Abstract
Trypanosoma brucei er en kinetoplastid parasitten som forårsaker menneskelig afrikansk trypanosomiasis (HAT), eller sovesyke, og en sløse sykdom, nagana, hos storfe en. Parasitten veksler mellom blodet av pattedyr verten og Tsetsefluer vektor. Sammensetningen av mange cellulære organeller endres i respons til disse forskjellige ekstracellulære betingelser 2-5.
Glycosomes er høyt spesialiserte peroxisomes hvor mange av enzymer involvert i glykolyse er compartmentalized. Glycosome sammensetning endres i en utviklingsmessig og miljømessig regulert måte 4-11. Foreløpig de vanligste teknikkene som brukes til å studere glycosome dynamikk er elektron og fluorescens mikroskopi; teknikker som er kostbare, tid og arbeidskrevende, og ikke enkelt tilpasses høy gjennomstrømning analyser.
For å overvinne disse begrensningene, et fluorescerende-glycosome reporter system isom forbedret gul fluoriserende protein (EYFP) er fusjonert til et peroxisome målretting sekvens (PTS2), som leder fusjonsproteinet til glycosomes 12, har blitt etablert. Ved import av PTS2eYFP fusion protein, glycosomes som lyser opp. Organelle nedbrytning og gjenvinning resulterer i tap av fluorescens som kan måles ved strømningscytometri. Et stort antall av celler (5000 celler / sek), kan bli analysert i sanntid uten omfattende prøvepreparering, så som fiksering og montering. Denne metoden gir en rask måte for å detektere endringer i organeller sammensetning i respons til varierende miljøforhold.
Introduction
Trypanosoma brucei forårsaker afrikansk sovesyke hos mennesker og en sløse sykdom, nagana, hos storfe. Legemidler som brukes i behandlingen av disse sykdommene er gammeldags og ekstremt giftig, vaksiner er ikke tilgjengelige, og potensialet for utvikling av resistens nødvendig jakten på nye stoffet mål en.
I løpet av sin livssyklus, T. brucei, veksler mellom et insekt vektor og pattedyr vert; to verter som presenterer svært ulike miljøer der parasitten må overleve. En rekke metabolske og morfologiske forandringer oppstå som parasitten utsettes for forskjellige miljøforhold. Noen av de mest dramatiske endringene er observert i enkeltmembran avgrenset parasitt spesifikke microbodies, betegnes glycosomes 13.
Blodsukkeret er relativt høy (~ 5 mm) i blodet og blodet parasitter (BSF) generere ATP utelukkende gjennom glykolyse while mitokondrie metabolisme er undertrykt 14. I motsetning til andre eukaryoter der oppstår glykolyse i cytoplasma, T. brucei compartmentalizes de fleste av de glykolytiske enzymer i glycosomes 14,15. Parasittene er tatt opp av Tsetsefluer under en blodmel og oppleve et fall i glukose, som faller til ikke målbare nivåer innenfor 15 min for å bli inntatt av fly. Metabolismen av insekt, procyclic form (PCF), parasitter er mer fleksibel og glukose, så vel som aminosyrer som for eksempel prolin, kan brukes i syntesen av ATP 16-18. Komparative proteomikk studier avslører livssyklusavhengige endringer i glycosomal og mitokondrielle proteiner med glycolytic proteiner økte i blodet parasitter og mitokondrielle proteiner involvert i TCA syklus og respirasjonskjede 13,19. Mens mange studier har fokusert på forskjellene mellom BSF og PCF glycosomes, er lite kjent om endringene i PCF glycosomes som oppstår i respons til environmental endringer.
I hindgut av flua, glukosenivået er lavt med forbigående økning i løpet av en fôring 20. I de fleste in vitro-studier, er PCF parasitter dyrket i media som inneholder glukose. Imidlertid har nyere studier vist at PCF metabolisme endringer betydelig i respons til glukose tilgjengelighet 17. I fravær av glukose, prolin opptaks og prolin dehydrogenase aktivitet økning 18. Denne endringen i mitokondrie metabolisme er sannsynligvis ledsaget av en endring i glycosome sammensetning og morfologi, men dette har ikke vært direkte vurdert.
