Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Met behulp van fluorescerende eiwitten naar Monitor Glycosome Dynamiek in de Afrikaanse Trypanosoom

doi: 10.3791/51647 Published: August 19, 2014

Abstract

Trypanosoma brucei is een kinetoplastid parasiet die humane Afrikaanse slaapziekte (HAT), of slaapziekte, en een slopende ziekte, Nagana veroorzaakt, bij runderen 1. De parasiet afwisselend de bloedbaan van de zoogdier gastheer en de tseetseevlieg vector. De samenstelling van veel cellulaire organellen verandert in reactie op deze verschillende extracellulaire condities 2-5.

Glycosomen zijn zeer gespecialiseerde peroxisomen waarin veel van de betrokken bij de glycolyse enzymen zijn gecompartimenteerd. Glycosome samenstelling verandert in een ontwikkelings-en milieuvriendelijke gereguleerde manier 4-11. Momenteel is de meest gebruikte technieken om glycosome dynamica te bestuderen zijn elektron en fluorescentiemicroscopie; technieken zijn duur, tijd en arbeidsintensief en niet gemakkelijk worden aangepast aan hoge doorvoer analyse.

Om deze beperkingen, een fluorescerende-glycosome reporter systeem in te overwinnendie geel fluorescerend eiwit (eYFP) meer gefuseerd aan een peroxisomen targeting sequentie (PTS2), waarbij het ​​fusie-eiwit glycosomen 12 verbindt, is vastgesteld. Bij de invoer van de PTS2eYFP fusie-eiwit, glycosomen geworden fluorescerend. Organel afbraak en recycling resulteert in het verlies van fluorescentie die kan worden gemeten door stroming cytometrie. Grote aantallen cellen (5.000 cellen / sec) kunnen in real-time worden geanalyseerd, matrixvoorbereiding zoals fixatie en bevestigingsmiddelen. Deze werkwijze biedt een snelle manier detecteren van veranderingen in organel samenstelling in reactie op wisselende omgevingsomstandigheden.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Trypanosoma brucei veroorzaakt Afrikaanse slaapziekte bij de mens en een slopende ziekte, Nagana, bij runderen. Geneesmiddelen die worden gebruikt bij de behandeling van deze ziekten zijn verouderd en uiterst giftig, vaccins beschikbaar zijn, en het potentieel voor de ontwikkeling van resistentie vereist de zoektocht naar nieuwe drug targets 1.

Tijdens zijn levenscyclus, T. brucei, afwisselend een insect vector en zoogdiergastheer-; twee hosts die zeer verschillende omgevingen waarin de parasiet moet overleven presenteren. Een aantal metabolische en morfologische veranderingen optreden als de parasiet blootgesteld aan verschillende omgevingsomstandigheden. Enkele van de meest dramatische veranderingen zijn waargenomen bij enkele-membraan begrensd parasiet specifieke microlichamen, genoemd glycosomen 13.

Glucosespiegels zijn relatief hoog (~ 5 mM) in het bloed en bloed parasieten (BSF) genereren ATP uitsluitend via glycolyse while mitochondriale stofwisseling wordt onderdrukt 14. In tegenstelling tot andere eukaryoten waar glycolyse optreedt in het cytoplasma, T. brucei compartmentalizes meeste glycolytische enzymen in glycosomen 14,15. De parasieten worden door de tseetseevlieg tijdens een bloedmeel genomen en ervaren een daling in glucose, dat valt te stellen niveaus binnen 15 minuten te worden ingenomen door de vlieg. Het metabolisme van insecten, procyclische vorm (PCF), parasieten is flexibeler en glucose, alsook aminozuren zoals proline, kan worden gebruikt bij de synthese van ATP 16-18. Vergelijkende proteomics studies blijkt lifecycle afhankelijke veranderingen in glycosomal en mitochondriale eiwitten met glycolytisch eiwitten toegenomen in de bloedbaan parasieten en mitochondriale eiwitten die betrokken zijn bij de TCA-cyclus en respiratoire keten 13,19. Terwijl veel studies hebben zich gericht op de verschillen tussen de BSF en PCF glycosomen, is er weinig bekend over de veranderingen in de PCF glycosomen die optreden als reactie op environmental veranderingen.

In de dikke darm van de vlieg, het glucose laag is met een voorbijgaande verhoging tijdens een voeding 20. In de meeste in vitro studies, zijn PCF parasieten gekweekt in medium met glucose. Echter, recente studies hebben aangetoond dat PCF stofwisseling sterk verandert in reactie op de beschikbaarheid van 17 glucose. Aangezien glucose, proline opname en proline dehydrogenase activiteit verhogen 18. Deze verandering in het mitochondriaal metabolisme waarschijnlijk gepaard met een verandering in glycosome samenstelling en morfologie, maar dit is niet direct beoordeeld.

