Abstract
Trypanosoma brucei является kinetoplastid Паразит, вызывающий африканским трипаносомозом человека (HAT), или сонная болезнь, и изнуряющая болезнь, Нагана, у крупного рогатого скота 1. Паразит чередует кровоток хозяина млекопитающих и мухи вектора лету. Состав многих клеточных органелл изменяет в ответ на эти различные внеклеточных условиях 2-5.
Glycosomes являются узкоспециализированными пероксисомы, в котором многие из ферментов, участвующих в гликолиза являются разобщенным. Glycosome состав изменяется в развития и экологически регулируемым образом 4-11. В настоящее время наиболее общие методы, используемые для изучения glycosome динамику являются электрон и флуоресцентной микроскопии; методы, которые стоят дорого, времени и труда, а не легко адаптировать к высокой пропускной анализов.
Чтобы преодолеть эти ограничения, репортер систему люминесцентная-glycosome вкоторой повышена желтый флуоресцентный белок (EYFP) слита с последовательностью ориентации пероксисом (PTS2), который направляет слитый белок по glycosomes 12, было установлено. При импорте слитого белка PTS2eYFP, glycosomes стать люминесцентные. Деградации органелл и результаты переработки в потере флуоресценции, которые могут быть измерены с помощью проточной цитометрии. Большое количество клеток (5000 клеток / сек) могут быть проанализированы в реальном времени без обширного пробоподготовки, например, фиксации и монтажа. Этот метод предлагает быстрый способ обнаружения изменений в органелл состава в ответ на колебания условий окружающей среды.
Introduction
Trypanosoma brucei вызывает африканскую сонную болезнь у человека и изнуряющая болезнь, Нагана, у крупного рогатого скота. Препараты, применяемые при лечении этих заболеваний являются устарелыми и чрезвычайно токсичны, вакцины отсутствуют, и потенциал для развития лекарственной устойчивости к необходимости поиска новых лекарственных препаратов 1.
Во время его жизненного цикла, Т. brucei, чередует вектор насекомых и млекопитающему; два компьютера, которые представляют очень разные условия, в которых паразит должен выжить. Ряд метаболических и морфологических изменений произойти паразит подвергается различным условиям окружающей среды. Некоторые из самых драматических изменений наблюдаются в одной мембраной ограничена паразитов конкретных микротел, называется glycosomes 13.
Уровни глюкозы являются относительно высокими (~ 5 мм) в крови и кровотока паразиты (BSF) генерации АТФ исключительно через гликолиза WHИль митохондриальная метаболизм репрессированных 14. В отличие от других эукариот, в котором гликолиза происходит в цитоплазме, T. brucei compartmentalizes большинство ферментов гликолиза в glycosomes 14,15. Паразиты будут взяты мухой цеце во время bloodmeal и испытать падение глюкозы, которая падает до неопределяемых уровней в течение 15 мин, чтобы быть заглатывании лету. Метаболизм насекомых, проциклической форма (PCF), паразиты является более гибким и глюкозы, а также аминокислоты, такие как пролин, могут быть использованы в синтезе АТФ 16-18. Сравнительные протеомные исследования показывают жизненного цикла зависимые изменения в glycosomal и митохондриальные белки с гликолиза белков повышенные в кровоток паразитов и митохондриальные белки, участвующие в цикле ТСА и дыхательной цепи 13,19. Хотя многие исследования были сосредоточены на различиях между ЧФ и ФКП glycosomes, мало известно об изменениях в ФКП glycosomes, которые происходят в ответ на окрironmental изменения.
В кишке лету, уровень глюкозы низкий с временными увеличивается во время кормления 20. В большинстве в пробирке исследования, ПКФ паразиты выращивают в среде, содержащей глюкозу. Тем не менее, недавние исследования показали, что изменения ФКП метаболизм значительно в ответ на глюкозу доступность 17. В отсутствие глюкозы, поглощение пролина и пролина увеличение активности дегидрогеназы 18. Это изменение метаболизма митохондрий, вероятно, сопровождается изменением состава и морфологии glycosome, однако, это не было непосредственно оценивать.
