Abstract
Trypanosoma brucei ist ein Parasit, der Kinetoplastiden afrikanische Trypanosomiasis (HAT) oder Schlafkrankheit, und eine Wasting Disease, nagana verursacht, bei Rindern 1. Der Parasit wechselt zwischen den Blutstrom des Säugerwirt und die Tsetse-Fliege Vektor. Die Zusammensetzung vieler zellulärer Organellen sich in Reaktion auf diese verschiedenen extrazellulären Bedingungen 2-5.
Glykosomen sind hochspezialisierte Peroxisomen in denen viele der Enzyme der Glykolyse beteiligt Abteile sind. Glycosome Zusammensetzung Änderungen in einer Entwicklungs-und umwelt geregelt 4-11. Gegenwärtig sind die am häufigsten verwendeten Techniken zum glycosome Dynamikstudie Elektronen und Fluoreszenzmikroskopie; Techniken, die teuer, zeit und arbeitsaufwendig und nicht leicht angepasst, um mit hohem Durchsatz untersucht werden.
Um diese Einschränkungen zu, ein fluoreszierendes Reportersystem-glycosome in überwindendie gelb fluoreszierendes Protein (eYFP) verstärkt wird, um eine Peroxisomen-Zielsequenz (PTS2), die das Fusionsprotein an Glykosomen 12 leitet fusioniert, wurde hergestellt. Beim Importieren der PTS2eYFP Fusionsprotein, Glykosomen geworden fluoreszierend. Organell Abbau und Recycling zu einem Verlust der Fluoreszenz, die durch Durchflusszytometrie gemessen werden kann. Eine große Zahl von Zellen (5000 Zellen / sec) in Echtzeit ohne umfangreiche Probenpräparation, wie die Fixierung und Befestigung analysiert werden. Dieses Verfahren bietet einen schnellen Weg, Veränderungen in Organellen Zusammensetzung in Abhängigkeit von schwankenden Umgebungsbedingungen.
Introduction
Trypanosoma brucei führt die afrikanische Schlafkrankheit bei Menschen und ein Wasting Disease, nagana, bei Rindern. Medikamente in der Behandlung dieser Krankheiten verwendet werden, sind veraltet und extrem giftig, Impfstoffe nicht verfügbar sind, und das Potenzial für die Entwicklung von Resistenzen die Suche nach neuer Zielmoleküle 1 erfordert.
Während seines gesamten Lebenszyklus, T. brucei, wechselt zwischen einem Insektenvektor und Säugerwirt; zwei Hosts, die sehr unterschiedlichen Umgebungen, in denen der Parasit muss überleben zu präsentieren. Eine Anzahl von metabolischen und morphologischen Veränderungen auftreten, wie der Parasit an verschiedene Umweltbedingungen ausgesetzt. Einige der dramatischsten Veränderungen sind in Single-Membran-Parasiten begrenzt spezifischen Mikrokörper beobachtet, genannt Glykosomen 13.
Zuckerspiegel relativ hoch sind (~ 5 mm) in den Blutkreislauf und Blutkreislauf Parasiten (BSF) erzeugen ATP ausschließlich über Glykolyse while mitochondrialen Stoffwechsels unterdrückt wird 14. Im Gegensatz zu anderen Eukaryoten, in der Glykolyse im Zytoplasma, T. auftritt brucei compartmentalizes meisten der glykolytischen Enzyme in Glykosomen 14,15. Die Parasiten werden von der Tsetse-Fliege während einer Blutmahlzeit aufgenommen und erleben Sie einen Tropfen in Glukose, die die Nachweisgrenze innerhalb von 15 Minuten, von der Fliege aufgenommen fällt. Der Metabolismus von Insekten ist procyclischen Form (PCF) Parasiten flexibler und Glucose, sowie Aminosäuren, wie Prolin, kann bei der Synthese von ATP 16-18 verwendet werden. Vergleichsproteomische Studien zeigen, Lebenszyklus abhängigen Veränderungen glycosomalen und mitochondrialer Proteine mit glykolytischen Proteine in Blutkreislauf erhöht und Parasiten mitochondrialen Proteine im TCA-Zyklus und Atmungskette 13,19 beteiligt. Viele Studien haben sich auf die Unterschiede zwischen BSF und PCF Glykosomen konzentriert, ist wenig über die Veränderungen in PCF Glykosomen, die in Antwort auf env kommen bekannteironmental Veränderungen.