Elektron en fluorescentie microscopie worden gemeenschappelijke technieken gebruikt om glycosome dynamiek in T. brucei 2,21-24. Deze protocollen zijn tijd en arbeidsintensief, duur en moeilijk aan te passen om real-time studies hoge doorvoer protocollen. Om deze beperking te overwinnen, een tl-organel reporter systeem used naar organellen in zoogdiercellen en gist te bestuderen is aangepast voor gebruik in T. brucei 12.

Fluorescent organel reportersystemen zijn uitgebreid gebruikt in hogere eukaryoten zoals gist, planten en zoogdiercellen 25-27. In dergelijke systemen wordt een fluorescerend eiwit gefuseerd aan een aminozuursequentie die het eiwit aan specifieke organellen gericht. De afbraak en synthese van de beoogde eiwitten gemeten via fluorescentie en veranderingen in organel samenstelling worden gereflecteerd door veranderingen in cel fluorescentie.

Wanneer het open leesraam van versterkte geel fluorescent eiwit (eYFP) gefuseerd aan een type II peroxisomale targeting sequentie (PTS2) 12, wordt de PTS2eYFP eiwit invoer in rijpe, import-bevoegde glycosomen en fluorescentie kan worden gevolgd via flowcytometrie. Variaties in glycosome preparaat worden gereflecteerd door veranderingen in de cellulaire fluorescentie. Dit systeem kan helpen bij resolVing de mechanismen die het milieu veroorzaakte veranderingen in glycosome samenstelling te regelen.

Dit manuscript beschrijft de vorming van een glycosome reporter systeem PCF parasieten in combinatie met flowcytometrie om real-time glycosome dynamiek in levende parasieten volgen en een voorbeeld van hoe het is gebruikt om veranderingen in glycosome samenstelling volgen in reactie op verschillende omgevingen. Samengevat wordt glycosome samenstelling beïnvloed door extracellulaire glucose concentraties en passage van log-fase culturen in vers medium triggers veranderingen in glycosome samenstelling. Dit systeem kan worden aangepast om het dynamische gedrag van andere organellen in trypanosomen en andere parasieten bestuderen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1 Algemeen Trypanosoom Veehouderij

  1. Weeg vaste stoffen SDM79 media preparaat (Tabel 1).
  2. Bewaar bij 4 ° C in 50 ml conische of een hersluitbaar zakje. OPMERKING: Reagentia stabiel gedurende tenminste 6 maanden.
  3. Dooi foetaal bovine serum (FBS) in een 37 ° C waterbad, en meng die periodiek door inversie. OPMERKING: FBS ontvangen van de leverancier als een steriele oplossing. Filter steriliseren FBS verlaagt haar vermogen parasiet groei.
  4. Zodra de gehele fles wordt ontdooid, warmte inactiveren serum gedurende 30 minuten in een 56 ° C waterbad, mengen periodiek precipitatie van serumcomponenten minimaliseren.
  5. Ontdooien penicilline / streptomycine-oplossing (pen / strep), hemine (2 mg / ml in 50 mM NaOH), en basaal medium eagle vitamine oplossing bij kamertemperatuur.
  6. Aan een 1000 ml maatglas, voeg 20,2 g SDM79 vaste stoffen (tabel 1) aan de vloeibare bestanddelen (tabel 2) en meng goed op een roerplaat.
  7. Breng de pH op 7,35, en breng het volume tot 850 ml met water.
  8. Filter steriliseer media Door een vacuümslang onderaan een filter fles. Breng vacuüm totdat de oplossing wordt gefiltreerd.
  9. Verwijder filter boven in de bioveiligheid kast en voeg 150 ml geïnactiveerd FBS. Verwijder de plastic afdekking van steriele dop en verzegeling media fles.
  10. Bereid SDM80 media op dezelfde wijze als SDM79 met de volgende uitzonderingen; kan glucose of glucosamine niet toevoegen en gebruiken MEM zonder glutamine. In plaats van 150 ml hitte geïnactiveerd FBS, voeg 135 ml gedialyseerd warmte geïnactiveerd FBS en 15 ml hitte geïnactiveerd FBS.
  11. Cultuur PCF parasieten in 25 cm2 kolf met 10 ml geschikt medium bij 27 ° C en 5% CO2. OPMERKING: De cellen moeten dagelijks worden geteld met behulp van een hemocytometer of flowcytometeranalyses (zie hoofdstuk 6) en culturen moet worden gehandhaafd op dichtheden tussen 1 x 10 5 en 5 x 10 6 cellen / ml.