Электрон и флуоресцентной микроскопии являются общие методы используются для изучения динамики glycosome в Т. brucei 2,21-24. Эти протоколы времени и труда, дорого, и трудно адаптироваться в режиме реального времени исследований и протоколов с высокой пропускной. Чтобы преодолеть это ограничение, репортер система люминесцентная-органеллы USED для изучения органелл в млекопитающих и дрожжей систем была изменена для использования в T. brucei 12.
Репортер системы Люминесцентная-органелл широко используются в высших эукариот, таких как дрожжи, растений и клеток млекопитающих 25-27. В таких системах, флуоресцентный белок слит с аминокислотной последовательностью, которая направлена белка в определенных органелл. Разложение или синтез целевых белков измеряется с помощью флуоресценции и изменения в составе органелл, отраженных от изменения флуоресценции клеток.
Когда открытая рамка считывания повышенной желтого флуоресцентного белка (EYFP) сливают с Тип II пероксисомальной последовательности целевых ориентиров (PtS2) 12, белок PTS2eYFP импортируется в зрелых, импортных-компетентный glycosomes и флуоресценции можно контролировать с помощью проточной цитометрии. Вариации в glycosome композиции, отраженных от изменений в клеточной флуоресценции. Эта система может помочь в резолВинг механизмы, которые регулируют экологически индуцированных изменений в glycosome состава.
Эта рукопись описывает генерацию системы glycosome репортера в ФКП паразитов в сочетании с проточной цитометрии для мониторинга динамики glycosome в режиме реального времени в живых паразитов и приводит пример, как он был использован, чтобы следить за изменениями в glycosome состава в ответ на различных средах. Таким образом, glycosome состав зависит от внеклеточных концентраций глюкозы и прохождения лог-фазовых культур в свежую среду вызывает изменения во glycosome состава. Эта система может быть изменен, чтобы изучить динамическое поведение других органеллах в трипаносом и других паразитов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Общие трипаносом Husbandry
- Взвесьте твердые для SDM79 подготовки медиа (Таблица 1).
- Хранить при 4 ° С в 50 мл коническую или Ziploc мешок. ПРИМЕЧАНИЕ: Реагенты стабильны в течение не менее 6 месяцев.
- Оттепели фетальной бычьей сыворотки (FBS), в 37 ° C водяной бане, и перемешивают периодически инверсии. Примечание: ФБС получен от поставщика в виде стерильного раствора. Фильтр стерилизации FBS снижает его способность поддерживать рост паразита.
- После того, как весь бутылки оттаивают, тепло инактивированную сыворотку в течение 30 мин в 56 ° C водяной бане, смешивание периодически, чтобы свести к минимуму осаждение компонентов сыворотки.
- Оттепели раствор пенициллина / стрептомицина (ручка / стрептококк), гемин (2 мг / мл в 50 мМ NaOH), и основная среда Eagle витамина раствору при комнатной температуре.
- К 1000 мл мерный цилиндр, добавить 20,2 г SDM79 твердых веществ (Таблица 1) жидких компонентов (таблица 2) и хорошо перемешать на мешалке.
- Отрегулируйте рН до 7,35, и принести объем до 850 мл водой.
- Фильтр стерилизации носитель путем присоединения вакуумный шланг к нижней части бутылки фильтра. Применение вакуума до тех пор, пока раствор не фильтруется.
- Удалить фильтра верх в кабинете биологической безопасности и добавить 150 мл тепла инактивированной FBS. Удалить пластиковую крышку от стерильной крышкой и уплотнение СМИ бутылки.
- Подготовьте SDM80 СМИ таким же образом, как SDM79 со следующими исключениями; не добавить глюкозу или глюкозамин и использовать MEM без глутамина. В месте 150 мл инактивированной нагреванием FBS, добавьте 135 мл диализовали, инактивированной нагреванием FBS, и 15 мл инактивированной нагреванием FBS.
- Культура ПКФ паразиты в 25 см 2 колбы с 10 мл соответствующей среды на 27 ° С и 5% СО 2. ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки должны учитываться в день с помощью гемоцитометра или проточного цитометра (см раздел 6) и культуры должны быть сохранены при плотностях между 1 х 10 5 и 5 х 10 6 клеток / мл.