Im Enddarm der Fliege, Zuckerwerte sind während einer Fütterung mit 20 niedrig vorübergehenden Anstieg. In den meisten in-vitro-Studien werden PCF Parasiten in Medien Glukose gezüchtet. Allerdings haben jüngste Studien gezeigt, dass PCF Stoffwechsel verändert sich signifikant in Reaktion auf Verfügbarkeit 17 Glucose. In Abwesenheit von Glucose, Prolin und Prolin-Aufnahme-Dehydrogenase-Aktivität um 18. Diese Änderung in der mitochondrialen Stoffwechsel wird wahrscheinlich durch eine Änderung der Zusammensetzung und Morphologie glycosome begleitet, hat sich dies jedoch nicht direkt beurteilt.
Elektron und Fluoreszenzmikroskopie sind gängige Techniken verwendet werden, um glycosome Dynamik in T. studieren brucei 2,21-24. Diese Protokolle sind Zeit und arbeitsintensiv, teuer und schwierig, um Echtzeit-Studien und Hochdurchsatz-Protokolle anzupassen. Um diese Einschränkung zu überwinden, eine Leuchtstoff-Organellen-Reportersystem uSED Organellen in Säugern und Hefen Systemen Studie zur Verwendung in T. modifiziert worden ist brucei 12.
Fluoreszierenden Organellen Reportersysteme sind ausführlich in höheren Eukaryoten, wie Hefe, Pflanzen und Säugerzellen 25-27 verwendet. In solchen Systemen wird ein fluoreszierendes Protein mit einer Aminosäuresequenz, die das Protein zu spezifischen Organellen richtet fusioniert. Der Abbau oder die Synthese der Zielproteine wird durch Fluoreszenz gemessen und Veränderungen in der Organelle Zusammensetzung werden durch Änderungen in der Fluoreszenzzelle reflektiert.
Wenn der offene Leserahmen von verbesserten gelb fluoreszierende Protein (eYFP) zu einer Typ-II-peroxisomale Targeting-Sequenz (PTS2) 12 verschmolzen ist, wird die PTS2eYFP Protein zu reifen, Import-und Fluoreszenz zuständigen Glykosomen importiert über Durchflusszytometrie überwacht werden. Variationen in glycosome Zusammensetzung werden durch Veränderungen der zellulären Fluoreszenz wider. Dieses System kann in Resol helfenVing die Mechanismen, die umweltbedingte Veränderungen in glycosome Zusammensetzung regulieren.
Diese Handschrift beschreibt die Erzeugung eines glycosome Reportersystem in PCF Parasiten in Verbindung mit Durchflusszytometrie, um Echtzeit glycosome Dynamik in lebenden Parasiten zu überwachen und stellt ein Beispiel, wie es verwendet wurde, um Änderungen in glycosome Zusammensetzung in Abhängigkeit von verschiedenen Umgebungen zu folgen. Zusammenfassend wird glycosome Zusammensetzung durch extrazelluläre Glukosekonzentrationen und der Durchgang von Log-Phase Kulturen beeinflusst in frischem Medium löst Veränderungen im glycosome Zusammensetzung. Das System kann modifiziert werden, um das dynamische Verhalten des anderen Organellen in Trypanosomen und andere Parasiten untersuchen.
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Protocol
1. Allgemeine Trypanosom Haltung
- Wiegen Feststoffe zur Herstellung SDM79 Medien (Tabelle 1).
- Lagerung bei 4 ° C in 50 ml konischen oder einem Plastikbeutel. HINWEIS: Die Reagenzien sind für mindestens 6 Monate stabil.
- Auftau fötalem Rinderserum (FBS) in einem 37 ° C Wasserbad und periodisch mischen durch Umkehrung. HINWEIS: FBS wird vom Lieferanten als sterile Lösung erhalten. Filtersterilisieren FBS verringert seine Fähigkeit, das Wachstum des Parasiten zu unterstützen.
- Sobald die gesamte Flasche aufgetaut, Hitze inaktiviert Serum für 30 min in einem 56 ° C Wasserbad, periodisch Mischen, um eine Ausfällung von Serumkomponenten zu minimieren.
- Tauwetter Penicillin / Streptomycin-Lösung (Pen / Strep), Hämin (2 mg / ml in 50 mM NaOH) und Grundmedium Adler Vitamin-Lösung bei Raumtemperatur.
- Um einen 1.000 ml-Messzylinder, fügen 20,2 g SDM79 Feststoffe (Tabelle 1) mit den flüssigen Komponenten (Tabelle 2) und gut mischen auf einer Rührplatte.
- PH-Wert auf 7,35 und das Volumen auf 850 ml mit Wasser.
- Filter sterilisieren Medien, indem ein Vakuumschlauch an der Unterseite des Filterflasche. Ziehe Vakuum bis die Lösung filtriert.
- Filter entfernen oben in der biologischen Sicherheitsschrank und fügen Sie 150 ml hitzeinaktiviertem FBS. Kunststoffabdeckung entfernen aus sterilen Kappe und Dichtung Medien Flasche.
- Vorbereitung SDM80 Medien in der gleichen Weise wie SDM79 mit folgenden Ausnahmen; nicht Glucose oder Glucosamin hinzufügen und MEM ohne Glutamin. Anstelle von 150 ml hitzeinaktiviertem FBS, fügen Sie 135 ml dialysiert, Hitze inaktiviert FBS und 15 ml hitzeinaktiviertem FBS.
- Kultur PCF Parasiten in 25 cm 2-Kolben mit 10 ml geeigneten Medium bei 27 ° C und 5% CO 2. Hinweis: Zellen sollten täglich mit einer Zählkammer und mit einem Durchflusszytometer gezählt werden (siehe Abschnitt 6) und Kulturen sind bei Dichten zwischen 1 x 10 5 und 5 x 10 6 Zellen / ml gehalten werden.
2. Transfection von PCF Parasiten mit dem fluoreszierenden Reporterkonstrukt
HINWEIS: Um glycosome Dynamik zu folgen, ein Reporterprotein, das die peroxisomale Targeting-Sequenz (PTS2) von Aldolase zu mehr gelb fluoreszierenden Protein fusioniert ist in den Parasiten ausgedrückt. Die Sequenz für das Fusionsprotein kodiert, in pXS2bla 12, die den procyclin Promotor und die Tubulin intergenen Regionen, die direkt homologe Rekombination in das Genom und die Blasticin Resistenzgen zur Selektion enthält, kloniert. Prozyklischen Zelllinien, die Gene beherbergen, die T7-Polymerase und Tetracyclin-Repressor (PF29-13) kodieren, sind mit dem Targeting-Konstrukt, pXS2 verwandelt: PTS2eYFP.
- Bereiten cytomix durch Mischen der in Tabelle 3 aufgeführten Komponenten. Filter sterilisieren und lagern bei RT.
- Linearisieren von Plasmid-DNA mit MluI durch Pipettieren von 10 ul DNA (1 ug / ul), 5 ul Restriktionsenzym-Puffer, 33 ul Wasser und 2 μL MluI Enzyms in einem Mikrozentrifugenröhrchen. Bei 37 ° C für 1 Stunde.
- Reinige den Restriktionsverdau durch Zugabe von 1 Volumen von Bindungspuffer zu dem Restriktionsenzym-Verdau. Mischen Bindungspuffer und verdauten DNA durch Verwirbelung. Kurz zentrifugieren, um die Probe am Boden des Röhrchens zu sammeln.
- Legen Sie eine DNA-bindende Säule in ein 2 ml-Sammelröhrchen, und Übertragung verdaute DNA / Bindungspufferlösung Spalte.
- Zentrifuge für 10.000 g für 1 min. Nach der Zentrifugation verworfen Filtrat von Sammelröhrchen und gibt die Spalte an die Sammelröhrchen.
- Fügen Sie 700 ul Waschpuffer SPW und Zentrifuge bei 10.000 g für 1 min.
- Verwerfen Filtrat von Sammelröhrchen, kehren die Spalte an die Sammelröhrchen und wiederholen SPW Waschschritt und Zentrifugieren.