2 Transfection van PCF Parasieten met de TL-Reporter Construct

OPMERKING: glycosome dynamiek volgen, een reporter eiwit dat het peroxisomale targeting sequentie (PTS2) van aldolase gefuseerd met verbeterde geel fluorescent eiwit tot expressie in de parasieten. De sequentie coderend voor het fusie-eiwit wordt gekloneerd in pXS2bla 12, die procyclin promoter en tubuline intergene gebieden die direct homologe recombinatie in het genoom en de blasticidine resistentie-gen voor selectie bevat. Procyclische cellijnen die het op genen die coderen voor het T7 polymerase en tetracycline repressor (PF29-13) worden getransformeerd met de targeting construct, pXS2: PTS2eYFP.

  1. Bereid cytomix door het mengen van de in tabel 3 genoemde onderdelen. Filter steriliseer en bewaar bij kamertemperatuur.
  2. Lineariseren plasmide DNA met MluI pipetteren 10 ui DNA (1 ug / ul), 5 ui restrictie-enzym buffer, 33 pl water en 2 μ, L MluI enzym in een microcentrifugebuis. Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur.
  3. Zuiver het restrictiedigestie door 1 volume bindingsbuffer het restrictie-enzym digest. Meng bindende buffer en verteerd DNA door vortexen. Kort Centrifugeer het monster op de bodem van de reageerbuis te verzamelen.
  4. Plaats een DNA bindende kolom in een 2 ml verzamelbuis en overdracht gedigereerd DNA / bindingsbuffer oplossing kolom.
  5. Centrifugeer 10.000 xg gedurende 1 minuut. Na het centrifugeren, gooi filtraat uit de collectie buis en terug te keren in de kolom aan de collectie buis.
  6. Voeg 700 ul van SPW wasbuffer en centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 1 minuut.
  7. Weggooien filtraat uit de collectie buis, terug in de kolom aan de collectie buis en herhaal SPW wasstap en centrifugeren.
  8. Gooi filtraat terugkeer kolom verzamelbuis en gecentrifugeerd lege kolom gedurende 3 minuten bij 10.000 xg om resterende ethanol te verwijderen.
  9. In een bioveiligheid kast, weggooien collectie buis plaats kolom in een steriele microcentrifugebuis.
  10. Om het DNA te elueren, voeg 25 ul steriel water naar kolom en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten. Centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 1 minuut.
  11. Voeg nog 25 uit steriel water bioveiligheid kap kolom en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten.
  12. Centrifugeer bij 10.000 xg snelheid gedurende 1 minuut.
  13. In een bioveiligheid kast gehele volume van DNA over te dragen aan een nieuwe steriele microcentrifugebuisje. OPMERKING: Deze stap voorkomt vervuiling van de open deksel tijdens het centrifugeren.
  14. Voeg de steriele, gezuiverde, gelineariseerd DNA (10 ug) tot 400 gl-filter gesteriliseerd cytomix.
  15. Tellen cellen zoals beschreven in hoofdstuk 6 en oogsten 5 x10 7 -10 8 cellen door centrifugeren bij 800 xg gedurende 15 min bij kamertemperatuur.
  16. Giet supernatant en resuspendeer de celpellet in 450 ui DNA + cytomix met een 1 ml serologische pipet.
  17. Transfer oplossing met ce lls, DNA, en cytomix een steriele 4 mm gat cuvet en plaats cuvette in de elektroporatie kamer.
  18. Selecteer "exponentieel verval" en handmatig de volgende instellingen: Voltage: 1,5 kV, Capaciteit: 25 mF, Resistance: Ω, en Cuvette: 4 mm. Druk op puls. Zodra de puls is voltooid, verwijdert cuvette uit de elektroporatie kamer en terug te keren naar de bioveiligheid kast.
  19. In een nieuwe steriele fles, pipet 10 ml van SDM79. Breng de getransformeerde cellen aan de kolf met 10 ml SDM79.
  20. Incubeer zonder geneesmiddelselectie voor 24 uur bij 27 ° C, 5% CO2. Na 24 uur, voeg G418 (15 ug / ml), hygromycine (50 ug / ml) en blasticidine (10 ug / ml). Pass 1 ml van getransformeerde cellen met drugs in 9 ml SDM79 met drugs.
  21. Analyseren cellen dagelijks, zoals beschreven in de paragrafen 6 en 7 Wanneer cellen zijn fluorescerend, en een celdichtheid van 1 x 10 7 / ml hebben bereikt, maken stabilaten voor langdurige opslag (3.1-3.3).
ve_title "> 3. Making stabilaten