2 Трansfection из ФКП Паразиты с люминесцентной Reporter Construct
ПРИМЕЧАНИЕ: Для выполнения glycosome динамику, репортер белок, содержащий пероксисомальной последовательность прицеливания (PtS2) альдолазы, слитого с повышенной желтого флуоресцентного белка выражается в паразитов. Последовательность, кодирующая слитый белок, клонируют в pXS2bla 12, который содержит промотор procyclin и тубулина межгенные области, которые направляют гомологичной рекомбинации в геном и ген устойчивости к бластицидин для выбора. Проциклической клеточные линии, несущие гены, кодирующие Т7-полимеразы и тетрациклинового репрессорного (PF29-13) трансформируют прицеливания конструкции, pXS2: PTS2eYFP.
- Подготовьте cytomix путем смешивания компонентов, перечисленных в таблице 3. Фильтр стерилизуют и хранят при комнатной температуре.
- Линеаризации плазмиды ДНК с помощью пипетки MluI 10 мкл ДНК (1 мкг / мкл), 5 мкл ограничительного фермента буфера, 33 мкл воды и 2 μ; Л MluI фермента в микроцентрифужную пробирку. Инкубируют при 37 ° С в течение 1 часа.
- Очищают ограничение переварить, добавив 1 объем связывания буфер для рестриктазой дайджеста. Смешайте буфера для связывания и переваренной ДНК встряхиванием. Кратко центрифуги для сбора образца в нижней части трубки.
- Вставьте ДНК привязку столбца в 2 мл пробирку, и передача переваривается ДНК / связывания буферный раствор к колонке.
- Центрифуга для 10000 мкг в течение 1 мин. После центрифугирования, отбросить фильтрат из пробирки и вернуть колонку в пробирку.
- Добавить 700 мкл SPW буфера и центрифуге при 10000 мкг в течение 1 мин.
- Отменить фильтрат из пробирки, вернуть колонку в пробирку и повторить SPW шаг стирки и центрифугирования.
- Откажитесь фильтрата, вернитесь столбце, чтобы пробирку и центрифуги пустой столбец в течение 3 мин при 10000 х г для удаления остаточного этанола.
- В биобезопасности кабинета, выбросить цвлекция трубки и место колонка в стерильной трубки микроцентрифужных.
- Для элюции ДНК, добавить 25 мкл стерильной воды в колонну и инкубируют при комнатной температуре в течение 2 мин. Центрифуга при 10000 мкг в течение 1 мин.
- Добавить еще 25 мкл стерильной воды в биобезопасности капотом к колонке и инкубировать при комнатной температуре в течение 2 мин.
- Центрифуга при 10000 скорости XG в течение 1 мин.
- В кабинете биобезопасности передать весь объем ДНК в новую стерильную пробирку микроцентрифуги. ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг предотвращает загрязнение от открытой крышкой во время центрифугирования.
- Добавить стерильной, очищают, линеаризованной ДНК (10 мкг) в 400 мкл стерилизованным фильтрацией cytomix.
- Граф клеток, как описано в разделе 6 и урожай 5 x10 7 -10 8 клеток путем центрифугирования при 800 мкг в течение 15 минут при комнатной температуре.
- Слейте супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 450 мкл ДНК + cytomix использованием 1 мл серологические пипетки.
- Передача раствор, содержащий се заполняет, ДНК, и cytomix в стерильную 4 мм зазор кюветы и кюветы место в камере электропорации.
- Выберите "экспоненциальный спад" и вручную ввести следующие параметры: Напряжение: 1,5 кВ, Емкость: 25 MF, сопротивление: Ω и кювет: 4 мм. Пресс импульса. После того, как пульс полный, удалить кювету с электропорации камеры и вернуться к биобезопасности кабинета.
- В новый стерильную колбу, пипетки 10 мл SDM79. Передача трансформированных клеток в колбу с 10 мл SDM79.
- Выдержите БЕЗ выбора препарата в течение 24 ч при 27 ° С, 5% СО 2. Через 24 ч добавляют G418 (15 мкг / мл), гигромицин (50 мкг / мл), и бластицидин (10 мкг / мл). Pass 1 мл трансформированных клеток с препаратом в 9 мл SDM79 с препарата.
- Анализ клеток ежедневно, как описано в разделах 6 и 7, когда клетки флуоресцентной, и достигли плотности клеток 1 х 10 7 / мл, сделать stabilates для долговременного хранения (3.1-3.3).