Elektron og fluorescens mikroskopi er vanlige teknikker brukt til å studere glycosome dynamikk i T. brucei 2,21-24. Disse protokollene er tid og arbeidskrevende, dyrt og vanskelig å tilpasse til sanntids-studier og med høy gjennomstrømning protokoller. For å overvinne denne begrensningen, et fluorescerende-organelle reporter system used å studere organeller i pattedyr-og gjærsystemer har blitt modifisert for bruk i T. brucei 12.
Fluorescent-organelle reporter systemer har vært mye brukt i høyere eukaryoter som gjær, anlegg og pattedyrceller 25-27. I slike systemer, er en fluorescerende protein kondensert til en aminosyresekvens som er rettet mot proteinet til spesifikke organeller. Den nedbrytning eller syntese av de målrettede proteiner blir målt via fluorescens og endringer i organeller sammensetning blir reflektert av endringer i celle fluorescens.
Når den åpne leseramme for forbedret gul fluorescerende protein (EYFP) er kondensert til en type II peroksisomal målretting sekvens (PTS2) 12, blir PTS2eYFP protein importert til modne, import-kompetente glycosomes og fluorescens kan bli overvåket via strømningscytometri. Variasjoner i glycosome sammensetning reflekteres av endringer i mobilnettet fluorescens. Dette systemet kan hjelpe til resoltreråvare mekanismene som regulerer miljøinduserte endringer i glycosome komposisjon.
Dette manuskriptet beskriver generering av et glycosome reporter system i PCF parasitter i forbindelse med flowcytometri for å overvåke i sanntid glycosome dynamikk i levende parasitter og gir et eksempel på hvordan den har blitt brukt til å følge endringer i glycosome sammensetning i respons til ulike miljøer. Oppsummert er glycosome sammensetning påvirket av ekstracellulære glukosekonsentrasjoner og passering av log-fase kulturer i frisk media utløser endringer i glycosome komposisjon. Dette systemet kan bli endret for å studere den dynamiske oppførselen til andre organeller i trypanosomer og andre parasitter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generelt Trypanosom Husbandry
- Vei tørrstoff for SDM79 media forberedelse (tabell 1).
- Oppbevar ved 4 ° C i 50 ml konisk eller en Ziploc bag. MERK: reagenser er stabile i minst 6 måneder.
- Tin føtalt bovint serum (FBS) i et 37 ° C vannbad, og bland periodisk ved inversjon. MERK: FBS er mottatt fra leverandøren som steril løsning. Filter sterilisering FBS reduserer dens evne til å støtte vekst parasitt.
- Når hele flasken er tint, varme inaktivere serum i 30 minutter i et 56 ° C vannbad, blander med jevne mellomrom for å minimalisere utfelling av serumkomponenter.
- Tin penicillin / streptomycin-løsning (pen / strep), hemin (2 mg / ml i 50 mM NaOH), og basal medium Eagle vitamin-oppløsning ved romtemperatur.
- Til en 1000 ml målesylinder, legg 20.2 g SDM79 tørrstoff (tabell 1) til de flytende komponenter (tabell 2) og bland godt på en røre plate.
- Juster pH-verdien til 7,35, og bringe volumet til 850 ml med vann.
- Filtrer sterilisere mediet ved å feste en vakuumslange til bunnen av en filterflaske. Bruk vakuum inntil oppløsningen filtreres.
- Fjern filter topp i biosikkerhet kabinett og legge 150 ml varmeinaktivert FBS. Fjern plast dekker fra sterile cap og segl media flaske.
- Forbered SDM80 media på samme måte som SDM79 med følgende unntak; ikke legg til glukose eller glukosamin og bruke MEM uten glutamin. I stedet for 150 ml varmeinaktivert FBS, tilsett 135 ml dialysert, varme-inaktivert FBS, og 15 ml varmeinaktivert FBS.
- Kultur PCF parasitter i 25 cm 2-kolbe med 10 ml passende medium ved 27 ° C og 5% CO2. MERK: Cellene må telles daglig ved hjelp av et hemocytometer eller et strømningscytometer (se punkt 6), og kulturene opprettholdes i tettheter mellom 1 x 10 5 x 10 og 5 6 celler / ml.