  1. Om bevriezing media, een gelijk volume van 100% glycerol cytomix en filter steriliseren.
  2. Voeg 200 ul van bevriezing media 800 ul cellen (1 x 10 7) in een cryovial, meng voorzichtig door omkering en tussen twee Styrofoam rekken en bevriezen bij -80 ° C.
  3. Eenmaal bevroren (~ 24 uur), de overdracht cellen om vloeibare stikstof. Opmerking: Het is belangrijk om cellen verplaatsen naar LN 2 na 24 uur, zoals langere opslag bij -80 ° C leidt tot een afname in cellevensvatbaarheid.

4 Ontdooien Ingevroren Voorraden

  1. Verwijder bevroren flacon van -80 ° C en ontdooien bij kamertemperatuur gedurende ongeveer 10 minuten.
  2. Pipetteer 9 ml SDM79 met drugs in een nieuwe steriele kolf. Voeg ontdooide cellen aan deze kolf. Pass cellen 01:10 door toevoeging van 1 ml van deze kweek 9 ml SDM79 in een nieuwe kolf (eindconcentratie van 1 x 10 5 / ml).
  3. Voordat de cellen een dichtheid van 10 7 / ml bereikt, beginnen cytometer seten verdunning assays.

5 Cytometer Setup

  1. Zet de flowcytometer en cflow Plus-programma te openen. OPMERKING: Voordat u de nodige monsters moet de fluïdica worden teruggespoeld en gespoeld volgens stappen 5,2-5,7.
  2. Plaats de buis nanozuiver water waarin de sip opgeslagen met een lege buis.
  3. Selecteer de "backflush" knop.
  4. Zodra backflush is voltooid, verwijdert microcentrifugebuisje van slok en gooi.
  5. Plaats een nieuwe microcentrifugebuis met 1 ml van nieuwe nanozuiver water op de slok.
  6. Selecteer een nieuwe put in cflow programma. Onder "Limieten Run" ingestelde tijd gedurende 2 minuten. Onder "Fluidics" selecteer "snel" en "Run".
  7. Zodra de 2 min tijdslimiet is voltooid, klikt u op de knop "Delete Data Sample".

6 Celtelling gebruik van de Flow Cytometer

  1. Vervang het water met het monster moet worden geteld. Stel "Run Limits "tot 30 sec," Fluidics "om" snel "en selecteer vervolgens" Uitvoeren ".
  2. Na de 30 seconden tijdslimiet is voltooid, cflow plus zal de gebeurtenissen / ul onder "Laatste Run." Herhaal telling voor elke cultuur te bieden. OPMERKING: Voordat cellen te bereiken 1 x 10 7 cellen / ml, doorgaan met verdunningstest. De cellen moeten worden stopgezet na een verdunningstest is voltooid. Cellen gekweekt voor een langere periode verliezen hun vermogen om te reageren op milieu-omstandigheden.

7 Het meten van fluorescentie met behulp van de Flow Cytometer

  1. Fluorescentie te beoordelen, stelt u "Run Limits" tot 10.000 gebeurtenissen, en "Fluidics" om "langzaam". Selecteer "Set drempel". Onder "Primaire Threshold", selecteer "permanent elimineren gebeurtenissen op", "FSC-H" (in het drop down box) en voer minder dan 30.000. Klik op "Apply", dan op "close".
  2. Selecteer220; Histogram "knop in een van de nieuwe plot ramen en selecteer" FSC-A "uit het drop-down lijst, selecteert u" FL1-A ". OPMERKING: VT1-A maatregelen fluorescentie in de 530 nm golflengte.
  3. Selecteer "Run" en herhaal voor alle culturen.
  4. Ren reinigingsoplossing via fluïdica lijn voor 2 min en water gedurende 2 min.

8 Verwatering Testen

  1. Pass cellen tot een dichtheid van 1 x 10 5 cellen / ml in 3 ml SDM79 in een 25 cm2 kolf en meet fluorescentie onmiddellijk na passage en vervolgens 3 uur en 24 uur.