- Для того, чтобы замораживания средств массовой информации, добавляют равный объем 100% глицерина, чтобы cytomix и фильтра стерилизации.
- Добавить 200 мкл морозильной СМИ 800 мкл клеток (1 х 10 7) в криопробирку, аккуратно перемешать переворачиванием и место между двумя пенопластовые стойки и заморозить при температуре -80 ° C.
- После того, как замороженные (~ 24 ч), Передача клетки жидкого азота. Примечание: Важно, чтобы переместить клетки в LN 2 после 24 часов, а более длительного хранения при -80 ° С приводит к снижению жизнеспособности клеток.
4. Размораживание замороженных запасов
- Удалить замороженный флакон от -80 ° С до оттепели при комнатной температуре в течение примерно 10 мин.
- Внесите 9 мл SDM79 с препарата в новую стерильную колбу. Добавить оттаивали клетки в этой колбе. Pass клеткам 1:10 добавлением 1 мл этой культуры в 9 мл SDM79 в новую колбу (конечной концентрации 1 × 10 5 / мл).
- До того, как клетки достигают плотность 10 7 / мл, начинают цитометра установлени разведение анализы.
5 Цитометр Setup
- Включите проточной цитометрии и открыть программу Cflow Plus. ПРИМЕЧАНИЕ: Перед тем как запустить образцы, ГИДРОСИСТЕМЫ следует самоочистку обратным потоком и промыть в соответствии с шагами 5.2-5.7.
- Заменить трубку NanoPure воды, в которой хранится SIP с пустой трубы.
- Выберите кнопку «обратной промывки".
- После обратной промывки удалим микроцентрифужную пробирку с глотка и выбросьте.
- Установите новую микроцентрифужную пробирку, содержащую 1 мл новой NanoPure воды на глоток.
- Выберите новую скважину в программе Cflow. Под «Пределы Run" установить время в течение 2 мин. Под "ГИДРОСИСТЕМЫ" выберите "быстро" и "Run".
- После того, как срок 2 мин будет завершена, нажмите кнопку "Delete Sample Data".
6 подсчета клеток с помощью цитометра
- Замените воду с образцом для подсчета. Установите "Запуск Limits "до 30 сек," Fluidics "в" скорую ", а затем выберите" Выполнить ".
- По истечении срока, 30 сек завершена, Cflow плюс обеспечит события / мкл под "Last Run". Повторите счета для каждой культуры. ПРИМЕЧАНИЕ: Перед клетки достигают 1 х 10 7 клеток / мл, продолжить разбавления анализа. Клетки должны быть прекращены после одного разведения анализ завершен. Клетки, культивированные в течение более длительных периодов теряют способность реагировать на условия окружающей среды.
7 измерения флуоресценции с помощью цитометра
- Для оценки флуоресценции, установить «Выполнение Limits" в 10000 событий, и "FLUIDICS" в "медленные". Выберите "Установить порог". "Первичного Порога", выберите "Постоянно устранить события на", "FSC-H" (в меню), и введите менее 30000. Нажмите "Применить", затем "закрыть".
- Выберите220; "кнопку в одном из новых сюжетных окон и выберите" Гистограмма FSC-A "из выпадающего списка выберите" FL1-A ". ПРИМЕЧАНИЕ: меры FL1-A флуоресценции в волны 530 нм.
- Выберите "Выполнить" и повторите для всех культур.
- Запуск моющего раствора через линию гидросистемы в течение 2 мин и воды в течение 2 мин.
8. разбавления Анализы
- Pass клеток до плотности 1 × 10 5 клеток / мл в 3 мл SDM79 в 25 см 2 культуральной колбы и измерить цветение сразу же после прохода и затем в 3 часа и 24 часов.
Анализ 9. данных
- Выберите "Анализ" вкладку на Cflow Plus.
- Нажмите появится кнопка "Гистограмма" в разделе "Создайте новый сюжет." Select "FSC-A" и выпадающего списка. Выберите канал "FL1-."
- Выделите хорошо проанализировать. Выберите кнопку "Выход", и вручную нарисовать воротадля населения интерес.