2. Transfection av PCF Parasitter med fluorescerende reporter Construct
MERK: For å følge glycosome dynamikk, en reporter protein inneholder peroksisomal målretting sekvens (PTS2) av aldolase smeltet til forbedret gul fluoriserende protein er uttrykt i parasittene. Den sekvens som koder for fusjonsproteinet klones inn i pXS2bla 12, som inneholder procyclin promoter og tubulin intergenic regioner som dirigerer homolog rekombinasjon inn i genomet og den blasticidin-resistensgenet for seleksjon. Procyclic cellelinjer som inneholder gener som koder for T7 polymerase og tetracyklin repressor (PF29-13) er transformert med targeting konstruere, pXS2: PTS2eYFP.
- Forbered cytomix ved å blande komponentene er oppført i tabell 3. Filter sterilisere og oppbevar ved RT.
- Linearisere plasmid DNA med MluI ved å pipettere 10 pl DNA (1 pg / pl), 5 pl restriksjonsenzym-buffer, 33 pl vann, og 2 μ; L av MluI enzym i en mikrosentrifuge tube. Inkuber ved 37 ° C i 1 time.
- Rens det restriksjons fordøye ved å tilsette 1 volum av bindingsbuffer til restriksjonsenzymet digest. Bland binding buffer og fordøyd DNA ved virvling. Kort sentrifuger for å samle inn prøven i bunnen av røret.
- Sett i en DNA-bindende kolonne inn i en 2 ml samling rør, og overføring fordøyd DNA / bindingsbufferoppløsning til kolonnen.
- Sentrifuger i 10 000 xg i 1 min. Etter sentrifugering kasseres filtrat fra samlingen røret og tilbake på kolonnen til oppsamlingsrøret.
- Legg 700 mL av SPW vaskebuffer og sentrifuger ved 10.000 xg i 1 min.
- Forkast filtratet fra samlingen tube, returnere kolonnen til samling rør og gjenta SPW vasketrinn og sentrifugering.
- Kast filtratet, returkolonnen til samling rør, og sentrifuger tom kolonne i 3 min ved 10.000 xg for å fjerne gjenværende etanol.
- I en biosikkerhet skap, kaste bort collection tube kolonne og sted i et sterilt mikrosentrifugerør.
- For å eluere DNA, tilsett 25 pl sterilt vann til kolonnen og inkuberes ved romtemperatur i 2 min. Sentrifuger ved 10000 x g i 1 min.
- Legg til en annen 25 mikroliter sterilt vann i biosikkerhet hetten til kolonnen og inkuberes ved romtemperatur i 2 min.
- Sentrifuger ved 10.000 xg hastighet i 1 min.
- I en biosikkerhet kabinett overføre hele volumet av DNA i et nytt sterilt mikrosentrifugerør. MERK: Dette trinnet hindrer forurensning fra den åpne lokket under sentrifugering.
- Tilsett sterilt, renset, linearisert DNA (10 ug) til 400 mL av filter-sterilisert cytomix.
- Tell cellene som beskrevet i avsnitt 6, og høste 5 x10 7 -10 8-celler ved sentrifugering ved 800 xg i 15 min ved RT.
- Hell av supernatanten og cellepelleten suspenderes i 450 pl av DNA + cytomix anvendelse av en 1 ml serologisk pipette.
- Transfer løsning som inneholder ce LLS, DNA, og cytomix til en steril 4 mm gap kyvetten og kyvetten sted i electroporation kammeret.
- Velg "eksponentiell" og skriv inn følgende innstillinger manuelt: Spenning: 1,5 kV, Kapasitans: 25 mF, Resistance: Ω, og Cuvette: 4 mm. Trykk puls. Når pulsen er ferdig, fjernes fra kyvetten electroporation kammeret og tilbake til biosikkerhet kabinettet.
- I en ny steril kolbe, pipette 10 ml SDM79. Overfør de transformerte celler til kolben med 10 ml SDM79.
- Inkuber UTEN narkotika utvalg i 24 timer ved 27 ° C, 5% CO 2. Etter 24 timer, tilsett G418 (15 ug / ml), hygromycin (50 pg / ml), og blasticidin (10 ug / ml). Pass 1 ml av transformerte celler med medikament inn i 9 ml SDM79 med medikament.
- Analysere celler daglig som beskrevet i kapittel 6 og 7. Når cellene er fluorescerende, og har nådd en celletetthet på 1 x 10 7 / ml, gjør stabilates for langtidslagring (3,1-3,3).