9 Data Analysis

  1. Selecteer "Analyseer" tab op cflow Plus.
  2. Klik op "Histogram" knop onder "Maak een nieuw plot." Selecteer "FSC-A" en een drop down lijst zal verschijnen. Selecteer kanaal "FL1-A."
  3. Markeer een goed te analyseren. Selecteer "Gate" knop, en een poort met de hand te tekenenvoor de bevolking van belang.
  4. Flow Plus cell "Graaf" in deze poort en "% van dit perceel" te leveren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

In dit systeem werd een glucose-afhankelijke verandering in glycosome samenstelling waargenomen. Wanneer cellen worden gekweekt in glucose bevattend medium, worden twee populaties waargenomen; een lichte en een dim (Figuur 2A). Dim cellen haven onvolwassen glycosomen, die niet zijn geïmporteerd het PTS2eYFP terwijl heldere cellen herbergen een mix van rijpe en onrijpe glycosomen 12. Wanneer glucose aanwezig is in de media is, mislocalisatie van glycosome eiwitten is dodelijk 15,28 en glycosome eiwit expressie is waarschijnlijk nauw gekoppeld aan import. Deze strakke regeling is verantwoordelijk voor het verschijnen van donkere cellen waarin glycosome eiwitexpressie wordt onderdrukt wanneer de cellen onvoldoende import vermogen. Zodra de glycosome import machine volledig gemonteerd en brengen de cellen glycosome eiwitten, die vervolgens worden ingevoerd in glycosomen waardoor fluorescerende cellen. In glucose-afbrekende media, de mislocalisatie van glycosome eiwitten is tolererend 15 en de bimodale verdeling populatie wordt vervangen door een enkele piek met een breder scala van fluorescentie (figuur 2B).

Dit systeem is gebruikt om omstandigheden die veranderingen in glycosome samenstelling activeren identificeren. Bij hoge dichtheid kweken met ~ 10% dim cellen (Figuur 3A) worden doorgegeven in vers medium, is er een tijdelijke verhoging van het percentage cellen dim (Figuur 3B). Door 24 uur. de oorspronkelijke verdeling van de bevolking is hersteld (Figuur 3C).

SDM79 Solids Gewicht (g / l)
Graces insect cel media poeder 2
Glucose 1
HEPES 8
MOPS 5
NaHCO3 2
Natriumpyruvaat 0,1
L-Alanine 0,2
L-Arginine 0,1
L-Glutamine 0,3
L-Methonine 0,07
L-Fenylalanine 0,08
L-Proline 0.6
L-Serine 0.06
L-Taurine 0.16
L-Threonine 0.35
L-Tyrosine 0,1
Adenosine 0.01
Guanosine 0.01
Glucosamine HCl 0.05
Foliumzuur 0.004
r-aminobenzoëzuur 0.002
Biotine 0.0002

Tabel 1 SDM79 vaste componenten. Massieve media componenten en de hoeveelheid (g / l) worden voorzien.

SDM79
MEM met glutamine 600 ml
Pen / Strep 10 ml
BME vitamine oplossing 10 ml
MEM aminozurenoplossing 8 ml
MEM niet-essentieel aminozuur oplossing 6 ml
Hemin 3.75
Water 162.25 ml

Tabel 2 SDM79 vloeibare componenten. Volumes ml worden gegeven.

Voor 20 ml
120 mM KCl 1.4 ml (1M)
0,15 mM CaCl2 3 ml (1M)
10 mM K 2 HPO 4 400 ml (0,5 M)
25 mM HEPES 500 ml (1M)
2 mM EDTA 80 ml (0,5 M)
5 mM MgCl2 100 ml (1M)
Water 16.52

Tabel 3 Cytomix recept.

Figuur 1
Figuur 1 TL glycosome reporter systeem. A) PTS2eYFP expressieconstruct integratie. PCF trypanosomen werden getransformeerd met de pXS2PTS2eYFP plasmide gelineariseerd met restrictie-enzym MluI. Dit construct integreert via homologe recombinatie in de tubuline locus (bad) en PARP sequenties (PARP) omvat de promotor die de constitutieve expressie van PTS2eYFP en de voor RNA processing. B sequenties) PTS2eYFP import drijft. PTS2eYFP wordt gesynthetiseerd in het cytoplasma waar het bindt de oplosbare receptor, PEX7, waarbij de reporter eiwit de glycosomen levert. Eenmaal door glycosome membraan wordt het eiwit geïmporteerd. Mature organellen bevatten import machines import PTS2eYFP en fluorescentie terwijl degenen die niet functioneel import machines bevatten dim blijven.