- Verwerfen Filtrat, Rück Spalte Sammelröhrchen und Zentrifuge leere Spalte für 3 min bei 10.000 × g Rest Ethanol zu entfernen.
- In einer biologischen Sicherheitsschrank, wegwerfen colwahl Rohr und Ort Spalte in einem sterilen Reaktionsgefäß.
- Zur Elution der DNA, fügen Sie 25 ul sterilem Wasser auf Spalte und bei Raumtemperatur für 2 min. Zentrifugieren bei 10000 × g für 1 min.
- Fügen Sie weitere 25 ul sterilem Wasser in biologischen Sicherheit Haube Spalte und bei Raumtemperatur für 2 min.
- Zentrifugieren bei 10.000 × g für 1 min.
- In einer biologischen Sicherheitsschrank übertragen gesamte Volumen der DNA auf eine neue sterile Mikrozentrifugenröhrchen. Hinweis: Dieser Schritt verhindert die Kontamination von der offenen Deckel während der Zentrifugation.
- Hinzufügen des sterilen, gereinigt linearisierte DNA (10 ug) in 400 ul sterilfiltriert cytomix.
- Zählen von Zellen, wie in Abschnitt 6 durch Zentrifugation bei 800 g für 15 min bei RT beschrieben und ernten 5 x10 7 -10 8 Zellen.
- Überstand abgießen und Zellpellet in 450 ul DNA + cytomix mit einer 1 ml serologische Pipette.
- Transfer-Lösung enthält ce lls, DNA und cytomix in ein steriles Abstand von 4 mm Küvette und Ort in der Küvette Elektroporationskammer.
- Wählen Sie "exponentiellen Abfall" und geben Sie manuell die folgenden Einstellungen: Spannung: 1,5 kV, Kapazität: 25 mF, Widerstand: Ω und Küvette: 4 mm. Drücken Puls. Sobald der Impuls beendet ist, entfernen Küvette aus dem Elektroporationskammer und zum Biosicherheitswerkbank.
- In eine neue sterile Flasche, Pipette 10 ml SDM79. Übertragen der transformierten Zellen in den Kolben mit 10 ml SDM79.
- Inkubieren ohne Arzneimittel Selektion für 24 h bei 27 ° C, 5% CO 2. Nach 24 Stunden hinzu G418 (15 ug / ml), Hygromycin (50 ug / ml) und Blasticidin (10 ug / ml). Pass 1 ml transformierten Zellen mit Drogen in 9 ml SDM79 mit Drogen.
- Analysieren Sie die Zellen täglich, wie in Abschnitt 6 und 7. Wenn Zellen fluoreszierende sind beschrieben und haben eine Zelldichte von 1 x 10 7 / ml erreicht, stellen stabilates für die Langzeitspeicherung (3.1-3.3).
- Um das Einfrieren Medien, ein gleiches Volumen von 100% Glycerin zu cytomix und Filter sterilisieren.
- Geben Sie 200 ul des Einfrierens Medien bis 800 ul von Zellen (1 x 10 7) in einem Kryoröhrchen, vorsichtig mischen und Inversion zwischen zwei Styropor-Racks und frieren bei -80 ° C.
- Einmal gefroren (~ 24 h), Transfer Zellen in flüssigen Stickstoff. HINWEIS: Es ist wichtig, Zellen in LN 2 nach 24 h bei -80 bewegen, wie eine längere Lagerung ° C führt zu einer Abnahme der Lebensfähigkeit der Zellen.
4. Auftauen Aktien
- Entfernen gefrorenen Ampulle von -80 ° C und Auftauen bei Raumtemperatur für etwa 10 min.
- Pipette 9 ml SDM79 mit Drogen in eine neue sterile Flasche. Fügen Sie aufgetauten Zellen zu diesen Kolben. Geben Zellen 1:10 Zugabe von 1 ml dieser Kultur in 9 ml SDM79 in einen neuen Kolben (Endkonzentration von 1 x 10 5 / ml).
- Bevor die Zellen eine Dichte von 10 7 / ml erreichen, beginnen Durchflusszytometer eingestelltund Verdünnungsanalysen.
5. Durchflusszytometer-Setup
- Schalten Sie das Durchflusszytometer und CFlow Plus-Programm zu öffnen. HINWEIS: Bevor Sie irgendwelche Proben sollten die Fluidik gemäß den Schritten 5,2-5,7 rückgespült und ausgespült werden.
- Ersetzen Sie den Schlauch von Nanopure Wasser, in dem die SIP ist mit einem Leerrohr gespeichert.
- Wählen Sie die "Rückspülung"-Taste.
- Nach Rückspülung abgeschlossen ist, entfernen Mikrozentrifugenröhrchen von Schluck und entsorgen.
- Legen Sie eine neue Mikrozentrifugenröhrchen mit 1 ml neuen nanoreinem Wasser auf dem Schluck.
- Wählen Sie einen neuen Brunnen in CFlow Programm. Unter "Ausführen Limits" eingestellte Zeit für 2 min. Unter "Fluidtechnik" wählen Sie "schnell" und "Ausführen".
- Sobald die 2 min Frist abgeschlossen ist, klicken Sie auf die Schaltfläche "Löschen Beispieldaten".
6. Zellzählung mit dem Durchflusszytometer
- Wasser zu ersetzen mit der Probe, die gezählt werden. Set "Führen Limits "bis 30 Sekunden", Fluidik "auf" schnell "und wählen Sie dann" Ausführen ".
- Nach Ablauf der 30 Sekunden Frist abgeschlossen ist, CFlow Plus wird die Ereignisse / ul unter "Last Run". Zahl für jede Kultur Wiederholen bieten. HINWEIS: Bevor Zellen erreichen 1 x 10 7 Zellen / ml, fahren Sie mit Verdünnungsanalyse. Zellen sollten nicht fort nach einer Verdünnungsanalyse abgeschlossen ist. Zellen für längere Zeiträume kultiviert verlieren ihre Fähigkeit, sich an Umweltbedingungen zu reagieren.
7. Messung der Fluoreszenz mit dem Durchflusszytometer
- , Um die Fluoreszenz zu beurteilen, setzen Sie "Run Limits" zu 10.000 Ereignisse und "Fluidtechnik" auf "langsam". Wählen Sie "Schwelle". Unter "Primary Threshold", wählen Sie "dauerhaft zu beseitigen Veranstaltungen", "FSC-H" (in Drop-Down-Box) und geben Sie weniger als 30.000. Klicken Sie auf "Übernehmen" und dann auf "Schließen".
- Wählen Sie die220; Histogramm "-Taste in einem der neuen Plot-Fenster und wählen Sie" FSC-A "aus der Dropdown-Liste, wählen Sie" FL1-A ". HINWEIS: FL1-A Maßnahmen Fluoreszenz in der 530 nm Wellenlänge.
- Wählen Sie "Ausführen" und wiederholen Sie für alle Kulturen.
- Führen Sie die Reinigungslösung durch die Fluidik Linie für 2 Minuten und Wasser für 2 min.
8. Verdünnungsanalysen
- Geben Zellen auf eine Dichte von 1 x 10 5 Zellen / ml in 3 ml SDM79 in einer 25 cm 2 Kulturflasche und Messen Fluoreszenz unmittelbar nach Durchgang und dann 3 Stunden und 24 Stunden.
9. Datenanalyse
- Wählen Sie "Analysieren" Vorsprung auf CFlow Plus an.
- Klicken Sie wird "Histogramm" unter "Machen Sie eine neue Handlung." Wählen einer Dropdown-Liste "FSC-A" und erscheinen. Wählen Sie den Kanal "FL1-A."
- Markieren Sie eine gut zu analysieren. Wählen Sie "Gate"-Taste und manuell zeichnen eine Gate-für die Bevölkerung von Interesse.
- Flow Plus liefert Zelle "Count" in diesem Tor und "% dieser Plot".
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Representative Results
In diesem System wurde eine glucoseabhängige Änderung glycosome Zusammensetzung beobachtet. Wenn Zellen in Glucose enthaltenden Medien gezüchtet werden zwei Populationen beobachtet; eine helle und eine dim (Abbildung 2a). Dim Zellen beherbergen unreifen Glykosomen, die nicht importiert haben die PTS2eYFP während helle Zellen beherbergen eine Mischung aus reifen und unreifen Glykosomen 12. Wenn Glukose in den Medien vorhanden ist, ist Fehllokalisation von Proteinen tödliche glycosome 15,28 und glycosome Proteinexpression wahrscheinlich eng mit Import gekoppelt. Diese enge Regelung ist für das Auftreten von schwachen Zellen, bei denen glycosome Protein-Expression unterdrückt, wenn die Zellen keine ausreichende Importfunktion verantwortlich. Sobald die glycosome Importmaschinerie wird komplett montiert und funktionsfähig, exprimieren die Zellen glycosome Proteine, die dann in Glykosomen importiert werden, was fluoreszierenden Zellen. In Glukose-Abbau Medien, ist die Fehllokalisation von Proteinen glycosome tolerierenD 15, und die bimodale Verteilung der Bevölkerung durch einen einzigen Peak mit einem breiteren Bereich von Fluoreszenz (2B) ersetzt.
Dieses System wurde verwendet, um Bedingungen, die Änderungen in der Zusammensetzung auszulösen glycosome identifizieren. Wenn hohe Dichte Kulturen mit ~ 10% dim Zellen (3A) in frisches Medium übergeben, gibt es eine vorübergehende Erhöhung des Anteils der dim Zellen (3B). Um 24 h. die ursprüngliche Verteilung der Bevölkerung wieder hergestellt (Abbildung 3C).
| SDM79 Solids | Gewicht (g / l) |
| Ziert Insektenzellmedium Pulver | 2 |
| Glucose | 1 |
| HEPES | 8 |
| MOPS | 5 |
| NaHCO 3 | 2 |
| Natriumpyruvat | 0,1 |
| L-Alanin | 0,2 |
| L-Arginin | 0,1 |
| L-Glutamin | 0,3 |
| L-Methonine | 0,07 |
| L-Phenylalanin | 0,08 |
| L-Prolin | 0,6 |
| L-Serin | 0,06 |
| L-Taurin | 0,16 |
| L-Threonin | 0,35 |
| L-Tyrosin | 0,1 |
| Adenosin | 0,01 |
| Guanosin | 0,01 |
| Glucosamin HCl | 0,05 |
| Folsäure | 0,004 |
| r-Aminobenzoesäure | 0,002 |
| Biotin 0,0002 |
Tabelle 1. SDM79 festen Komponenten. Feste Medien Komponenten und Menge (g / l) vorgesehen sind.
| SDM79 | |
| MEM mit Glutamin | 600 ml |
| Pen / Strep | 10 ml |
| BME Vitaminlösung | 10 ml |
| MEM Aminosäuren Lösung | 8 ml |
| MEM nicht essentielle Aminosäure-Lösung | 6 ml |
| Hämin | 3,75 |
| Wasser | 162.25 ml |
Tabelle 2. SDM79 flüssigen Komponenten. Volumes ml angegeben.
| Für 20 ml | |
| 120 mM KCl | 1,4 ml (1 M) |
| 0,15 mM CaCl 2 | 3 ml (1 M) |
| 10 mM K 2 HPO 4 | 400 ml (0,5 M) |
| 25 mM HEPES | 500 ml (1 M) |
| 2 mM EDTA | 80 ml (0,5 M) |
| 5 mM MgCl 2 | 100 ml (1 M) |
| Wasser | 16.52 |
Tabelle 3. Cytomix Rezept.
Abbildung 1. Fluoreszierende glycosome Reportersystem. A) PTS2eYFP Expressionskonstrukt Integration. PCF Trypanosomen wurden mit dem pX umgewandeltS2PTS2eYFP Plasmid mit dem Restriktionsenzym MluI linearisiert. Dieses Konstrukt integriert durch homologe Rekombination in das Tubulin-Locus (Wanne) und PARP-Sequenzen (PARP) den Promotor, der die konstitutive Expression PTS2eYFP und die für die RNA-Prozessierung. B erforderlichen Sequenzen) PTS2eYFP Einfuhr antreibt. PTS2eYFP im Cytoplasma, wo es die lösliche Rezeptor PEX7, die das Reporter-Protein den Glykosomen liefert bindet synthetisiert. Einmal mit dem glycosome Membran geliefert wird das Protein eingeführt werden. Ältere Organellen mit Importmaschinen Import PTS2eYFP und Fluoreszenz während diejenigen, die funktionelle Importmaschinerie nicht enthalten dim bleiben.
Abbildung 2. Glucose-abhängige glycosome Zusammensetzung. PCF-Zellen wurden in SDM79 (+ GLC) oder SDM80 (-Glc) gewachsen undmittels Durchflusszytometrie analysiert. Histogramme von 10.000 Ereignisse. A) Analyse der Zellen in SDM79 gewachsen konsequent zeigt zwei Peaks. Fluoreszierenden Zellen beherbergen eine Mischung aus reifen und unreifen Organellen mit Zellen höherer Fluoreszenzintensitäten mit reifer Glykosomen. In SDM79 ist Fehllokalisation von Proteinen glycosome tödlich und glycosome Proteinexpression und Import muss streng kontrolliert werden. Dies wird in Abwesenheit von Zellen, die mit Zwischenfluoreszenzintensitäten. B) In SDM80 reflektiert wird, wird die Fehllokalisation von glycosome Proteinen toleriert, die bimodale Verteilung der Bevölkerung geht verloren, und die Zellen des mittleren Fluoreszenz beobachtet werden.
Abbildung 3. Glycosome Umbau. Remodeling der Glykosomen wird durch Durchgang in frische Medien ausgelöst.
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Discussion
Glykosomen sind unerlässlich, dynamisch, Parasiten-spezifische Organellen. Die Prozesse, die die Biogenese, Wartung, Proliferation und Umbau dieser Organellen regulieren wahrscheinlich auch Wirkstoff-Targets, die für therapeutische Zwecke genutzt werden könnten. Trotz der möglichen hohen Fülle solcher Arzneimitteltargets wurde der Bereich der glycosome Biogenese hinter der Studie von ähnlichen Prozessen in anderen Organismen, hauptsächlich aufgrund des Fehlens eines handhabbaren, Hochdurchsatz-System, mit dem eine schnelle, dynamische Organell verzögerten Antworten überwacht, in lebenden Zellen.
Fluoreszierenden Organellen Reportersysteme verwendet worden, um Organelle Dynamik in höheren Eukaryoten, wie Hefe, Pflanzen, Pilzen und Säugern 23-25 untersuchen. Wir haben einen Stamm von transgenen Parasiten, die PCF PTS2eYFP auszudrücken, die gezielt auf Glykosomen reifen erzeugt, was fluoreszierenden Organellen. Änderungen in der Zusammensetzung glycosome kann über folgende zellulären Fluoreszenz überwacht werden. Mit diesem System haben wir herausgefunden, dass die Umweltbedingungen, insbesondere Glucose, zu regulieren glycosome Zusammensetzung 12.
Im Gegensatz zu Verfahren oft verwendet, um Organelle Dynamik in Kinetoplastiden studieren Mikroskopie, bietet das Reportersystem eine Methode, mit der schnellen Screening-Verbindungen und Bedingungen, die Gesamt glycosome Dynamik beeinflussen. Die Veränderungen in der Fluoreszenz spiegeln jedoch Änderungen in der Gesamtorganelle Kompositionen. Weitere biochemische und mikroskopische Experimente sind erforderlich, um die spezifische molekulare Unterschiede zwischen Zellpopulationen, die unterschiedliche Fluoreszenzintensitäten zu definieren.
Wir haben eine Reihe von kritischen Schritte in den Umbau-Tests identifiziert. Interessanterweise haben wir gefunden, dass die Zellen für längere Zeiträume (mehr als zwei Durchgänge) gezüchtet werden, ist ihr Verhalten gegenüber Umgebungsänderungen nicht vorhersehbar. Nach längerer Kultivierung von Zellen hohen Dichten übergeben an die frische medien, zeigen einen vorübergehenden Anstieg im schwachen Bevölkerung, die anzeigt, dass sie noch in der Lage, Glykosomen renovieren, aber nach 24 Stunden sterben. Wir haben auch festgestellt Situationen, in denen kein Umbau beobachtet. Der Grund für dieses Verhalten ist nicht klar, aber wir haben gefunden, dass, wenn die Zellen behandelt werden, wie hier beschrieben (Beschränkung der Anzahl der Zellpassagen, zwei Kulturen und Aufrechterhaltung von weniger als 1 x 10 7 / ml), ist glycosome Umbau reproduzierbar. Wenn die Zellen nicht mehr in Reaktion auf Umweltbedingungen, Retransformieren Zellen mit dem Reportergen-Konstrukt Plasmid Regel schafft Abhilfe.