- Flow Plus обеспечит клеток "Count" в пределах этих ворот и "% этого участка".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этой системе, наблюдалось изменение уровня глюкозы в зависимости от glycosome в композиции. Когда клетки выращивают в глюкозы, содержащего СМИ, наблюдаются две популяции; одна яркая и одна тусклый (2А). Dim клетки укрывает незрелые glycosomes, которые не импортировали PTS2eYFP а яркие клетки укрывает смесь зрелых и незрелых glycosomes 12. Когда глюкоза присутствует в средствах массовой информации, неправильной локализации glycosome белков смертельна 15,28 и выражение glycosome белок, скорее всего, в сочетании тесно с импортом. Это жесткий регулирование отвечает за появление тусклых клеток, в которых экспрессия glycosome белок подавленной, когда клетки не обладают достаточной возможность импорта. После того, как импорт glycosome техника полностью собран и функциональный, клетки выразить glycosome белки, которые затем импортируются в glycosomes, уступая флуоресцентные клетки. В глюкозы-разрушающим СМИ, неправильной локализации glycosome белков терпетьD 15, и бимодальное распределение населения заменены одним пиком с более широкий спектр флуоресценции (фиг.2В).
Эта система была использована для определения условий, которые вызывают изменения в glycosome состава. При культуры высокие плотности, содержащие ~ 10% тусклые клеток (рисунок 3А) передаются в свежей среде, есть преходящее повышение в процентах от тусклых клеток (Рисунок 3В). По 24 часов. Оригинальный распределение населения восстанавливается (3С).
| SDM79 Твердые | Вес (г / л) |
| Грации порошок клеток насекомых СМИ | 2 |
| Глюкоза | 1 |
| HEPES | 8 |
| МОПС | 5 |
| NaHCO 3 | 2 |
| Пирувата натрия | 0.1 |
| L-аланин | 0.2 |
| L-аргинин | 0.1 |
| L-глютамин | 0.3 |
| L-Methonine | 0.07 |
| L-Фенилаланин | 0.08 |
| L-пролин | 0.6 |
| L-серин | 0.06 |
| L-таурин | 0.16 |
| L-треонин | 0.35 |
| L-тирозин | 0.1 |
| Аденозин | 0.01 |
| Гуанозин | 0.01 |
| Глюкозамин HCl | 0.05 |
| Фолиевая кислота | 0.004 |
| г-аминобензойной кислоты | 0.002 |
| Биотин 0.0002 |
Таблица 1 SDM79 твердые компоненты. Твердые компоненты среды и количество (г / л) предусмотрены.
| SDM79 | |
| MEM с глутамина | 600 мл |
| Pen / Strep | 10 мл |
| BME раствор витаминов | 10 мл |
| MEM аминокислоты решение | 8 мл |
| MEM, не важно аминокислотный раствор | 6 мл |
| Хемин | 3,75 |
| Вода | 162,25 мл |
Таблица 2 SDM79 жидкие компоненты. Объемы мл даны.
| Для 20 мл | |
| 120 мМ КСl | 1,4 мл (1 М) |
| 0,15 мМ CaCl 2 | 3 мл (1 М) |
| 10 мМ K 2 HPO 4 | 400 мл (0,5 М) |
| 25 мМ HEPES | 500 мл (1 М) |
| 2 мМ ЭДТА | 80 мл (0,5 М) |
| 5 мМ MgCl2 | 100 мл (1 М) |
| Вода | 16.52 |
Таблица 3 Cytomix рецепт.
Рисунок 1. Люминесцентная систему glycosome репортер. А) интеграция выражение PTS2eYFP конструкция. ПКФ трипаносомы трансформировали рХS2PTS2eYFP плазмиды линеаризованы рестриктазой MluI. Эта конструкция объединяет посредством гомологичной рекомбинации в тубулина локуса (ванна) и PARP последовательностей (ППА) включает промотор, который управляет конститутивной экспрессии PTS2eYFP и последовательности, необходимые для РНК обработки. B) импорт PTS2eYFP. PTS2eYFP синтезируется в цитоплазме, где он связывается с растворимого рецептора, PEX7, который обеспечивает репортерный белок к glycosomes. После доставки в glycosome мембраны белок импортируется. Зрелые органеллы, содержащие импорт машин PTS2eYFP импорта и флуоресценции, а те, которые не содержат функциональную импортных машин остаются туманными.
Фигура 2 Глюкоза в зависимости от композиции. Glycosome PCF клетки выращивали в SDM79 (+ КЗС) или SDM80 (-Glc) ианализировали с помощью проточной цитометрии. Гистограммы 10000 событий.) Анализ клеток, выращенных в SDM79 последовательно показывает два пика. Флуоресцентные клетки укрывает смесь зрелых и незрелых органелл с клеток высших интенсивности флуоресценции, имеющих более зрелые glycosomes. В SDM79, неправильной локализации glycosome белков смертельна и glycosome выражение и импорт белок должен быть под жестким контролем. Это отражено в отсутствие клеток с промежуточными интенсивности флуоресценции. Б) в SDM80, неправильной локализации glycosome белков терпимо, бимодальное распределение населения теряется, и наблюдаются клетки промежуточного флуоресценции.
Рисунок 3 Glycosome ремоделирования. Ремоделирование glycosomes инициируется переходом в свежей прессы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Glycosomes являются важными, динамические, паразит-специфический органеллы. Процессы, которые регулируют биогенеза, техническое обслуживание, пролиферацию и ремоделирование этих органелл, вероятно, включать лекарственных целей, которые могли бы быть использованы в терапевтических целях. Несмотря на потенциально высоким обилием таких лекарственных препаратов, поле glycosome биогенеза отстала от изучения аналогичных процессов в других организмов, преимущественно в связи с отсутствием послушный, высокой пропускной системы с помощью которого можно контролировать быстрые, динамичные, органелл ответов в живых клетках.
Флуоресцентные-репортер органелл системы были использованы для изучения динамики органелл у высших эукариот, таких как дрожжей, растений, грибов и млекопитающих 23-25. Мы породили трансгенного штамма ФКП паразитов, которые выражают PTS2eYFP который целевых созревать glycosomes, уступая флуоресцентные органеллы. Изменения в glycosome состава можно контролировать с помощью следующей сотовой флуоресценции. Используя эту систему, мы обнаружили, что условия окружающей среды, в частности, глюкозы, регулирует glycosome состав 12.
В отличие от микроскопии методы часто используются для изучения динамики органелл в kinetoplastid паразитов, этот репортер система предлагает метод, с помощью которого быстро экранировать соединений и условий, которые влияют на общую динамику glycosome. Тем не менее, изменения флуоресценции отражает изменения в общей композиции органелл. Дальнейшие биохимические и микроскопические эксперименты должны определить конкретные молекулярные различия между популяциями клеток, проявляющих различную интенсивность флуоресценции.
Мы определили ряд важнейших шагов в ремоделирования анализов. Интересно, что мы обнаружили, что, как клетки культивируют в течение более длительных периодов (более двух проходов), их поведение в ответ на изменения окружающей среды непредсказуемо. После длительного культивирования клетки передается от высоких плотностях в свежем мEdia, проявляют временное увеличение тусклом населения, указывая, что они все еще в состоянии реконструировать glycosomes, но умирают после 24 часов. Мы также столкнулись с ситуациями, когда не наблюдается ремоделирование. Причина этого не ясна поведения, но мы обнаружили, что, когда клетки обрабатываются так, как описано здесь (ограничение количества клеток до двух пассажей и поддержания культур ниже 1 × 10 7 / мл), glycosome ремоделирование воспроизводима. Когда клетки больше не реагировать на условия окружающей среды, ретрансформации клетки с репортером-конструирования плазмиды обычно средства эта ситуация.
Хотя эта система была использована для изучения glycosome поведение в африканских трипаносом, он также может быть принята для изучения органелл в других паразитов путем слияния флуоресцентные белки аминокислотных последовательностей белков, что прямая локализации других клеточных компартментах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine | Avocado Research Chemicals Ltd | A10781 | SDM79 Ingredient |
| L-Alanine | Avocado Research Chemicals Ltd | A15804 | SDM79 Ingredient |
| L-Arginine | CalBiochem | 1820 | SDM79 Ingredient |
| p-Aminobenzoic acid | ICN Biomedicals | 102569 | SDM79 Ingredient |
| Basal Medium Eagle Vitamin Solution (100x) | Sigma | B6891 | SDM79 Ingredient |
| Biotin | Fisher | BP232-1 | SDM79 Ingredient |
| Calcium chloride | VWR | BDH0224 | Cytomix |
| EDTA | Fisher | S311-100 | Cytomix ingredient |
| EZNA Gel Extraction kit | Omega Biotek | D2500-01 | DNA purifiation |
| Research grade Serum | Fisher | 03-600-511 | SDM79 Ingredient |
| Folic acid | ICN Biomedicals | 101725 | SDM79 Ingredient |
| Glucosamine HCl | ICN Biomedicals | 194671 | SDM79 Ingredient |
| Glucose | GIBCO | 15023-021 | SDM79 Ingredient |
| L-Glutamine | CalBiochem | 3520 | SDM79 Ingredient |
| Glycerol | Acros Organics | Ac15892-0010 | Freezing media |
| Graces insect cell media powder | GIBCO | 11300-043 | SDM79 Ingredient |
| Hemin | MP Biomedicals | 194025 | SDM79 Ingredient |
| Guanosine | Avocado Research Chemicals Ltd | A11328 | SDM79 Ingredient |
| HEPES | MP Biomedicals | 194025 | SDM79 Ingredient |
| Magnesium chloride | Fisher | BP214-500 | Cytomix ingredient |
| L-Methionine | Fisher | BP388-100 | SDM79 Ingredient |
| MEM Amino Acids (50x) | Cellgro | 25-030-CI | SDM79 Ingredient |
| NEAA Mixture (100x) | Lonza | 13-114E | SDM79 Ingredient |
| Minimal Essential Medium (1x) with L-glutamine | Cellgro | 10-010-CM | SDM79 Ingredient |
| MOPS | Fisher | BP308-500 | SDM79 Ingredient |
| Sodium biocarbonate | Fisher | S233-500 | SDM79 Ingredient |
| Penicillin-streptomycin Solution | Cellgro | 30-002-CI | SDM79 Ingredient |
| L-Phenylalanine | ICN Biomedicals | 102623 | SDM79 Ingredient |
| Potassium chloride | Fisher | P217-500 | Cytomix ingredient |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous | Fisheer | P290-212 | Cytomix ingredient |
| L-Proline | Fisher | BP392-100 | SDM79 Ingredient |
| L-Serine | Acros Organics | 56-45-1 | SDM79 Ingredient |
| Pyruvic acid, sodium salt | Acros Organics | 113-24-6 | SDM79 Ingredient |
| L-Taurine | TCI America | A0295 | SDM79 Ingredient |
| L-Threonine | Acros Organics | 72-19-5 | SDM79 Ingredient |
| L-Tyrosine | ICN Biomedicals | 103183 | SDM79 Ingredient |
| E.Z.N.A. Cycle Pure kit | Omega Biotek | D6492-02 | DNA purification |
| Binding buffer | Omega Biotek | PDR041 | DNA purification |
| SPW wash buffer | Omega Biotek | PDR045 | DNA purification |
| Gene Pulser Xcell | Biorad | 165-2660 | Trypanosome transformation |
| 4 mm Electroporation cuvettes | VWR | Trypanosome transformation |
References
- Stuart, K., et al. Kinetoplastids: related protozoan pathogens, different diseases. J Clin Invest. 118, 1301-1310 (2008).
- Herman, M., Perez-Morga, D., Schtickzelle, N., Michels, P. A. Turnover of glycosomes during life-cycle differentiation of Trypanosoma brucei. Autophagy. 4, 294-308 (2008).
- Herman, M., Gillies, S., Michels, P. A., Rigden, D. J. Autophagy and related processes in trypanosomatids: insights from genomic and bioinformatic analyses. Autophagy. 2, 107-118 (2006).
- Michels, P. A., Bringaud, F., Herman, M., Hannaert, V.
- Michels, P. A., et al. Peroxisomes, glyoxysomes and glycosomes (review). Mol Membr Biol. 22, 133-145 (2005).
- Moyersoen, J., Choe, J., Fan, E., Hol, W. G., Michels, P. A. Biogenesis of peroxisomes and glycosomes: trypanosomatid glycosome assembly is a promising new drug target. FEMS Microbiol Rev. 28, 603-643 (2004).
- Parsons, M., Furuya, T., Pal, S., Kessler, P. Biogenesis and function of peroxisomes and glycosomes. Molecular and biochemical parasitology. 115, 19-28 (2001).
- Parsons, M. Glycosomes: parasites and the divergence of peroxisomal purpose. Mol Microbiol. 53, 717-724 (2004).
- Michels, P. A., Hannaert, V., Bringaud, F. Metabolic aspects of glycosomes in trypanosomatidae - new data and views. Parasitol Today. 16, 482-489 (2000).
- Michels, P. A., Hannaert, V.
- Hannaert, V., Michels, P. A. Structure function, and biogenesis of glycosomes in kinetoplastida. J Bioenerg Biomembr. 26, 205-212 (1994).
- Bauer, S., Morris, J. C., Morris, M. T. Environmentally regulated glycosome protein composition in the african trypanosome. Eukaryot Cell. 12, 1072-1079 (2013).
- Colasante, C., Ellis, M., Ruppert, T., Voncken, F. Comparative proteomics of glycosomes from bloodstream form and procyclic culture form Trypanosoma brucei brucei. Proteomics. 6, 3275-3293 (2006).
- Opperdoes, F. R.
- Kessler, P. S., Parsons, M. Probing the role of compartmentation of glycolysis in procyclic form Trypanosoma brucei: RNA interference studies of PEX14, hexokinase, and phosphofructokinase. The Journal of biological chemistry. 280, 9030-9036 (2005).
- Bringaud, F., Riviere, L., Coustou, V. Energy metabolism of trypanosomatids: adaptation to available carbon sources. Molecular and biochemical parasitology. 149, 1-9 (2006).
- Coustou, V., et al. Glucose-induced remodeling of intermediary and energy metabolism in procyclic Trypanosoma brucei. The Journal of biological chemistry. 283, 16342-16354 (2008).
- Lamour, N., et al. Proline metabolism in procyclic Trypanosoma brucei is down-regulated in the presence of glucose. The Journal of biological chemistry. 280, 11902-11910 (2005).
- Vertommen, D., et al. Differential expression of glycosomal and mitochondrial proteins in the two major life-cycle stages of Trypanosoma brucei. Molecular and biochemical parasitology. 158, 189-201 (2008).
- Vickerman, K. Developmental cycles and biology of pathogenic trypanosomes. British medical bulletin. 41, 105-114 (1985).
- Lorenz, P., Maier, A. G., Baumgart, E., Erdmann, R., Clayton, C. Elongation and clustering of glycosomes in Trypanosoma brucei overexpressing the glycosomal Pex11p. The EMBO journal. 17, 3542-3555 (1998).
- Saveria, T., et al. Conservation of PEX19-binding motifs required for protein targeting to mammalian peroxisomal and trypanosome glycosomal membranes. Eukaryot Cell. 6, 1439-1449 (2007).
- Banerjee, S. K., Kessler, P. S., Saveria, T., Parsons, M. Identification of trypanosomatid PEX19: functional characterization reveals impact on cell growth and glycosome size and number. Molecular and biochemical parasitology. 142, 47-55 (2005).
- Milagros Camara Mde, L., Bouvier, L. A., Miranda, M. R., Pereira, C. A. Identification and validation of Trypanosoma cruzi's glycosomal adenylate kinase containing a peroxisomal targeting signal. Experimental parasitology. 130, 408-411 (2012).
- Wiemer, E. A., Wenzel, T., Deerinck, T. J., Ellisman, M. H., Subramani, S. Visualization of the peroxisomal compartment in living mammalian cells: dynamic behavior and association with microtubules. The Journal of cell biology. 136, 71-80 (1997).
- Kim, P. K., Mullen, R. T., Schumann, U., Lippincott-Schwartz, J. The origin and maintenance of mammalian peroxisomes involves a de novo PEX16-dependent pathway from the ER. The Journal of cell biology. 173, 521-532 (2006).
- Hoepfner, D., Schildknegt, D., Braakman, I., Philippsen, P., Tabak, H. F. Contribution of the endoplasmic reticulum to peroxisome formation. Cell. 122, 85-95 (2005).
- Furuya, T., et al. Glucose is toxic to glycosome-deficient trypanosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14177-14182 (2002).
