regio taken voor profilering. Dit zorgt voor een consistente profilering alleen van de NAC, het verminderen van de variabiliteit en de kans op artefacten ten gevolge van opname van het omringende weefsel.

Wanneer amplificeren beperking hoeveelheden RNA, als in de dissectie van kleine hersenen kernen vele cycli van amplificatie zijn noodzakelijk voor een goede detectie van het signaal. Daarom is een belangrijk punt in kwantitatieve PCR experiment nog versterkt bij het ​​werken met kleine hoeveelheden uitgangsmateriaal, is karakterisering van de primers die voor amplificatie. Figuur 3 beschrijft belangrijke functies definiëren optimale primers, en figuur 4 toont de curven van amplificatie primers gericht tegen c-Fos en FosB, waaruit blijkt dat deze primerparen versterken hun doelwit transcript van ~ 100% efficiëntie bij elke cyclus. Volgende primer validatie en vaststelling van de juiste experimentele paradigma om duidelijke evaluatie van de transcriptie van het doel tiss mogelijkue uitgebreid analyse kan worden uitgevoerd op de Fluidigm Biomark platform, waarmee tot 9216 parallel qPCR reacties (in de vorm 96,96 Figuur 5). Deze high-throughput platform maakt parallelle analyse van veelvoudige experimentele herhalingen, waarbij dezelfde experimentele condities op een enkele chip. Gegevens voor viervoudige experimentele herhalingen aanpakken van de transcriptionele inductie van c-Fos en FosB na acute cocaïne bieden, worden getoond in figuur 6.

Figuur 1 Experimentele paradigma voor dynamische transcriptionele analyse na cocaïne bieden. (A) Experimenteel protocol - muizen zijn gewend aan de behandeling en de injectie voor 3 dagen, terwijl het toezicht op de bewegingsactiviteit door video volgen in een geluiddempende gedrag kamer. Muizenzijn dan cocaïne ervaring onderwerp; een enkele blootstelling = acute cocaïne ervaring; 5 opeenvolgende injecties worden genoemd chronische blootstelling. Een enkele injectie volgende ≥16 dagen van onthouding van cocaïne wordt aangeduid als een cocaïne uitdaging. Transcriptionele dynamiek zich op verschillende experimentele tijdstippen na cocaïne experience (1, 2, 4, 8, 24 uur). (B) Plot van de muis spoor binnen de kamer gedrag volgende 3 dagen zoutoplossing injectie of 3 dagen zoutoplossing + a enkele acute blootstelling cocaïne. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2 Plaats van de nucleus accumbens in de hersenen van muizen. Dikke witte lijnen markeren de plaats van bezuinigingen het definiëren van de b oundaries van de NAC (A) coronale sectie;. (B) Sagittale sectie. (Foto overgenomen van de Allen Brain Atlas Reference Atlas Afbeeldingen:. http: //atlas.brain- map.org/atlas?atlas=1&plate=100960352 ; http: //atlas.brain- map.org/atlas?atlas=2&plate = 100.883.869 ). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3 Planning qPCR primers. Richtlijnen voor het plannen van qPCR primers, met definities voor specificiteit, stabiliteit en compatibiliteit. 2fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4 Evaluatie van primer efficiëntie. (A) De resultaten van de amplificatie curves van Fos en FosB behulp Fluidigm IFC arrays. Een standaard kromme werd gemaakt op basis van zeven seriële 3-voudige verdunningen van totaal RNA geëxtraheerd uit muis NAc en onderzocht voor expressie van Fos en FosB. (B) De efficiëntie van het primerpaar voor Fos en FosB werd geëvalueerd door het uitzetten van de cyclus drempelwaarde ( Ct) bij elke verdunning tegen de logaritme van de verdunning van het monster. De efficiëntie van de primers worden berekend uit de helling van de standaardkromme, zoals gedefinieerd in de tekst. De versterking bochten en punten op de verdunning curve zijn in bijpassende kleur.51642 / 51642fig4highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 5 Comprehensive qPCR profiling toepassen van de Fluidigm platform. (A) 96.96 Dynamic Array IFC voor real-time kwantitatieve PCR. De primers worden in de inlaten in de rechterzijde geladen, en de monsters worden in de inlaten in de linkerkant van de chip geplaatst. Dit cijfer is aangepast met toestemming van Fluidigm Real Time PCR analyse User Guide. (B) Hitte kaart van de qPCR resultaten, wat neerkomt op Ct-waarden voor elk goed op de chip. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 6 Voorbeeld resultaten van meningsuiting dynamiek na een acute blootstelling aan cocaïne. Cocaïne-geïnduceerde expressie van c-Fos en FosB weergegeven als functie van de tijd. Gemiddelden van viervoudige experimentele herhalingen, uitgevoerd volgens het protocol hierin gedefinieerd, worden weergegeven, samen met de foutmelding bars portretteren standaardafwijking van het gemiddelde.

Reagens	MW	mM	g / L
NaCl (Sigma-Aldrich, 71376)	58,44	119	6.95
NaHCO3 (Sigma-Aldrich, S6014)	84.01	26	2.18
Glucose (Sigma-Aldrich, G8270)	180.16	10	1.8
KCl (Sigma-Aldrich, P9541) d>	74.55	2,5	0.186
NaH 2 PO 4 (Sigma-Aldrich, S9638)	137,99	1	0.138
MgSO4 ⋅7H 2 O (Sigma-Aldrich, M1880)	246,5	4	0.99
CaCl2 (Sigma-Aldrich, C3011)	147	4	0.59

Tabel 1 ACSF oplossing.

Software naam	Toepassing	web locatie
Roche Probefinder	ontwerp van primers	http://qpcr.probefinder.com/organism.jsp
NCBI primer-blast	ontwerp van primers	http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

ve_content "> Tabel 2 Software lijst.

Reagens	Volume / Reaction (pl)	Volume voor 48 Reacties + 10% overmaat (pl)	Volume voor 96 Reactions + 10% overmaat (pl)
2X TaqMan PreAmp Master Mix (Applied Biosystems)	2,5	132	264
500 nM (10X) samengevoegd primermengsel	1	52.8	105,6
Water	0.25	13.2	26.4
cDNA	1.25
Totaal Volume	5

Tabel 3 STA reactieoplossing.

Voorwaarde	Houd	10-14 Cycles	Houd
Temperatuur	95 º C	95 º C	60 º C	4 º C
Tijd	10 min	15 sec	4 min	∞

Tabel 4 Thermische cyclusomstandigheden voor voorversterking.

component	Per 5 pl Steekproef (pl)	48 Monsters met Extra dataverkeer (pl)	96 Monsters met Extra dataverkeer (pl)
Water	1.4	84	168
Exonuclease Ik Reaction Buffer	0,2	12	24
Exonuclease I bij 20 eenheden / gl	0,4	24	48 </ Td>
Totaal Volume	2.0	120	240

Tabel 5 ExoI reactieoplossing.

</ Tr>

MONSTER MIX	Component Volume per Inlet (pl)	Volume per Inlet met Extra dataverkeer (pl)	Volume voor 48.48 Dynamic Array IFC (pi) (120 monsters)	Volume voor 96.96 Dynamic Array IFC (pi) (120 monsters)
2X SsoFast EvaGreen Supermix met Low ROX (Bio-Rad, PN 172- 5211)	2,5	3	180	360
20X DNA Binding Dye monster laden reagens (Fluidigm, PN 100-3738) groene dop	0.25	0,3	18	36
STA en ExoI behandelde monster	2.25	2.7
Totaal	5	6

Tabel 6 Voorbeeld Pre-Mix oplossing.

Tabel 7 Assay Mix oplossing.

Component	Volume per Inlet (pl)	Volume per Inlet met Extra dataverkeer (pl)	Volume voor 48.48 Dynamic Array IFC (pl)	Volume voor 96.96 Dynamic Array IFC (pl)
2X Assay Laden reagens	2,5	3	180	360
1X DNA Suspension Buffer (TE laag EDTA)	2	2.4	144	288
50 uM elk gemengd Vooruit en achteruit primers	0.5	0.6
Totaal Volume	5	6

Naam van het serum / Materiaal	Bedrijf	Catalogusnummer
Virusol	Oriek Medical	J29D
Isofluraan, USP 100%	MINRAD INC	NDC 60307-110-25
RNeasy plus Universal Mini Kit	QIAGENE	73404
Qiashredder	QIAGENE	79654
High Capacity cDNA reverse transcriptie kit	Invitrogene	AB-4368814
TE-buffer	Invitrogene	1355656

Tabel 8 Lijst van chemicaliën / reagentia.

Naam van Equipment	Bedrijf	Catalogusnummer
Gedrag Chamber (MDF, 50 x 45 cm)	Zelf geassembleerde
Inner perspex doos (30 x 30 cm)	Zelf geassembleerde
Camera en video recorder	Campden Inst	CMD-80051
Media Recorder software	Noldus	NDS-NMR3-00M
Iris Scissors	FST	FST-14062-09
Vibratome	Campden Inst.	7000SMZ-2
Bioanalyzer	Agilent Technologies	De Agilent 2100 Bioanalyzer
PCR-apparaat	Bio-Rad	1852048
Omgekeerde microspun spatel	Bochem Instrument GmbH	3213
Biomark HD Reader	Fluidigm	BMHD-BMKHD
Dynamische scala Chip voor 96.96 genexpressie	Fluidigm	BMK-M-96.96

Tabel 9 Equipment lijst.

Discussion

Succesvolle karakterisering van genexpressie van hersenweefsel na gedragsparadigma's hangt af van: 1) Een zorgvuldige behandeling van muizen tijdens de gedrags-paradigma; 2) Snelle en nauwkeurige dissectie van weefsel van belang; 3) RNA-veilige maatregelen om de integriteit van RNA waarborgen; en 4) zorgvuldige planning van primers en experimentele opmaak en precisie en aandacht voor detail voorbereiding van de qPCR analyse.

Het doel van de procedure is de dynamiek van transcriptionele gebeurtenissen geïnduceerd door gedrags ervaring karakteriseren; daarom aandacht is noodzakelijk opdat de gedragsmatige paradigma ervaren door de muis inderdaad is de ervaring die door de onderzoeker. Bijvoorbeeld, zelfs in zo'n eenvoudige paradigma als sensitisatie, de ervaring van de muis kan worden beïnvloed door vele verstorende factoren: de eerdere ervaring van de muis in het huis-kooi voorafgaand aan de experiment; de methode van de overdracht naar de laboratoriumruimte; het licht, geluid en geur blootstelling in de experimentele kamer; de ervaring van de behandeling door de experimentator; de pijn / ongemak veroorzaakt door het IP-injectie; blootstelling aan een nieuw experiment, en de resultaten daarvan na de gespecificeerde gedrag tot het punt van euthanasie. Elk van deze ervaringen kunnen afzonderlijk bevorderen inductie van transcriptionele's in verschillende hersengebieden van de muis. Daarom moet ervoor worden gezorgd dat het transcriptieprogramma meet de gewenste paradigma en niet bijverschijnselen geassocieerd met het paradigma. Voor cocaïne ervaring is dit gemakkelijk bereikt door zorgvuldig experimenteren en aandacht voor detail, evenals een eenvoudige controle-experiment, waarbij alle parameters constant worden gehouden, maar voertuig (zoutoplossing) wordt geïnjecteerd om de muis dan cocaïne. In onze ervaring, zoute injectie induceert een transcriptieprogramma van zeer beperkte omvang in vergelijking metblootstelling aan cocaïne, waaruit blijkt dat het paradigma overweldigend maakt onderzoek van de verschijnselen van belang.

Grootste zorg moeten worden genomen om het bereik van de ervaringen van de muis te beperken, terwijl het is nog steeds actief, noodzakelijk rustige en zorgvuldige behandeling van de muizen. Daarentegen na anesthesie, snelle en nauwkeurige activiteiten noodzakelijk vanwege de mogelijkheid om snelle veranderingen in de representatie van RNA (in de tijdschaal van minuten) en de intrinsieke labiliteit van RNA, die snel kunnen worden afgebroken wanneer de cellen worden verstoord, potentieel verstoren de transcriptionele profiel geïnduceerd door ervaring. Daarom is het belangrijk de hersenen snel verwijderen van de schedel een gekoelde omgeving (binnen 1-2 min) en snel ontleden NAc in ijskoude omstandigheden. Zodra de hersenen is gekoeld, worden de mogelijkheden voor transcriptionele veranderingen of RNA degradatie aanzienlijk verminderd, maar alleen wanneer de relevante paragrafen in Trizol reagens worden geplaatst en bevroren, is de integriteit van het weefsel en de representatie van het transcriptionele profiel gewaarborgd.

In dit verband is het de moeite waard te vermelden dat de transcriptie dynamiek van direct vroeg genexpressie optreedt op een snelle time-schaal, vaak met een piek voor 1 uur na stimulatie. In de context van de experimentele paradigma beschreven, wordt de ondervraging van transcriptionele dynamica beperkt tot de omvang uren teneinde variabiliteit tussen monsters te verminderen. Voor korter dan 1 uur, kunnen kleine variaties in de timing resulteren in grote variaties in de grootte van transcriptionele veranderingen waargenomen. Daarom is de 1 uur tijdstip is gekozen voor analyse, aangezien dit tijdstip is experimenteel makkelijker uit te voeren nauwkeurig en minder gevoelig voor variaties in het niveau van een paar minuten verschil in het experiment.

Traditioneel is een weefsel micropunch is gebruikt door vele laboratoria voor dissectie van weefselmonsters. Erzijn een aantal redenen om handmatig microdissection van het weefsel verkiezen. De stempel wordt gewoonlijk gemaakt van roestvrij staal en niet transparant. Daarom is het plaatsen van de stempel op een nauwkeurige en consistente locatie kan lastig zijn. Bovendien is de stempel niet toe dat een correctie worden gemaakt als er een fout in de oorspronkelijke positie. Ten slotte kan de winning van het weefsel van binnenuit de punch soms lastig te bewijzen, en er is kans op het verliezen van weefsel, of overdracht tussen de monsters. Microdissectie van het weefsel met een fijne scalpel kan de onderzoeker meer controle en verschaft zekerheid over de zuiverheid van de monsters.

Tijdens RNA-extractie en cDNA-synthese tot, heeft de werkomgeving van bronnen van verontreinigingen RNase vrij worden gehouden en werkzaamheden moeten worden uitgevoerd met RNase-free gereedschappen, disposables en reagentia. In dit stadium, de kleinste verontreiniging kan gemakkelijk beschadigd zuurverdiende RNA samples. Het houden van de monsters ice koud is cruciaal voor het minimaliseren van neurale activiteit die de transcriptionele uitlezing kan wijzigen, evenals enzymatische activiteit die kunnen beïnvloeden integriteit van het monster te minimaliseren. Aanvullende farmacologische remmers worden soms toegevoegd aan neurale prikkelbaarheid verminderen, maar vaak zijn niet essentieel.

Na reverse-transcriptie in cDNA, de nadruk gaat om het waarborgen van de geldigheid van de resultaten van de uitgebreide profilering van transcripties resultaten. De eerste stap is om ervoor te zorgen dat de juiste qPCR primers worden gebruikt, waarvoor het wordt ten zeerste aanbevolen om primer efficiëntie en specificiteit te testen op verdunningskrommes van een bepaalde bron van RNA. Optimale PCR primers geven specifieke en efficiënte amplificatie van het doelwit. Specifieke amplificatie impliceert dat amplificatie slechts van de doelsequentie, duidelijk als een afzonderlijke piek in smeltcurve analyse, terwijl efficiënte amplificatie impliceert dat in elke cyclus de hoeveelheid van de doelsequentiegedupliceerd, met een rendement benadert 100%. Vanwege de hoge-doorvoer aard van de microfluïdische chips qPCR deze experimenten vereisen zorgvuldige planning voor de opname van een groot aantal positieve en negatieve controles waarborgen. Het verdient de voorkeur om consistente controles in elke chip run, waardoor directe vergelijking van de resultaten van de controle en experimentele omstandigheden. Tijdens de installatie van het experiment, is het zeer belangrijk om over te steken-besmetten putten. Aangezien kleine hoeveelheid primers in het verkeerde goed de versterking van de ongewenste doelgroep zou kunnen veroorzaken, moet extra zorg worden genomen bij het pipetteren primers.

Voor de meeste weefselmonsters van de hersenen is het moeilijk zeker te zijn dat tijdens dissectie alleen het weefsel van belang werd geëxtraheerd, zonder verontreiniging van irrelevante hersengebieden, die de analyse van de resultaten kunnen verwarren. Hiertoe is een belangrijke controle peilen naar genen waarvan de expressie verwacht worden uitgeslotenhet weefsel van belang. Een handig hulpmiddel voor het identificeren van de ruimtelijke patronen van genexpressie is de Allen Brain Atlas ( http://www.brain-map.org/ ).

Terwijl een diepgaande bespreking van gegevensanalyse valt buiten het bestek van deze bekendmaking, wordt erop gewezen dat zorgvuldig experimenteren garandeert zorgvuldige analyse. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat een aantal relevante referentie-genen worden opgenomen in elke ronde van qPCR. Deze genen zullen dienen voor normalisatie om te voorkomen dat dergelijke hoeveelheden RNA worden getest. Normalization wordt eerst de referentie genen uitgevoerd binnen het monster, en vervolgens de verwijzing muizen voor het experiment ("tijdstip 0") met toepassing van de "ΔΔCt methode".

De in dit manuscript beschreven protocol is gericht op onderzoek naar de transcriptionele dynamiek volgende cocaïne ervaring in de nucleus accumbens van muizen. Het is echter heel gemakkelijk adapted voor de studie van andere ervaring van de muis, zolang adequate controles worden uitgevoerd, en de timing van de ervaring is goed gedefinieerd. Uiteraard kan dit protocol ook geïmplementeerd worden voor de studie van de dynamiek van transcriptie in weefsels buiten het zenuwstelsel ook.

Er zij op gewezen dat uitgebreide transcriptionele profilering middels microfluidic gebaseerde qPCR is een werkwijze voor het profileren transcriptionele gebeurtenissen kosteneffectief, maar afhankelijk van voorkennis van de doelgenen van belang. Deze worden gewoonlijk verkregen door onpartijdige profiling methoden, zoals microarrays en sequentie-analyse. Daarom is in de werkstroom van een groot project uitgebreid qPCR profilering het belangrijkste deel van de gegevens, maar bij voorkeur dient prioriteit onpartijdige karakterisering van het systeem te volgen.

Het is ook stellen dat de hierin beschreven voor het verkrijgen van weefselmonsters werkwijze kan ook worden uitgevoerd naar studieing een verscheidenheid van andere cellulaire gebeurtenissen - proteomics en eiwitmodificaties, metabolomics, lipidomics en epigenetische markeringen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Virusol	Oriek Medical	J29D
Isoflurane, USP 100%	MINRAD INC	NDC 60307-110-25
RNeasy plus Universal Mini Kit	QIAGEN	73404
QIAshredder	QIAGEN	79654
High Capacity cDNA Reverse Transcription kit	Invitrogen	AB-4368814
TE Buffer	Invitrogen	1355656
Behavior Chamber (MDF; 50 x 45 cm)			Self assembled
Inner Perspex box (30 x 30 cm)			Self assembled
Camera and video recorder	Campden Inst.	CMD-80051
Media Recorder software	Noldus	NDS-NMR3-00M
Iris Scissors	FST	FST-14062-09
Vibratome	Campden Inst.	7000SMZ-2
Bioanalyzer	Agilent Technologies	The Agilent 2100 Bioanalyzer
Thermal cycler	Bio-Rad	1852048
Inverted microspoon spatula	Bochem Instrument GmbH	3213
Biomark HD Reader	Fluidigm	BMHD-BMKHD
Dynamic array Chip for 96.96 gene expression	Fluidigm	BMK-M-96.96