Figuur 2
Figuur 2 glucose-afhankelijke glycosome preparaat. PCF-cellen werden gekweekt in SDM79 (+ Glc) of SDM80 (Glc) endoor flow cytometrie geanalyseerd. Histogrammen van 10.000 gebeurtenissen. A) Analyse van cellen gekweekt in SDM79 onthult consequent twee pieken. Fluorescerende cellen herbergen een mix van rijpe en onrijpe organellen met cellen van hogere fluorescentie-intensiteiten met meer volwassen glycosomen. In SDM79, mislocalisatie van glycosome eiwitten is dodelijk en glycosome eiwit expressie en import moet goed worden gecontroleerd. Dit blijkt in afwezigheid van cellen met tussenliggende fluorescentie-intensiteiten. B) In SDM80 wordt de mislocalisatie van glycosome eiwitten getolereerd de bimodale verdeling bevolking verloren en cellen tussenproduct fluorescentie waargenomen.

Figuur 3
Figuur 3 Glycosome remodeling. Verbouwing van glycosomen wordt veroorzaakt door passage in vers medium. 6 / ml). B) 3 uur na verdunning in vers SDM79 er een toename van het aandeel van dim cellen met onrijpe glycosomen die binnen de linker poort C ) Histogram van de verdunde cultuur na 24 uur. Na 24 uur is de spreiding van de bevolking weer normaal, aangezien de onrijpe glycosomen het peroxisoom eiwitten noodzakelijk is om de fluorescerende eiwit bevatten nu importeren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Glycosomen zijn essentieel, dynamisch, parasiet-specifieke organellen. De processen die de biogenese, onderhoud, proliferatie en verbouwing van deze organellen regelen waarschijnlijk ook drug targets die kunnen worden benut voor therapeutische doeleinden. Ondanks het potentieel hoge overvloed van deze targets, is het gebied van glycosome biogenese achterbleef het bestuderen van gelijkaardige processen in andere organismen, voornamelijk door het ontbreken van een soepel, high-throughput systeem waarbij snelle, dynamische, organel antwoorden monitoren in levende cellen.

Fluorescent organel reportersystemen zijn gebruikt om organel dynamiek studie in hogere eukaryoten zoals gist, planten, schimmels en zoogdieren 23-25. We hebben een transgene stam van PCF parasieten die PTS2eYFP drukken dat is gericht op glycosomen rijpen gegenereerd, waardoor fluorescerende organellen. Veranderingen in glycosome samenstelling kunnen worden gecontroleerd via onderstaande cellulaire fluorescentie. Met dit systeem hebben wij gevonden dat omgevingsfactoren, zoals glucose, reguleren glycosome samenstelling 12.

In tegenstelling tot werkwijzen vaak gebruikt organel dynamiek kinetoplastid parasieten bestuderen microscopie, deze reporter systeem biedt een methode om snel te screenen verbindingen en omstandigheden die algemeen glycosome dynamiek beïnvloeden. De veranderingen in fluorescentie de veranderingen in totale organel samenstellingen. Verdere biochemische en microscopische experimenten moeten de specifieke moleculaire verschillen tussen celpopulaties vertonen verschillende fluorescentie-intensiteiten definiëren.

We hebben een aantal kritische stappen in de verbouwing assays kwamen. Interessant is dat we vonden dat de cellen worden gedurende een langere periode (meer dan twee passages), hun gedrag in reactie op omgevingsveranderingen is onvoorspelbaar. Na langdurig kweken cellen doorgegeven van hoge dichtheden in de frisse media, vertonen een tijdelijke verhoging van de dim bevolking, wat aangeeft dat ze nog steeds in staat om glycosomen verbouwen, maar sterven na 24 uur. We hebben ook ondervonden situaties waarin geen verbouwing wordt waargenomen. De reden voor dit gedrag is niet duidelijk, maar we hebben gevonden dat wanneer cellen worden behandeld als beschreven (die het aantal celpassages twee en de culturen dan 1 x 10 7 / ml), glycosome remodeling reproduceerbaar. Indien cellen niet meer reageren op omgevingsomstandigheden, retransforming cellen met het reporter-construct plasmide meestal remedies situatie.