- For å gjøre frysemediet, tilsett et likt volum av 100% glycerol for å cytomix og filtersteriliser.
- Tilsett 200 pl av frysemedier til 800 ul av celler (1 x 10 7) i en cryovial, bland forsiktig ved å vende og sted mellom to Styrofoam stativer og fryses ved -80 ° C.
- Når frosset (~ 24 timer), overføre cellene til flytende nitrogen. MERK: Det er viktig å flytte celler i LN 2 etter 24 timer, som lenger lagring ved -80 ° C fører til en nedgang i celle levedyktighet.
4. opptining av frosne Stocks
- Fjern frossen ampulle fra -80 ° C og tining ved RT i omtrent 10 min.
- Pipettes 9 ml SDM79 med stoffet inn i en ny steril kolbe. Legg tinte celler til denne flasken. Før cellene 01:10 ved tilsetning av 1 ml av denne kulturen til 9 ml SDM79 i en ny kolbe (sluttkonsentrasjon på 1 x 10 5 / ml).
- Før cellene når en tetthet på 10 7 / ml, begynner cytometer sattopp og utvannings analyser.
5. cytometeret Setup
- Slå på flowcytometeret og åpne CFLOW Plus-programmet. MERK: Før du kjører noen prøver, bør lufthåndtering bli tilbakespyles og skylles i henhold til trinn 05.02 til 05.07.
- Sett på røret av nanopure vann hvori sip er lagret med et tomt rør.
- Velg "spylings" knappen.
- Når tilbakespyling er fullført, fjerner mikro røret fra slurk og kast.
- Plasser en ny mikro rør som inneholder 1 ml av ny nanopure vann på slurk.
- Velg en ny brønn i CFLOW program. Under "Run Limits" set tid for 2 min. Under "lufthåndtering" velg "fast" og "Kjør".
- Når 2 min fristen er ferdig, klikker du på "slette data" knappen.
6. Celletelling bruker Flowcytometer
- Erstatte vann med prøven som skal telles. Sett "Kjør Limits "til 30 sek," lufthåndtering "til" fast "og velg" Kjør ".
- Etter 30 sek fristen er fullført, CFLOW pluss vil gi de hendelser / mL under «Last Run." Repeat antall for hver kultur. MERK: Før cellene nå en x 10 7 celler / ml, fortsette med fortynningsanalyse. Celler bør avbrytes etter en fortynning analysen er fullført. Celler dyrket i lengre perioder mister sin evne til å svare på miljøforhold.
7. Måle Fluorescence bruker Flowcytometer
- For å vurdere fluorescens, satt "Run Limits" til 10.000 hendelser, og "lufthåndtering" til "slow". Velg "Set terskel". Under "Primary Threshold", velg "permanent fjerne hendelser på", "FSC-H" (i drop down boksen) og skriver inn mindre enn 30.000. Klikk på "Apply", deretter "close".
- Velg220; Histogram "knappen i en av de nye tomten vinduer og velg" FSC-A "fra rullegardinlisten, velg" FL1-A ". MERK: FL1-A måler fluorescens i 530 nm bølgelengde.
- Velg "Kjør" og gjenta for alle kulturer.
- Løpe rengjøringsmiddel gjennom lufthåndtering linje i 2 min, og vann i 2 min.
8. Fortynningskrav Analyser
- Pass-celler til en tetthet på 1 x 10 5 celler / ml i 3 ml SDM79 i en 25 cm to kulturkolbe og måle Florescence umiddelbart etter passasjen og deretter ved 3 timer og 24 timer.
9. Data Analysis
- Velg "Analyser" fanen på CFLOW Plus.
- Klikk "Histogram" knappen under "Lag en ny tomt." Velg "FSC-A" og en rullegardinliste vises. Velg kanal "FL1-A."
- Uthev en brønn for å analysere. Velg "Gate"-knappen, og manuelt tegne en gatefor befolkningen av interesse.
- Flow Plus vil gi cellen "Greven" innenfor denne porten og «% av denne tomten".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I dette system ble en glukoseavhengig endring i glycosome sammensetning observert. Når celler dyrkes på glukose inneholdende medier, er to populasjoner observert; en lys og en dim (Figur 2A). Dim celler båtplass umodne glycosomes, som ikke har importert PTS2eYFP mens lyse celler havn en blanding av modne og umodne glycosomes 12. Når glukose er til stede i media, er mislocalization av glycosome proteiner dødelig 15,28 og glycosome protein uttrykk er sannsynligvis koblet tett med import. Denne stramme reguleringen er ansvarlig for utseendet på dim cellene der glycosome proteinuttrykk undertrykkes når cellene mangler tilstrekkelig import evne. Når glycosome import maskiner er ferdig montert og funksjonelle, cellene uttrykker glycosome proteiner, som deretter importeres til glycosomes, gir fluorescerende celler. I glukose-deplete media, er mislocalization av glycosome proteiner tolerered 15, og den bimodale fordelingen populasjonen er erstattet av en enkelt topp med et bredere spekter av fluorescens (figur 2B).
Dette systemet har blitt brukt for å identifisere tilstander som utløser endringer i glycosome sammensetning. Når høy tetthet kulturer inneholdende ~ 10% dim-celler (figur 3A) er ført inn i friske medier, er det en forbigående økning i prosentandelen av dim-celler (Figur 3B). Av 24 hr. den opprinnelige befolkningen fordelingen er gjenopprettet (Figur 3C).
| SDM79 Solids | Vekt (g / l) |
| Graces insektcelle media pulver | 2 |
| Glukose | 1 |
| HEPES | 8 |
| MOPS | 5 |
| NaHCO3 | 2 |
| Natrium pyruvat | 0.1 |
| L-alanin | 0.2 |
| L-Arginine | 0.1 |
| L-Glutamin | 0.3 |
| L-Methonine | 0,07 |
| L-fenylalanin | 0,08 |
| L-Proline | 0.6 |
| L-Serin | 0,06 |
| L-Taurine | 0,16 |
| L-Threonine | 0.35 |
| L-Tyrosin | 0.1 |
| Adenosin | 0,01 |
| Guanosine | 0,01 |
| Glucosamine HCl | 0,05 |
| Folsyre | 0.004 |
| r-aminobenzosyre | 0.002 |
| Biotin 0,0002 |
Tabell 1. SDM79 solide komponenter. Solid mediekomponenter og mengde (g / l) er gitt.
| SDM79 | |
| MEM med glutamin | 600 ml |
| Pen / Strep | 10 ml |
| BME vitamin løsning | 10 ml |
| MEM aminosyrer løsning | 8 ml |
| MEM ikke essensiell aminosyre løsning | 6 ml |
| Hemin | 3,75 |
| Vann | 162,25 ml |
Tabell 2. SDM79 flytende komponenter. Volumer ml er gitt.
| For 20 ml | |
| 120 mM KCl | 1,4 ml (1 M) |
| 0,15 mm CaCl 2 | 3 ml (1 M) |
| 10 mM K 2 HPO 4 | 400 ml (0,5 M) |
| 25 mm HEPES | 500 ml (1 M) |
| 2 mM EDTA | 80 ml (0,5 M) |
| 5 mM MgCl2 | 100 ml (1 M) |
| Vann | 16.52 |
Tabell 3. Cytomix oppskrift.
Figur 1. Fluorescent glycosome reporter system. A) PTS2eYFP uttrykk konstruere integrering. PCF trypanosomer ble transformert med PXS2PTS2eYFP plasmid lineært med restriksjonsenzymet MluI. Denne konstruksjonen integreres via homolog rekombinasjon inn i tubulin locus (Tub) og PARP sekvenser (PARP) omfatter arrangøren som driver konstituerende uttrykk for PTS2eYFP og sekvensene som kreves for RNA prosessering. B) PTS2eYFP import. PTS2eYFP blir syntetisert i cytoplasmaet, hvor det binder den oppløselige reseptor, PEX7, som leverer rapportørprotein til glycosomes. Når levert til glycosome membranen, blir proteinet importert. Modne organeller som inneholder import maskiner import PTS2eYFP og fluorescens mens de som ikke inneholder funksjonell import maskiner forbli svak.
Figur 2. glukoseavhengig glycosome komposisjon. PCF cellene ble dyrket i SDM79 (+ Glc) eller SDM80 (-Glc) oganalysert ved strømningscytometri. Histogrammer av 10.000 hendelser. A) Analyse av celler dyrket i SDM79 avslører konsekvent to topper. Fluorescerende celler havn en blanding av modne og umodne organeller med celler av høyere fluorescens intensiteter har mer modne glycosomes. I SDM79, er mislocalization av glycosome proteiner dødelige og glycosome protein uttrykk og import må være strengt kontrollert. Dette gjenspeiles i fravær av celler med mellomliggende fluorescens intensiteter. B) SDM80 er mislocalization av glycosome proteiner tolerert, den bimodal befolkningsfordelingen er tapt, og cellene i mellom fluorescens er observert.
Figur 3. Glycosome remodeling. Ombygging av glycosomes er utløst av passasje inn frisk medier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Glycosomes er viktige, dynamiske, parasitt-spesifikke organeller. Prosessene som regulerer biogenesis, vedlikehold, spredning og ombygging av disse organeller trolig inkludere narkotika mål som kan utnyttes til terapeutiske formål. Til tross for det potensielt høye overflod av slike stoffet mål, har feltet glycosome biogenese ligget etter studiet av lignende prosesser i andre organismer, hovedsakelig på grunn av mangel på en medgjørlig, high-throughput-systemet ved å overvåke raske, dynamiske responser, organelle i levende celler.
Fluorescent-organelle reporter systemer har blitt brukt til å studere organelle dynamikk i høyere eukaryoter som gjær, planter, sopp og pattedyr 23-25. Vi har generert en transgen stamme av PCF parasitter som uttrykker PTS2eYFP som er rettet mot modne glycosomes, gir fluorescerende organeller. Endringer i glycosome Sammensetningen kan bli overvåket via følgende cellulær fluorescens. Ved hjelp av dette systemet, har vi funnet at miljøforhold, spesielt glukose, regulere glycosome sammensetning 12.
I motsetning til mikroskopi metoder som ofte brukes til å studere organelle dynamikk i kinetoplastid parasitter, tilbyr dette reporter system en metode for å raskt skjermen forbindelser og forhold som påvirker samlede glycosome dynamikk. Men endringene i fluorescens gjenspeile endringer i organelle komposisjoner. Videre biokjemiske og mikroskopiske eksperimenter er nødvendig for å definere de spesifikke molekylære forskjeller mellom cellepopulasjoner stiller ulike fluorescens intensiteter.
Vi har identifisert en rekke kritiske trinn i remodeling analyser. Interessant nok har vi funnet at etter hvert som cellene dyrkes i lengre tid (flere enn to omganger), er uforutsigbar deres oppførsel som reaksjon på endringer i miljøet. Etter lengre tids dyrking, celler gått fra høye tettheter i frisk media, utviser en midlertidig økning i dim befolkningen, noe som indikerer at de fortsatt er i stand til å fornye glycosomes, men dør etter 24 timer. Vi har også møtt situasjoner der ingen ombygging er observert. Grunnen til denne oppførselen er uklar, men vi har funnet at når cellene blir behandlet som beskrevet her (og begrenser antallet av cellepassasjer til to og opprettholde kulturer under 1 x 10 7 / ml), er glycosome ombygging reproduserbar. Når cellene er ikke lenger mottakelig for miljøforhold, retransforming celler med reporteren-konstruere plasmid vanligvis remedier denne situasjonen.
Selv om dette systemet har blitt brukt til å studere glycosome adferd i afrikanske trypanosomer, kan det også tas i bruk for studier av organeller i andre parasitter ved å fusjonere fluorescerende proteiner til aminosyresekvenser som direkte protein lokalisering til andre cellulære avdelinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine | Avocado Research Chemicals Ltd | A10781 | SDM79 Ingredient |
| L-Alanine | Avocado Research Chemicals Ltd | A15804 | SDM79 Ingredient |
| L-Arginine | CalBiochem | 1820 | SDM79 Ingredient |
| p-Aminobenzoic acid | ICN Biomedicals | 102569 | SDM79 Ingredient |
| Basal Medium Eagle Vitamin Solution (100x) | Sigma | B6891 | SDM79 Ingredient |
| Biotin | Fisher | BP232-1 | SDM79 Ingredient |
| Calcium chloride | VWR | BDH0224 | Cytomix |
| EDTA | Fisher | S311-100 | Cytomix ingredient |
| EZNA Gel Extraction kit | Omega Biotek | D2500-01 | DNA purifiation |
| Research grade Serum | Fisher | 03-600-511 | SDM79 Ingredient |
| Folic acid | ICN Biomedicals | 101725 | SDM79 Ingredient |
| Glucosamine HCl | ICN Biomedicals | 194671 | SDM79 Ingredient |
| Glucose | GIBCO | 15023-021 | SDM79 Ingredient |
| L-Glutamine | CalBiochem | 3520 | SDM79 Ingredient |
| Glycerol | Acros Organics | Ac15892-0010 | Freezing media |
| Graces insect cell media powder | GIBCO | 11300-043 | SDM79 Ingredient |
| Hemin | MP Biomedicals | 194025 | SDM79 Ingredient |
| Guanosine | Avocado Research Chemicals Ltd | A11328 | SDM79 Ingredient |
| HEPES | MP Biomedicals | 194025 | SDM79 Ingredient |
| Magnesium chloride | Fisher | BP214-500 | Cytomix ingredient |
| L-Methionine | Fisher | BP388-100 | SDM79 Ingredient |
| MEM Amino Acids (50x) | Cellgro | 25-030-CI | SDM79 Ingredient |
| NEAA Mixture (100x) | Lonza | 13-114E | SDM79 Ingredient |
| Minimal Essential Medium (1x) with L-glutamine | Cellgro | 10-010-CM | SDM79 Ingredient |
| MOPS | Fisher | BP308-500 | SDM79 Ingredient |
| Sodium biocarbonate | Fisher | S233-500 | SDM79 Ingredient |
| Penicillin-streptomycin Solution | Cellgro | 30-002-CI | SDM79 Ingredient |
| L-Phenylalanine | ICN Biomedicals | 102623 | SDM79 Ingredient |
| Potassium chloride | Fisher | P217-500 | Cytomix ingredient |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous | Fisheer | P290-212 | Cytomix ingredient |
| L-Proline | Fisher | BP392-100 | SDM79 Ingredient |
| L-Serine | Acros Organics | 56-45-1 | SDM79 Ingredient |
| Pyruvic acid, sodium salt | Acros Organics | 113-24-6 | SDM79 Ingredient |
| L-Taurine | TCI America | A0295 | SDM79 Ingredient |
| L-Threonine | Acros Organics | 72-19-5 | SDM79 Ingredient |
| L-Tyrosine | ICN Biomedicals | 103183 | SDM79 Ingredient |
| E.Z.N.A. Cycle Pure kit | Omega Biotek | D6492-02 | DNA purification |
| Binding buffer | Omega Biotek | PDR041 | DNA purification |
| SPW wash buffer | Omega Biotek | PDR045 | DNA purification |
| Gene Pulser Xcell | Biorad | 165-2660 | Trypanosome transformation |
| 4 mm Electroporation cuvettes | VWR | Trypanosome transformation |
References
- Stuart, K., et al. Kinetoplastids: related protozoan pathogens, different diseases. J Clin Invest. 118, 1301-1310 (2008).
- Herman, M., Perez-Morga, D., Schtickzelle, N., Michels, P. A. Turnover of glycosomes during life-cycle differentiation of Trypanosoma brucei. Autophagy. 4, 294-308 (2008).
- Herman, M., Gillies, S., Michels, P. A., Rigden, D. J. Autophagy and related processes in trypanosomatids: insights from genomic and bioinformatic analyses. Autophagy. 2, 107-118 (2006).
- Michels, P. A., Bringaud, F., Herman, M., Hannaert, V. Metabolic functions of glycosomes in trypanosomatids. Biochim Biophys Acta. 1763, 1463-1477 (2006).
- Michels, P. A., et al. Peroxisomes, glyoxysomes and glycosomes (review). Mol Membr Biol. 22, 133-145 (2005).
- Moyersoen, J., Choe, J., Fan, E., Hol, W. G., Michels, P. A. Biogenesis of peroxisomes and glycosomes: trypanosomatid glycosome assembly is a promising new drug target. FEMS Microbiol Rev. 28, 603-643 (2004).
- Parsons, M., Furuya, T., Pal, S., Kessler, P. Biogenesis and function of peroxisomes and glycosomes. Molecular and biochemical parasitology. 115, 19-28 (2001).
- Parsons, M. Glycosomes: parasites and the divergence of peroxisomal purpose. Mol Microbiol. 53, 717-724 (2004).
- Michels, P. A., Hannaert, V., Bringaud, F. Metabolic aspects of glycosomes in trypanosomatidae - new data and views. Parasitol Today. 16, 482-489 (2000).
- Michels, P. A., Hannaert, V. The evolution of kinetoplastid glycosomes. J Bioenerg Biomembr. 26, 213-219 (1994).
- Hannaert, V., Michels, P. A. Structure function, and biogenesis of glycosomes in kinetoplastida. J Bioenerg Biomembr. 26, 205-212 (1994).
- Bauer, S., Morris, J. C., Morris, M. T. Environmentally regulated glycosome protein composition in the african trypanosome. Eukaryot Cell. 12, 1072-1079 (2013).
- Colasante, C., Ellis, M., Ruppert, T., Voncken, F. Comparative proteomics of glycosomes from bloodstream form and procyclic culture form Trypanosoma brucei brucei. Proteomics. 6, 3275-3293 (2006).
- Opperdoes, F. R. Compartmentation of carbohydrate metabolism in trypanosomes. Annu Rev Microbiol. 41, 127-151 (1987).
- Kessler, P. S., Parsons, M. Probing the role of compartmentation of glycolysis in procyclic form Trypanosoma brucei: RNA interference studies of PEX14, hexokinase, and phosphofructokinase. The Journal of biological chemistry. 280, 9030-9036 (2005).
- Bringaud, F., Riviere, L., Coustou, V. Energy metabolism of trypanosomatids: adaptation to available carbon sources. Molecular and biochemical parasitology. 149, 1-9 (2006).
- Coustou, V., et al. Glucose-induced remodeling of intermediary and energy metabolism in procyclic Trypanosoma brucei. The Journal of biological chemistry. 283, 16342-16354 (2008).
- Lamour, N., et al. Proline metabolism in procyclic Trypanosoma brucei is down-regulated in the presence of glucose. The Journal of biological chemistry. 280, 11902-11910 (2005).
- Vertommen, D., et al. Differential expression of glycosomal and mitochondrial proteins in the two major life-cycle stages of Trypanosoma brucei. Molecular and biochemical parasitology. 158, 189-201 (2008).
- Vickerman, K. Developmental cycles and biology of pathogenic trypanosomes. British medical bulletin. 41, 105-114 (1985).
- Lorenz, P., Maier, A. G., Baumgart, E., Erdmann, R., Clayton, C. Elongation and clustering of glycosomes in Trypanosoma brucei overexpressing the glycosomal Pex11p. The EMBO journal. 17, 3542-3555 (1998).
- Saveria, T., et al. Conservation of PEX19-binding motifs required for protein targeting to mammalian peroxisomal and trypanosome glycosomal membranes. Eukaryot Cell. 6, 1439-1449 (2007).
- Banerjee, S. K., Kessler, P. S., Saveria, T., Parsons, M. Identification of trypanosomatid PEX19: functional characterization reveals impact on cell growth and glycosome size and number. Molecular and biochemical parasitology. 142, 47-55 (2005).
- Milagros Camara Mde, L., Bouvier, L. A., Miranda, M. R., Pereira, C. A. Identification and validation of Trypanosoma cruzi's glycosomal adenylate kinase containing a peroxisomal targeting signal. Experimental parasitology. 130, 408-411 (2012).
- Wiemer, E. A., Wenzel, T., Deerinck, T. J., Ellisman, M. H., Subramani, S. Visualization of the peroxisomal compartment in living mammalian cells: dynamic behavior and association with microtubules. The Journal of cell biology. 136, 71-80 (1997).
- Kim, P. K., Mullen, R. T., Schumann, U., Lippincott-Schwartz, J. The origin and maintenance of mammalian peroxisomes involves a de novo PEX16-dependent pathway from the ER. The Journal of cell biology. 173, 521-532 (2006).
- Hoepfner, D., Schildknegt, D., Braakman, I., Philippsen, P., Tabak, H. F. Contribution of the endoplasmic reticulum to peroxisome formation. Cell. 122, 85-95 (2005).
- Furuya, T., et al. Glucose is toxic to glycosome-deficient trypanosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14177-14182 (2002).