Dieses System wurde verwendet, um glycosome Verhalten in afrikanischen Trypanosomen zu studieren, kann es auch auf die Untersuchung von Organellen in anderen Parasiten durch Verschmelzen fluoreszierende Proteine Aminosäuresequenzen, die direkte Proteinlokalisierung zu anderen Zellkompartimenten angenommen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine | Avocado Research Chemicals Ltd | A10781 | SDM79 Ingredient |
| L-Alanine | Avocado Research Chemicals Ltd | A15804 | SDM79 Ingredient |
| L-Arginine | CalBiochem | 1820 | SDM79 Ingredient |
| p-Aminobenzoic acid | ICN Biomedicals | 102569 | SDM79 Ingredient |
| Basal Medium Eagle Vitamin Solution (100x) | Sigma | B6891 | SDM79 Ingredient |
| Biotin | Fisher | BP232-1 | SDM79 Ingredient |
| Calcium chloride | VWR | BDH0224 | Cytomix |
| EDTA | Fisher | S311-100 | Cytomix ingredient |
| EZNA Gel Extraction kit | Omega Biotek | D2500-01 | DNA purifiation |
| Research grade Serum | Fisher | 03-600-511 | SDM79 Ingredient |
| Folic acid | ICN Biomedicals | 101725 | SDM79 Ingredient |
| Glucosamine HCl | ICN Biomedicals | 194671 | SDM79 Ingredient |
| Glucose | GIBCO | 15023-021 | SDM79 Ingredient |
| L-Glutamine | CalBiochem | 3520 | SDM79 Ingredient |
| Glycerol | Acros Organics | Ac15892-0010 | Freezing media |
| Graces insect cell media powder | GIBCO | 11300-043 | SDM79 Ingredient |
| Hemin | MP Biomedicals | 194025 | SDM79 Ingredient |
| Guanosine | Avocado Research Chemicals Ltd | A11328 | SDM79 Ingredient |
| HEPES | MP Biomedicals | 194025 | SDM79 Ingredient |
| Magnesium chloride | Fisher | BP214-500 | Cytomix ingredient |
| L-Methionine | Fisher | BP388-100 | SDM79 Ingredient |
| MEM Amino Acids (50x) | Cellgro | 25-030-CI | SDM79 Ingredient |
| NEAA Mixture (100x) | Lonza | 13-114E | SDM79 Ingredient |
| Minimal Essential Medium (1x) with L-glutamine | Cellgro | 10-010-CM | SDM79 Ingredient |
| MOPS | Fisher | BP308-500 | SDM79 Ingredient |
| Sodium biocarbonate | Fisher | S233-500 | SDM79 Ingredient |
| Penicillin-streptomycin Solution | Cellgro | 30-002-CI | SDM79 Ingredient |
| L-Phenylalanine | ICN Biomedicals | 102623 | SDM79 Ingredient |
| Potassium chloride | Fisher | P217-500 | Cytomix ingredient |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous | Fisheer | P290-212 | Cytomix ingredient |
| L-Proline | Fisher | BP392-100 | SDM79 Ingredient |
| L-Serine | Acros Organics | 56-45-1 | SDM79 Ingredient |
| Pyruvic acid, sodium salt | Acros Organics | 113-24-6 | SDM79 Ingredient |
| L-Taurine | TCI America | A0295 | SDM79 Ingredient |
| L-Threonine | Acros Organics | 72-19-5 | SDM79 Ingredient |
| L-Tyrosine | ICN Biomedicals | 103183 | SDM79 Ingredient |
| E.Z.N.A. Cycle Pure kit | Omega Biotek | D6492-02 | DNA purification |
| Binding buffer | Omega Biotek | PDR041 | DNA purification |
| SPW wash buffer | Omega Biotek | PDR045 | DNA purification |
| Gene Pulser Xcell | Biorad | 165-2660 | Trypanosome transformation |
| 4 mm Electroporation cuvettes | VWR | Trypanosome transformation |
References
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