Hoewel dit systeem is gebruikt om glycosome gedrag in Afrikaanse trypanosomen bestuderen, kan ook de studie van organellen in andere parasieten aangenomen fuseren fluorescerende eiwitten tot aminozuur sequenties aminozuren die direct eiwit lokalisatie andere cellulaire compartimenten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenosine Avocado Research Chemicals Ltd A10781 SDM79 Ingredient
L-Alanine Avocado Research Chemicals Ltd A15804 SDM79 Ingredient
L-Arginine CalBiochem 1820 SDM79 Ingredient
p-Aminobenzoic acid ICN Biomedicals 102569 SDM79 Ingredient
Basal Medium Eagle Vitamin Solution (100x) Sigma B6891 SDM79 Ingredient
Biotin Fisher BP232-1 SDM79 Ingredient
Calcium chloride VWR BDH0224 Cytomix
EDTA Fisher S311-100 Cytomix ingredient
EZNA Gel Extraction kit Omega Biotek D2500-01 DNA purifiation
Research grade Serum Fisher 03-600-511 SDM79 Ingredient
Folic acid ICN Biomedicals 101725 SDM79 Ingredient
Glucosamine HCl ICN Biomedicals 194671 SDM79 Ingredient
Glucose GIBCO 15023-021 SDM79 Ingredient
L-Glutamine CalBiochem 3520 SDM79 Ingredient
Glycerol Acros Organics Ac15892-0010 Freezing media
Graces insect cell media powder GIBCO 11300-043 SDM79 Ingredient
Hemin MP Biomedicals 194025 SDM79 Ingredient
Guanosine Avocado Research Chemicals Ltd A11328 SDM79 Ingredient
HEPES MP Biomedicals 194025 SDM79 Ingredient
Magnesium chloride Fisher BP214-500 Cytomix ingredient
L-Methionine Fisher BP388-100 SDM79 Ingredient
MEM Amino Acids (50x) Cellgro 25-030-CI SDM79 Ingredient
NEAA Mixture (100x) Lonza 13-114E SDM79 Ingredient
Minimal Essential Medium (1x) with L-glutamine Cellgro 10-010-CM SDM79 Ingredient
MOPS Fisher BP308-500 SDM79 Ingredient
Sodium biocarbonate Fisher S233-500 SDM79 Ingredient
Penicillin-streptomycin Solution Cellgro 30-002-CI SDM79 Ingredient
L-Phenylalanine ICN Biomedicals 102623 SDM79 Ingredient
Potassium chloride Fisher P217-500 Cytomix ingredient
Potassium phosphate dibasic anhydrous Fisheer P290-212 Cytomix ingredient
L-Proline Fisher BP392-100 SDM79 Ingredient
L-Serine Acros Organics 56-45-1 SDM79 Ingredient
Pyruvic acid, sodium salt Acros Organics 113-24-6 SDM79 Ingredient
L-Taurine TCI America A0295 SDM79 Ingredient
L-Threonine Acros Organics 72-19-5 SDM79 Ingredient
L-Tyrosine ICN Biomedicals 103183 SDM79 Ingredient
E.Z.N.A. Cycle Pure kit Omega Biotek D6492-02 DNA purification
Binding buffer Omega Biotek PDR041 DNA purification
SPW wash buffer Omega Biotek PDR045 DNA purification
Gene Pulser Xcell Biorad 165-2660 Trypanosome transformation
4 mm Electroporation cuvettes VWR Trypanosome transformation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stuart, K., et al. Kinetoplastids: related protozoan pathogens, different diseases. J Clin Invest. 118, 1301-1310 (2008).
  2. Herman, M., Perez-Morga, D., Schtickzelle, N., Michels, P. A. Turnover of glycosomes during life-cycle differentiation of Trypanosoma brucei. Autophagy. 4, 294-308 (2008).
  3. Herman, M., Gillies, S., Michels, P. A., Rigden, D. J. Autophagy and related processes in trypanosomatids: insights from genomic and bioinformatic analyses. Autophagy. 2, 107-118 (2006).
  4. Michels, P. A., Bringaud, F., Herman, M., Hannaert, V. Metabolic functions of glycosomes in trypanosomatids. Biochim Biophys Acta. 1763, 1463-1477 (2006).
  5. Michels, P. A., et al. Peroxisomes, glyoxysomes and glycosomes (review). Mol Membr Biol. 22, 133-145 (2005).
  6. Moyersoen, J., Choe, J., Fan, E., Hol, W. G., Michels, P. A. Biogenesis of peroxisomes and glycosomes: trypanosomatid glycosome assembly is a promising new drug target. FEMS Microbiol Rev. 28, 603-643 (2004).
  7. Parsons, M., Furuya, T., Pal, S., Kessler, P. Biogenesis and function of peroxisomes and glycosomes. Molecular and biochemical parasitology. 115, 19-28 (2001).
  8. Parsons, M. Glycosomes: parasites and the divergence of peroxisomal purpose. Mol Microbiol. 53, 717-724 (2004).
  9. Michels, P. A., Hannaert, V., Bringaud, F. Metabolic aspects of glycosomes in trypanosomatidae - new data and views. Parasitol Today. 16, 482-489 (2000).
  10. Michels, P. A., Hannaert, V. The evolution of kinetoplastid glycosomes. J Bioenerg Biomembr. 26, 213-219 (1994).
  11. Hannaert, V., Michels, P. A. Structure function, and biogenesis of glycosomes in kinetoplastida. J Bioenerg Biomembr. 26, 205-212 (1994).
  12. Bauer, S., Morris, J. C., Morris, M. T. Environmentally regulated glycosome protein composition in the african trypanosome. Eukaryot Cell. 12, 1072-1079 (2013).
  13. Colasante, C., Ellis, M., Ruppert, T., Voncken, F. Comparative proteomics of glycosomes from bloodstream form and procyclic culture form Trypanosoma brucei brucei. Proteomics. 6, 3275-3293 (2006).
  14. Opperdoes, F. R. Compartmentation of carbohydrate metabolism in trypanosomes. Annu Rev Microbiol. 41, 127-151 (1987).
  15. Kessler, P. S., Parsons, M. Probing the role of compartmentation of glycolysis in procyclic form Trypanosoma brucei: RNA interference studies of PEX14, hexokinase, and phosphofructokinase. The Journal of biological chemistry. 280, 9030-9036 (2005).
  16. Bringaud, F., Riviere, L., Coustou, V. Energy metabolism of trypanosomatids: adaptation to available carbon sources. Molecular and biochemical parasitology. 149, 1-9 (2006).
  17. Coustou, V., et al. Glucose-induced remodeling of intermediary and energy metabolism in procyclic Trypanosoma brucei. The Journal of biological chemistry. 283, 16342-16354 (2008).
  18. Lamour, N., et al. Proline metabolism in procyclic Trypanosoma brucei is down-regulated in the presence of glucose. The Journal of biological chemistry. 280, 11902-11910 (2005).
  19. Vertommen, D., et al. Differential expression of glycosomal and mitochondrial proteins in the two major life-cycle stages of Trypanosoma brucei. Molecular and biochemical parasitology. 158, 189-201 (2008).
  20. Vickerman, K. Developmental cycles and biology of pathogenic trypanosomes. British medical bulletin. 41, 105-114 (1985).
  21. Lorenz, P., Maier, A. G., Baumgart, E., Erdmann, R., Clayton, C. Elongation and clustering of glycosomes in Trypanosoma brucei overexpressing the glycosomal Pex11p. The EMBO journal. 17, 3542-3555 (1998).
  22. Saveria, T., et al. Conservation of PEX19-binding motifs required for protein targeting to mammalian peroxisomal and trypanosome glycosomal membranes. Eukaryot Cell. 6, 1439-1449 (2007).
  23. Banerjee, S. K., Kessler, P. S., Saveria, T., Parsons, M. Identification of trypanosomatid PEX19: functional characterization reveals impact on cell growth and glycosome size and number. Molecular and biochemical parasitology. 142, 47-55 (2005).
  24. Milagros Camara Mde, L., Bouvier, L. A., Miranda, M. R., Pereira, C. A. Identification and validation of Trypanosoma cruzi's glycosomal adenylate kinase containing a peroxisomal targeting signal. Experimental parasitology. 130, 408-411 (2012).
  25. Wiemer, E. A., Wenzel, T., Deerinck, T. J., Ellisman, M. H., Subramani, S. Visualization of the peroxisomal compartment in living mammalian cells: dynamic behavior and association with microtubules. The Journal of cell biology. 136, 71-80 (1997).
  26. Kim, P. K., Mullen, R. T., Schumann, U., Lippincott-Schwartz, J. The origin and maintenance of mammalian peroxisomes involves a de novo PEX16-dependent pathway from the ER. The Journal of cell biology. 173, 521-532 (2006).
  27. Hoepfner, D., Schildknegt, D., Braakman, I., Philippsen, P., Tabak, H. F. Contribution of the endoplasmic reticulum to peroxisome formation. Cell. 122, 85-95 (2005).
  28. Furuya, T., et al. Glucose is toxic to glycosome-deficient trypanosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14177-14182 (2002).
Met behulp van fluorescerende eiwitten naar Monitor Glycosome Dynamiek in de Afrikaanse Trypanosoom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bauer, S., Conlon, M., Morris, M. Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome. J. Vis. Exp. (90), e51647, doi:10.3791/51647 (2014).More

Bauer, S., Conlon, M., Morris, M. Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome. J. Vis. Exp. (90), e51647, doi:10.3791/51647 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter