Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

باستخدام البروتينات الفلورية لرصد ديناميات Glycosome في المثقبيات الأفريقي

doi: 10.3791/51647 Published: August 19, 2014

Abstract

المثقبية البروسية هو طفيلي kinetoplastid الذي يسبب داء المثقبيات الأفريقي البشري (HAT)، أو مرض النوم، ومرض الهزال، ناغانا، في الماشية 1. المناوبين الطفيلي بين مجرى الدم من المضيف الثدييات وذبابة التسي تسي ناقلات. تكوين العديد من العضيات الخلوية يتغير استجابة لهذه الظروف خارج الخلية مختلفة 2-5.

Glycosomes هي peroxisomes درجة عالية من التخصص فيها العديد من الأنزيمات المشاركة في تحلل هي مجزأة. تغييرات تكوين Glycosome بطريقة التنموية وتنظيما للبيئة 4-11. حاليا، والتقنيات الأكثر شيوعا لدراسة ديناميات glycosome هي الإلكترون ومضان المجهري. التقنيات التي هي باهظة الثمن والوقت وكثيفة العمالة، وعدم تكييفها بسهولة لتحليل إنتاجية عالية.

للتغلب على هذه القيود، نظام مراسل الفلورسنت glycosome فيمما عزز الأصفر بروتين فلوري (EYFP) وتنصهر إلى تاكسدي استهداف تسلسل (PTS2)، التي توجه إلى انصهار بروتين glycosomes 12، أنشئت. عند الاستيراد من البروتين الانصهار PTS2eYFP، glycosomes تصبح الفلورسنت. تدهور عضية ونتائج إعادة التدوير في فقدان مضان التي يمكن قياسها عن طريق التدفق الخلوي. يمكن تحليل أعداد كبيرة من الخلايا (5،000 خلية / ثانية) في الوقت الحقيقي دون إعداد عينة واسعة مثل التثبيت والتركيب. تقدم هذه الطريقة وسيلة سريعة للكشف عن تغيرات في تكوين عضية استجابة لتغير الظروف البيئية.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

المثقبية البروسية يسبب مرض النوم الأفريقي في البشر ومرض الهزال، ناغانا، في الماشية. الأدوية المستخدمة في علاج هذه الأمراض العتيقة وسامة للغاية، واللقاحات غير متوفرة، وإمكانية تطوير مقاومة المخدرات تستلزم البحث عن أهداف جديدة المخدرات 1.

خلال دورة حياتها، T. البروسية، المناوبين بين ناقلات الامراض والحشرات والثدييات المضيفة. مضيفين أن تقديم بيئات مختلفة جدا التي الطفيلي يجب البقاء على قيد الحياة. يحدث عدد من التغيرات الأيضية والمورفولوجية كما يتعرض الطفيلي للظروف البيئية المختلفة. ويلاحظ بعض التغييرات الأكثر دراماتيكية في microbodies محددة الطفيلي يحدها غشاء واحد، يسمى glycosomes 13.

مستويات الجلوكوز مرتفعة نسبيا (~ 5 ملم) في مجرى الدم والطفيليات مجرى الدم (البنك السعودي الفرنسي) حصريا من خلال توليد ATP WH تحللوقمع الأيض الميتوكوندريا إيل 14. خلافا لحقيقيات النوى الأخرى التي يحدث تحلل في السيتوبلازم، T. البروسية compartmentalizes معظم الإنزيمات حال السكر في glycosomes 14،15. تؤخذ الطفيليات من قبل ذبابة التسي تسي خلال bloodmeal وتشهد انخفاض الجلوكوز، والذي يقع إلى مستويات غير قابلة للكشف خلال 15 دقيقة من بلعها بواسطة الطاير. عملية التمثيل الغذائي للحشرة، شكل procyclic (PCF)، والطفيليات هي أكثر مرونة والجلوكوز، وكذلك الأحماض الأمينية مثل البرولين، ويمكن استخدامها في تركيب ATP 16-18. دراسات البروتين المقارنة تكشف التغيرات في دورة حياة تعتمد glycosomal وبروتينات الميتوكوندريا مع البروتينات حال السكر زيادة في مجرى الدم والطفيليات بروتينات الميتوكوندريا المشاركة في دورة TCA والسلسلة التنفسية 13،19. في حين ركزت العديد من الدراسات على الاختلافات بين البنك السعودي الفرنسي وglycosomes PCF، لا يعرف إلا القليل عن التغيرات في glycosomes PCF التي تحدث ردا على الحياة الفطريةالتغييرات ironmental.

في المعى المؤخر من ذبابة، ومستويات الجلوكوز منخفضة مع الزيادات العابرة خلال التغذية 20. في معظم الدراسات في المختبر، وتزرع الطفيليات PCF في وسائل الإعلام التي تحتوي على الجلوكوز. ومع ذلك، فقد أظهرت الدراسات الحديثة أن التغييرات الأيض PCF بشكل كبير ردا على الجلوكوز توفر 17. في غياب الجلوكوز، وامتصاص البرولين والبرولين زيادة النشاط نازعة 18. هذا التغيير في استقلاب الميتوكوندريا المرجح يرافقه تغيير في تكوين glycosome والتشكل، ومع ذلك، لم يتم تقييم هذا مباشرة.

والإلكترون المجهري مضان والتقنيات الشائعة المستخدمة لدراسة ديناميات glycosome في T. 2،21-24 البروسية. هذه البروتوكولات هي الوقت والعمل المكثف، ومكلفة، وصعبة للتكيف مع الدراسات في الوقت الحقيقي والبروتوكولات إنتاجية عالية. للتغلب على هذا القيد، وهو نظام مراسل فلوري عضية-Uااا لدراسة العضيات في أنظمة الثدييات والخميرة تم تعديله للاستخدام في T. 12 البروسية.

وقد نظم مراسل الفلورسنت عضية تستخدم على نطاق واسع في حقيقيات النوى أعلى مثل الخميرة، والنبات، وخلايا الثدييات 25-27. في هذه النظم، وتنصهر بروتين فلوري إلى تسلسل الأحماض الأمينية التي يستهدف البروتين لعضيات محددة. يتم قياس تدهور أو تخليق البروتينات المستهدفة عبر مضان وتنعكس التغييرات في تكوين عضية بالتغيرات في مضان الخلية.

عندما تنصهر في إطار القراءة المفتوح المعززة بروتين فلوري الأصفر (EYFP) إلى النوع الثاني peroxisomal تسلسل استهداف (PTS2) 12، يتم استيراد البروتين PTS2eYFP إلى ناضجة، glycosomes استيراد المختصة ومضان يمكن رصدها عبر التدفق الخلوي. وتنعكس التغيرات في تكوين glycosome بالتغيرات في مضان الخلوية. هذا النظام يمكن أن تساعد في RESOLفينج الآليات التي تنظم التغييرات الناجمة بيئيا في glycosome التكوين.

تصف هذه المخطوطة توليد نظام مراسل glycosome في الطفيليات PCF بالتزامن مع التدفق الخلوي لمراقبة ديناميات glycosome الوقت الحقيقي في الطفيليات الحية وتقدم مثالا للكيفية التي تم استخدامها لمتابعة التغيرات في تكوين glycosome ردا على بيئات مختلفة. وباختصار، يتأثر glycosome التكوين حسب تركيزات الجلوكوز خارج الخلية ومرور ثقافات المرحلة السجل إلى وسائل الإعلام العذبة يؤدي تغيرات في تكوين glycosome. يمكن تعديل هذا النظام لدراسة السلوك الديناميكي من العضيات الأخرى في المثقبيات والطفيليات الأخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. عامة المثقبيات تربية

  1. وزن المواد الصلبة لإعداد وسائل الاعلام SDM79 (الجدول 1).
  2. تخزينها في 4 درجة مئوية في 50 مل المخروطية أو كيس زيبلوك. ملاحظة: الكواشف مستقرة لمدة 6 أشهر على الأقل.
  3. ذوبان الجليد مصل الجنين البقري (FBS) في 37 ° C بالحمام المائي، وتخلط بشكل دوري بواسطة انقلاب. ملاحظة: يتم تلقى FBS من الشركة باعتبارها محلول معقم. فلتر تعقيم FBS يقلل من قدرتها على دعم نمو الطفيل.
  4. بمجرد إذابة الزجاجة بأكملها، حرارة تعطيل مصل لمدة 30 دقيقة في 56 درجة مئوية بالحمام المائي، والخلط بشكل دوري للحد من ترسب مكونات المصل.
  5. ذوبان الجليد البنسلين / حل الستربتوميسين (القلم / بكتيريا)، هيمن (2 ملغ / مل في 50 ملي هيدروكسيد الصوديوم)، وبصل متوسطة النسر فيتامين الحل في درجة حرارة الغرفة.
  6. إلى 1،000 مل تخرج اسطوانة، إضافة 20.2 غرام من المواد الصلبة SDM79 (الجدول 1) إلى المكونات السائلة (الجدول 2) وتخلط جيدا على طبق من ضجة.
  7. ضبط درجة الحموضة إلى 7.35، وجلب الحجم إلى 850 مل بالماء.
  8. فلتر تعقيم وسائل الإعلام عن طريق ربط خرطوم فراغ إلى أسفل زجاجة التصفية. تطبيق فراغ حتى يتم تصفية الحل.
  9. إزالة رأس مرشح في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية وإضافة 150 مل من الحرارة المعطل FBS. إزالة الغطاء البلاستيك من غطاء زجاجة معقمة وسائل الإعلام الختم.
  10. إعداد وسائل الاعلام SDM80 بنفس الطريقة كما SDM79 مع الاستثناءات التالية. عدم إضافة السكر أو استخدام الجلوكوزامين وMEM دون الجلوتامين. بدلا من 150 مل من الحرارة المعطل FBS، إضافة 135 مل من مدال، الحرارة المعطل FBS، و 15 مل من الحرارة المعطل FBS.
  11. ثقافة الطفيليات PCF في 25 سم 2 قارورة مع 10 مل المتوسطة المناسب حتى 27 درجة مئوية وCO 2 5٪. ملاحظة: يجب عد خلايا يوميا باستخدام عدادة الكريات أو تدفق عداد الكريات (انظر القسم 6) وينبغي الحفاظ على الثقافات بكثافة بين 1 × 10 5 و 5 × 10 6 خلية / مل.

2. آرansfection PCF من الطفيليات مع مراسل تعبيد الفلورسنت

ملاحظة: لمتابعة glycosome ديناميكية، يتم التعبير عن بروتين مراسل تحتوي على تسلسل استهداف peroxisomal (PTS2) من ألدولاز تنصهر لتعزيز بروتين فلوري الأصفر في الطفيليات. تم استنساخ تسلسل ترميز البروتين الانصهار في pXS2bla 12، الذي يحتوي على المروج procyclin والمناطق بين تويولين التي إعادة التركيب مثلي المباشر في الجينوم والجينات المقاومة blasticidin للاختيار. يتم تحويل خطوط الخلايا Procyclic إيواء الجينات التي تكود T7 البلمرة والتتراسيكلين كاظمة (PF29-13) مع بناء الاستهداف، pXS2: PTS2eYFP.

  1. إعداد cytomix عن طريق خلط المكونات المدرجة في الجدول 3. فلتر تعقيم وتخزينها في RT.
  2. خطي DNA البلازميد مع MluI بواسطة pipetting 10 ميكرولتر من الحمض النووي (1 ميكروغرام / ميكرولتر)، 5 ميكرولتر عازلة انزيم التقييد، والمياه 33 ميكرولتر، و 2 μ؛ ل من MluI الانزيم في أنبوب microcentrifuge. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  3. تنقية تقييد هضم بإضافة 1 حجم العازلة ملزمة لتقييد انزيم هضم. مزيج عازلة ملزم DNA وهضمها من قبل vortexing. أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة لجمع العينة في أسفل الأنبوب.
  4. إدراج عمود DNA ملزم في أنبوب جمع 2 مل، ونقل هضمها الحمض النووي / حل العازلة إلى العمود ملزمة.
  5. أجهزة الطرد المركزي ل10،000 x ج لمدة 1 دقيقة. بعد الطرد المركزي، وتجاهل الترشيح من أنبوب جمع وإعادة العمود إلى أنبوب جمع.
  6. إضافة 700 ميكرولتر من SPW غسل العازلة وأجهزة الطرد المركزي في 10،000 x ج لمدة 1 دقيقة.
  7. رشاحة تجاهل من أنبوب جمع، والعودة العمود إلى أنبوب جمع وتكرار غسل وSPW خطوة الطرد المركزي.
  8. تخلصي من الترشيح، العمود العودة إلى أنبوب جمع، وأجهزة الطرد المركزي عمود فارغ لمدة 3 دقائق في 10،000 x ج لإزالة الإيثانول المتبقية.
  9. في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية، ورمي بعيدا العقيدأنبوب فصل من الكتاب المقدس والعمود مكان في أنبوب microcentrifuge العقيمة.
  10. إلى أزل الحمض النووي، إضافة 25 ميكرولتر من الماء المعقم إلى العمود ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي في 10،000 x ج لمدة 1 دقيقة.
  11. إضافة 25 ميكرولتر آخر من الماء المعقم في غطاء محرك السيارة سلامة الأحيائية إلى العمود ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة.
  12. الطرد المركزي على سرعة 10،000 x ج لمدة 1 دقيقة.
  13. في خزانة السلامة البيولوجية نقل كامل حجم الحمض النووي لأنبوب microcentrifuge العقيمة الجديد. ملاحظة: هذه الخطوة تمنع التلوث من الغطاء مفتوحا أثناء الطرد المركزي.
  14. إضافة عقيمة، النقى DNA خطي (10 ميكروغرام) إلى 400 ميكرولتر من cytomix فلتر تعقيم.
  15. عد الخلايا كما هو موضح في القسم 6 وحصاد 5 X10 7 -10 8 الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 800 x ج لمدة 15 دقيقة في RT.
  16. تخلصي من طاف و resuspend بيليه الخلية في 450 ميكرولتر من الحمض النووي + cytomix باستخدام 1 مل ماصة المصلية.
  17. الحل نقل تحتوي على م LLS، DNA، وcytomix إلى معقمة 4 ملم الفجوة كفيت وكفيت مكان في غرفة Electroporation لل.
  18. حدد "الاضمحلال الأسي" يدويا وأدخل الإعدادات التالية: الجهد: 1.5 كيلو فولت، السعة: 25 MF، المقاومة: Ω، وكوفيت: 4 مم. الصحافة النبض. بمجرد اكتمال النبض، وإزالة كفيت من غرفة Electroporation للوالعودة الى مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية.
  19. في قارورة معقمة جديدة، ماصة 10 مل من SDM79. نقل الخلايا تحولت إلى القارورة مع 10 مل من SDM79.
  20. احتضان دون اختيار الدواء لمدة 24 ساعة عند 27 درجة مئوية، 5٪ CO 2. بعد 24 ساعة، إضافة G418 (15 ميكروغرام / مل)، هيغروميسين (50 ميكروغرام / مل)، وblasticidin (10 ميكروغرام / مل). تمرير 1 مل من الخلايا تحولت مع المخدرات في 9 مل من SDM79 مع المخدرات.
  21. تحليل خلايا يوميا كما هو موضح في المقاطع 6 و 7. عندما تكون الخلايا الفلورسنت، وصلت كثافة خلية من 1 × 10 7 / مل، وجعل stabilates للتخزين طويل الأجل (3،1-3،3).
ve_title "> 3. جعل Stabilates

  1. لجعل تجميد وسائل الإعلام، إضافة حجم مساو من الجلسرين بنسبة 100٪ لcytomix وفلتر تعقيم.
  2. إضافة 200 ميكرولتر من تجميد وسائل الإعلام إلى 800 ميكرولتر من الخلايا (1 × 10 7) في cryovial، مزيج بلطف بواسطة انقلاب وقعت بين اثنين من الرفوف الستايروفوم وتجميد في -80 درجة مئوية.
  3. مرة واحدة المجمدة (~ 24 ساعة)، وخلايا نقل إلى النيتروجين السائل. ملاحظة: من المهم تحريك الخلايا في LN 2 بعد 24 ساعة، والتخزين الطويل في -80 درجة مئوية يؤدي إلى انخفاض في بقاء الخلية.

4. الأرصدة المجمدة ذوبان

  1. إزالة قارورة المجمدة من -80 ° C وذوبان الجليد في RT لحوالي 10 دقيقة.
  2. ماصة 9 مل من SDM79 مع المخدرات في قارورة معقمة جديدة. إضافة إلى إذابة خلايا هذه القارورة. تمر خلايا 01:10 بإضافة 1 مل من هذه الثقافة إلى 9 مل من SDM79 في قارورة جديدة (تركيز النهائي من 1 × 10 5 / مل).
  3. قبل الخلايا تصل كثافة 10 7 / مل، تبدأ وضع عداد الكرياتصعودا والمقايسات التخفيف.

5. الإعداد عداد الكريات

  1. بدوره على تدفق عداد الكريات وفتح برنامج CFlow زائد. ملاحظة: قبل تشغيل أي عينات، ينبغي backflushed على fluidics وتشطف وفقا لخطوات 5،2-5،7.
  2. استبدال أنبوب المياه nanopure التي يتم تخزين رشفة مع أنبوب فارغ.
  3. حدد زر "backflush".
  4. مرة واحدة backflush كاملة، وإزالة أنبوب microcentrifuge من رشفة وتجاهل.
  5. وضع أنبوب microcentrifuge الجديد يحتوي على 1 مل من الماء nanopure جديد على رشفة.
  6. اختر بئر جديد في برنامج CFlow. تحت عنوان "حدود تشغيل" ضبط الوقت لمدة 2 دقيقة. تحت عنوان "Fluidics" حدد "سريع" و "تشغيل".
  7. مرة واحدة المهلة 2 دقيقة كاملة، انقر فوق الزر "حذف نموذج البيانات".

6. العد الخلية باستخدام عداد الكريات التدفق

  1. استبدال الماء مع العينة لفرزها. ضبط "حدود تشغيل "إلى 30 ثانية،" Fluidics "إلى" سريع "ثم حدد" تشغيل ".
  2. بعد مهلة 30 ثانية كاملة، بالإضافة إلى CFlow سيوفر الأحداث / ميكرولتر تحت عنوان "الماضي البعيد". كرر تعداد لكل ثقافة. ملاحظة: قبل خلايا تصل إلى 1 × 10 7 خلية / مل، والمضي قدما مع التخفيف الفحص. ينبغي وقف الخلايا بعد اكتمال فحص واحد التخفيف. الخلايا المستزرعة لفترات أطول تفقد قدرتها على الاستجابة للظروف البيئية.

7. قياس الإسفار باستخدام عداد الكريات التدفق

  1. لتقييم مضان، تعيين "حدود تشغيل" ل10،000 الأحداث، و "Fluidics" إلى "بطيء". حدد "تعيين عتبة". تحت عنوان "عتبة الابتدائية"، حدد "بشكل دائم على قضاء الأحداث"، "FSC-H" (في القائمة المنسدلة مربع) وأدخل أقل من 30،000. انقر على "تطبيق"، ثم "إغلاق".
  2. حدد220، الرسم البياني "زر في واحدة من النوافذ مؤامرة جديدة وحدد" FSC-A "من القائمة المنسدلة، حدد" FL1-A ". ملاحظة: التدابير FL1-A مضان في الطول الموجي 530 نانومتر.
  3. حدد "تشغيل" وتكرار لجميع الثقافات.
  4. تشغيل محلول التنظيف من خلال خط fluidics لمدة 2 دقيقة والماء لمدة 2 دقيقة.

8. التخفيف فحوصات

  1. تمر الخلايا إلى كثافة من 1 × 10 5 خلية / مل في 3 مل من SDM79 في 25 سم 2 قارورة الثقافة وقياس الإزهار مباشرة بعد مرور ثم في 3 ساعة و 24 ساعة.

تحليل البيانات 9.

  1. حدد "تحليل" علامة على CFlow زائد.
  2. انقر سوف "الرسم البياني" زر تحت "جعل مؤامرة جديدة." حدد "FSC-A" وقائمة منسدلة تظهر. اختر قناة "FL1-A".
  3. تسليط الضوء جيدا لتحليل. اختر زر "بوابة"، ورسم يدويا بوابةلسكان الفائدة.
  4. وتدفق زائد توفير خلية "عدد" في هذا الباب و"٪ من هذه المؤامرة".

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

في هذا النظام، لوحظ وجود تغير تعتمد على الجلوكوز في glycosome التكوين. عندما تزرع الخلايا في وسائل الإعلام التي تحتوي على السكر، ويلاحظ اثنين من السكان. مشرق واحد وقاتمة واحد (الشكل 2A). خلايا قاتمة تؤوي glycosomes غير ناضجة، والتي يتم استيراد PTS2eYFP في حين أن الخلايا مشرقة تؤوي خليط من glycosomes ناضجة وغير ناضجة 12. عند وجود الجلوكوز في وسائل الإعلام، mislocalization من glycosome بروتينات قاتلة 15،28 ومن المرجح يقترن glycosome التعبير البروتين بشكل وثيق مع الاستيراد. هذا النظام المحكم هو المسؤول عن ظهور خلايا الخافتة التي يتم قمعها glycosome التعبير البروتين عندما تفتقر إلى القدرة على استيراد خلايا كافية. مرة واحدة يتم تجميعها آلية glycosome استيراد بالكامل وظيفية، خلايا تعبر glycosome البروتينات، والتي يتم استيرادها إلى glycosomes، مما أسفر عن خلايا الفلورسنت. في وسائل الإعلام الجلوكوز المستنفدة، وmislocalization glycosome من البروتينات هو تتسامحد 15، والتوزيع السكاني النسقين يتم استبداله ذروة واحدة مع مجموعة أوسع من مضان (الشكل 2B).

وقد استخدم هذا النظام لتحديد الظروف التي تؤدي إلى تغييرات في تكوين glycosome. عندما يتم تمرير الثقافات كثافة عالية تحتوي على خلايا قاتمة ~ 10٪ (الشكل 3A) في وسائل الإعلام الجديدة، هناك زيادة عابرة في النسبة المئوية للخلايا قاتمة (الشكل 3B). قبل 24 ساعة. وأعادت توزيع السكان الأصلي (الشكل 3C).

SDM79 المواد الصلبة الوزن (غرام / لتر)
النعم مسحوق وسائل الإعلام خلية الحشرات 2
الجلوكوز 1
HEPES 8
اجتماعات الأطراف 5
NaHCO 3 2
البيروفات الصوديوم 0.1
L-ألانين 0.2
L-ارجينين 0.1
L-الجلوتامين 0.3
L-Methonine 0.07
L-فينيلالاناين 0.08
L-برولين 0.6
L-سيرين 0.06
L-توراين 0.16
L-ثريونين 0.35
L-التيروسين 0.1
الأدينوزين 0.01
غوانوزين 0.01
الجلوكوزامين حمض الهيدروكلوريك 0.05
حمض الفوليك 0.004
R-أمينوبنزوي حمض 0.002
البيوتين 0.0002

يتم توفير طاولة 1. SDM79 المكونات الصلبة. المكونات الصلبة وسائل الاعلام ومبلغ (جم / لتر).

SDM79
MEM مع الجلوتامين 600 مل
القلم / بكتيريا 10 مل
BME فيتامين الحل 10 مل
MEM الأحماض الأمينية الحل 8 مل
MEM محلول حمض أميني غير أساسي 6 مل
هيمن 3.75
المياه 162.25 مل

يتم إعطاء جدول 2. SDM79 المكونات السائلة. مجلدات مل.

لمدة 20 مل
120 ملي بوكل 1.4 مل (1 M)
0.15 مم CaCl 2 3 مل (1 M)
10 ملي K 2 هبو 4 400 مل (0.5 M)
25 ملي HEPES 500 مل (1 M)
2 مم EDTA 80 مل (0.5 M)
5 ملم MgCl 2 100 مل (1 M)
المياه 16.52

الجدول 3. Cytomix صفة.

الشكل 1
الرقم 1. الفلورسنت نظام مراسل glycosome. أ) التكامل PTS2eYFP التعبير بناء. تحولت المثقبيات PCF مع مقصفS2PTS2eYFP البلازميد خطي مع انزيم تقييد MluI. هذا بناء يدمج عبر إعادة التركيب مثلي في موضع تويولين (حوض) وتسلسل PARP (PARP) يشمل المروج الذي يدفع التعبير التأسيسي من PTS2eYFP وتسلسل المطلوبة لمعالجة RNA. B) PTS2eYFP الاستيراد. يتم تصنيعه PTS2eYFP في السيتوبلازم حيث يربط مستقبلات للذوبان، PEX7، التي توفر البروتين المراسل إلى glycosomes. وبمجرد تسليمها إلى غشاء glycosome، يتم استيراد البروتين. العضيات الناضجة تحتوي على استيراد الآلات PTS2eYFP الاستيراد ومضان بينما تلك التي لا تحتوي على استيراد الآلات وظيفية تظل قاتمة.

الشكل 2
وقد نمت الشكل 2. التي تعتمد على الجلوكوز glycosome التكوين. خلايا PCF في SDM79 (+ GLC) أو SDM80 (-Glc) وتحليل التدفق الخلوي. رسوم بيانية من 10،000 الأحداث. أ) تحليل الخلايا المزروعة في SDM79 يكشف باستمرار قمتين. خلايا الفلورسنت تؤوي خليط من العضيات الناضجة وغير الناضجة مع خلايا كثافة مضان أعلى glycosomes وجود أكثر نضجا. في SDM79، mislocalization من glycosome بروتينات قاتلة ويجب السيطرة glycosome تعبير البروتين واستيراد بإحكام. وينعكس هذا في غياب الخلايا مع كثافة مضان وسيطة. B) في SDM80، والسكوت على mislocalization glycosome من البروتينات، يتم فقدان توزيع السكان النسقين، والتقيد خلايا مضان وسيطة.

الرقم 3
الرقم 3. Glycosome إعادة عرض. يتم تشغيل إعادة عرض من glycosomes من العبور إلى وسائل الإعلام الطازجة. 6 / مل). B) 3 ساعة بعد تخفيفه إلى SDM79 طازجة هناك زيادة في نسبة الخلايا قاتمة مع glycosomes غير ناضجة تدخل في بوابة اليسرى C ) الرسم البياني للثقافة المخفف بعد 24 ساعة. بعد 24 ساعة، عاد التوزيع السكاني إلى وضعها الطبيعي، كما تحتوي على glycosomes غير ناضجة الآن البروتينات تاكسدي اللازمة لاستيراد بروتين فلوري.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Glycosomes هي، ديناميكية، العضيات الطفيلي محددة الأساسية. المرجح أن تشمل العمليات التي تنظم نشوء حيوي والصيانة وانتشار وإعادة عرض هذه العضيات أهداف المخدرات التي يمكن استغلالها لأغراض علاجية. على الرغم من وفرة كبيرة محتملة من هذه الأهداف المخدرات، وتخلفت مجال glycosome نشوء حيوي وراء دراسة عمليات مماثلة في الكائنات الحية الأخرى، في الغالب بسبب عدم وجود لين العريكة، ونظام الإنتاجية العالية التي يمكن من خلالها رصد والديناميكية، والاستجابات السريعة العضيم في الخلايا الحية.

وقد استخدمت أنظمة مراسل الفلورسنت عضية لدراسة ديناميات عضية في أعلى حقيقيات النوى مثل الخميرة والنباتات والفطريات والثدييات 23-25. لقد ولدت سلالة المعدلة وراثيا من الطفيليات PCF التي تعبر عن PTS2eYFP التي تستهدف تنضج glycosomes، مما أسفر عن العضيات الفلورسنت. يمكن رصد التغيرات في تكوين glycosome التالية مضان عبر الخلوي. باستخدام هذا النظام، وجدنا أن الظروف البيئية، لا سيما الجلوكوز، وتنظيم glycosome تكوين 12.

على النقيض من المجهري غالبا ما تستخدم أساليب لدراسة ديناميات عضية في kinetoplastid الطفيليات، وهذا النظام يوفر مراسل الطريقة التي لفحص المركبات بسرعة والظروف التي تؤثر على ديناميات glycosome الشاملة. ومع ذلك، فإن التغييرات في مضان تعكس التغيرات في تركيبة عضية الشاملة. ويطلب المزيد من التجارب الكيميائية الحيوية والمجهرية لتحديد الاختلافات الجزيئية محددة بين السكان الخلية العارضة كثافة مضان مختلفة.

حددنا عددا من الخطوات الحاسمة في المقايسات إعادة عرض. ومن المثير للاهتمام، وجدنا أن الخلايا كما يتم تربيتها لفترات أطول (أكثر من مرورين)، سلوكهم في استجابة للتغيرات البيئية لا يمكن التنبؤ بها. بعد زراعة طويلة، وخلايا مرت من كثافة عالية في م جديدةالقانونين، تظهر زيادة مؤقتة في عدد السكان خافت، مشيرة إلى أنها لا تزال قادرة على اعادة glycosomes، ولكن يموت بعد 24 ساعة. واجهتنا أيضا الحالات التي يلاحظ أي إعادة عرض. سبب هذا السلوك غير واضح ولكن وجدنا أنه عندما يتم التعامل مع الخلايا كما هو موضح هنا (الحد من عدد من المقاطع الخلية إلى اثنين والحفاظ على ثقافتها أقل من 1 × 10 7 / مل)، glycosome هو إعادة استنساخه. عندما لم تعد الخلايا تستجيب للظروف البيئية، retransforming الخلايا مع البلازميد المراسل بناء عادة وسائل الانتصاف هذه الحالة.

في حين أن هذا النظام قد تم استخدامها لدراسة السلوك في glycosome المثقبيات الأفريقية، كما يمكن اعتمادها لدراسة العضيات في الطفيليات الأخرى من دمج البروتينات الفلورية لسلاسل الأحماض الأمينية التي البروتين المباشر لتوطين المقصورات الخلوية الأخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenosine Avocado Research Chemicals Ltd A10781 SDM79 Ingredient
L-Alanine Avocado Research Chemicals Ltd A15804 SDM79 Ingredient
L-Arginine CalBiochem 1820 SDM79 Ingredient
p-Aminobenzoic acid ICN Biomedicals 102569 SDM79 Ingredient
Basal Medium Eagle Vitamin Solution (100x) Sigma B6891 SDM79 Ingredient
Biotin Fisher BP232-1 SDM79 Ingredient
Calcium chloride VWR BDH0224 Cytomix
EDTA Fisher S311-100 Cytomix ingredient
EZNA Gel Extraction kit Omega Biotek D2500-01 DNA purifiation
Research grade Serum Fisher 03-600-511 SDM79 Ingredient
Folic acid ICN Biomedicals 101725 SDM79 Ingredient
Glucosamine HCl ICN Biomedicals 194671 SDM79 Ingredient
Glucose GIBCO 15023-021 SDM79 Ingredient
L-Glutamine CalBiochem 3520 SDM79 Ingredient
Glycerol Acros Organics Ac15892-0010 Freezing media
Graces insect cell media powder GIBCO 11300-043 SDM79 Ingredient
Hemin MP Biomedicals 194025 SDM79 Ingredient
Guanosine Avocado Research Chemicals Ltd A11328 SDM79 Ingredient
HEPES MP Biomedicals 194025 SDM79 Ingredient
Magnesium chloride Fisher BP214-500 Cytomix ingredient
L-Methionine Fisher BP388-100 SDM79 Ingredient
MEM Amino Acids (50x) Cellgro 25-030-CI SDM79 Ingredient
NEAA Mixture (100x) Lonza 13-114E SDM79 Ingredient
Minimal Essential Medium (1x) with L-glutamine Cellgro 10-010-CM SDM79 Ingredient
MOPS Fisher BP308-500 SDM79 Ingredient
Sodium biocarbonate Fisher S233-500 SDM79 Ingredient
Penicillin-streptomycin Solution Cellgro 30-002-CI SDM79 Ingredient
L-Phenylalanine ICN Biomedicals 102623 SDM79 Ingredient
Potassium chloride Fisher P217-500 Cytomix ingredient
Potassium phosphate dibasic anhydrous Fisheer P290-212 Cytomix ingredient
L-Proline Fisher BP392-100 SDM79 Ingredient
L-Serine Acros Organics 56-45-1 SDM79 Ingredient
Pyruvic acid, sodium salt Acros Organics 113-24-6 SDM79 Ingredient
L-Taurine TCI America A0295 SDM79 Ingredient
L-Threonine Acros Organics 72-19-5 SDM79 Ingredient
L-Tyrosine ICN Biomedicals 103183 SDM79 Ingredient
E.Z.N.A. Cycle Pure kit Omega Biotek D6492-02 DNA purification
Binding buffer Omega Biotek PDR041 DNA purification
SPW wash buffer Omega Biotek PDR045 DNA purification
Gene Pulser Xcell Biorad 165-2660 Trypanosome transformation
4 mm Electroporation cuvettes VWR Trypanosome transformation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stuart, K., et al. Kinetoplastids: related protozoan pathogens, different diseases. J Clin Invest. 118, 1301-1310 (2008).
  2. Herman, M., Perez-Morga, D., Schtickzelle, N., Michels, P. A. Turnover of glycosomes during life-cycle differentiation of Trypanosoma brucei. Autophagy. 4, 294-308 (2008).
  3. Herman, M., Gillies, S., Michels, P. A., Rigden, D. J. Autophagy and related processes in trypanosomatids: insights from genomic and bioinformatic analyses. Autophagy. 2, 107-118 (2006).
  4. Michels, P. A., Bringaud, F., Herman, M., Hannaert, V. Metabolic functions of glycosomes in trypanosomatids. Biochim Biophys Acta. 1763, 1463-1477 (2006).
  5. Michels, P. A., et al. Peroxisomes, glyoxysomes and glycosomes (review). Mol Membr Biol. 22, 133-145 (2005).
  6. Moyersoen, J., Choe, J., Fan, E., Hol, W. G., Michels, P. A. Biogenesis of peroxisomes and glycosomes: trypanosomatid glycosome assembly is a promising new drug target. FEMS Microbiol Rev. 28, 603-643 (2004).
  7. Parsons, M., Furuya, T., Pal, S., Kessler, P. Biogenesis and function of peroxisomes and glycosomes. Molecular and biochemical parasitology. 115, 19-28 (2001).
  8. Parsons, M. Glycosomes: parasites and the divergence of peroxisomal purpose. Mol Microbiol. 53, 717-724 (2004).
  9. Michels, P. A., Hannaert, V., Bringaud, F. Metabolic aspects of glycosomes in trypanosomatidae - new data and views. Parasitol Today. 16, 482-489 (2000).
  10. Michels, P. A., Hannaert, V. The evolution of kinetoplastid glycosomes. J Bioenerg Biomembr. 26, 213-219 (1994).
  11. Hannaert, V., Michels, P. A. Structure function, and biogenesis of glycosomes in kinetoplastida. J Bioenerg Biomembr. 26, 205-212 (1994).
  12. Bauer, S., Morris, J. C., Morris, M. T. Environmentally regulated glycosome protein composition in the african trypanosome. Eukaryot Cell. 12, 1072-1079 (2013).
  13. Colasante, C., Ellis, M., Ruppert, T., Voncken, F. Comparative proteomics of glycosomes from bloodstream form and procyclic culture form Trypanosoma brucei brucei. Proteomics. 6, 3275-3293 (2006).
  14. Opperdoes, F. R. Compartmentation of carbohydrate metabolism in trypanosomes. Annu Rev Microbiol. 41, 127-151 (1987).
  15. Kessler, P. S., Parsons, M. Probing the role of compartmentation of glycolysis in procyclic form Trypanosoma brucei: RNA interference studies of PEX14, hexokinase, and phosphofructokinase. The Journal of biological chemistry. 280, 9030-9036 (2005).
  16. Bringaud, F., Riviere, L., Coustou, V. Energy metabolism of trypanosomatids: adaptation to available carbon sources. Molecular and biochemical parasitology. 149, 1-9 (2006).
  17. Coustou, V., et al. Glucose-induced remodeling of intermediary and energy metabolism in procyclic Trypanosoma brucei. The Journal of biological chemistry. 283, 16342-16354 (2008).
  18. Lamour, N., et al. Proline metabolism in procyclic Trypanosoma brucei is down-regulated in the presence of glucose. The Journal of biological chemistry. 280, 11902-11910 (2005).
  19. Vertommen, D., et al. Differential expression of glycosomal and mitochondrial proteins in the two major life-cycle stages of Trypanosoma brucei. Molecular and biochemical parasitology. 158, 189-201 (2008).
  20. Vickerman, K. Developmental cycles and biology of pathogenic trypanosomes. British medical bulletin. 41, 105-114 (1985).
  21. Lorenz, P., Maier, A. G., Baumgart, E., Erdmann, R., Clayton, C. Elongation and clustering of glycosomes in Trypanosoma brucei overexpressing the glycosomal Pex11p. The EMBO journal. 17, 3542-3555 (1998).
  22. Saveria, T., et al. Conservation of PEX19-binding motifs required for protein targeting to mammalian peroxisomal and trypanosome glycosomal membranes. Eukaryot Cell. 6, 1439-1449 (2007).
  23. Banerjee, S. K., Kessler, P. S., Saveria, T., Parsons, M. Identification of trypanosomatid PEX19: functional characterization reveals impact on cell growth and glycosome size and number. Molecular and biochemical parasitology. 142, 47-55 (2005).
  24. Milagros Camara Mde, L., Bouvier, L. A., Miranda, M. R., Pereira, C. A. Identification and validation of Trypanosoma cruzi's glycosomal adenylate kinase containing a peroxisomal targeting signal. Experimental parasitology. 130, 408-411 (2012).
  25. Wiemer, E. A., Wenzel, T., Deerinck, T. J., Ellisman, M. H., Subramani, S. Visualization of the peroxisomal compartment in living mammalian cells: dynamic behavior and association with microtubules. The Journal of cell biology. 136, 71-80 (1997).
  26. Kim, P. K., Mullen, R. T., Schumann, U., Lippincott-Schwartz, J. The origin and maintenance of mammalian peroxisomes involves a de novo PEX16-dependent pathway from the ER. The Journal of cell biology. 173, 521-532 (2006).
  27. Hoepfner, D., Schildknegt, D., Braakman, I., Philippsen, P., Tabak, H. F. Contribution of the endoplasmic reticulum to peroxisome formation. Cell. 122, 85-95 (2005).
  28. Furuya, T., et al. Glucose is toxic to glycosome-deficient trypanosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14177-14182 (2002).
باستخدام البروتينات الفلورية لرصد ديناميات Glycosome في المثقبيات الأفريقي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bauer, S., Conlon, M., Morris, M. Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome. J. Vis. Exp. (90), e51647, doi:10.3791/51647 (2014).More

Bauer, S., Conlon, M., Morris, M. Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome. J. Vis. Exp. (90), e51647, doi:10.3791/51647 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter