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Immunology and Infection

स्थापना और अध्ययन करने के लिए एक उच्च throughput सेटअप का अनुकूलन Published: June 26, 2014 doi: 10.3791/51649
Automatic Translation
*1, *2, 3, 1, 2, 1, 1
1Institute of Biology, Leiden University, 2ZF-screens BV, 3Life Science Methods BV
* These authors contributed equally

Summary

इस वीडियो लेख सफलतापूर्वक एक पूरी पशु कशेरुकी जीव का उपयोग कर परिसर परीक्षण और दवाओं की खोज के लिए एक नया शक्तिशाली उपकरण प्रदान करने zebrafish भ्रूण की बड़ी संख्या को संक्रमित और विश्लेषण करने के लिए स्थापित किया गया है कि उच्च पाइपलाइन का वर्णन करता है.

Abstract

Zebrafish उच्च throughput स्क्रीनिंग संभावनाओं के साथ एक पूरी पशु मॉडल के रूप में दवाओं की खोज स्क्रीनिंग के preclinical चरण में एक महत्वपूर्ण उपकरण होते जा रहे हैं. वे इस तरह से, कम करने, स्तनधारी मॉडल में पहले चरण में सेल आधारित assays के बीच की खाई और इन विवो सत्यापन में पुल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और अधिक महंगा कृंतक मॉडल पर परीक्षण करने के लिए के माध्यम से गुजर यौगिकों की संख्या. इस रोशनी में, वर्तमान पांडुलिपि में Staphylococcus epidermidis का अध्ययन और माइकोबैक्टीरियम marinum संक्रमण के लिए vivo मॉडल प्रणाली के रूप में zebrafish का उपयोग कर एक नई उच्च throughput पाइपलाइन में वर्णित है. इस सेटअप तुल्यकालिक भ्रूण की बड़ी संख्या की पीढ़ी और विश्लेषण homogenously संक्रमित अनुमति देता है. इसके अलावा पाइप लाइन के लचीलेपन उपयोगकर्ता आसानी से जब जरूरत विश्लेषण के संकल्प में सुधार के लिए अन्य प्लेटफार्मों को लागू करने की अनुमति देता है. एक साथ अभिनव उच्च throughput ते साथ zebrafish के संयोजनchnologies क्योंकि नए यौगिकों की कार्रवाई की विधा को समझने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि उपलब्ध ट्रांसजेनिक लाइनों की बड़ी संख्या की वजह से एक पूरी पशु मॉडल का उपयोग कर, लेकिन यह भी की ताकत का न केवल औषधि परीक्षण और नई संभावनाओं के लिए खोज के क्षेत्र खुल जाता है.

Introduction

Zebrafish तारीख करने के लिए (Danio rerio) सफलतापूर्वक संक्रामक रोगों 1 की एक किस्म का अध्ययन करने के लिए एक कुशल मॉडल के रूप में स्थापित किया गया है. zebrafish भ्रूण की वजह से उनकी पारदर्शिता और फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त मौजूदा ट्रांसजेनिक संवाददाता लाइनों की बड़ी संख्या के लिए vivo इमेजिंग संभावनाओं में अद्वितीय प्रदान करता है. इस शक्तिशाली संयोजन ऐसे माइकोबैक्टीरियम marinum, एम. के निकटतम रिश्तेदार के रूप में रोगजनकों के साथ बातचीत करते हुए यह संभव समय में अलग प्रतिरक्षा प्रकार की कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए बनाता है तपेदिक 2, या Staphylococcus epidermidis, biomaterial जुड़े संक्रमण 3-5 की मुख्य प्रेरणा का. संक्रमण के विभिन्न मार्गों अध्ययन 6 के उद्देश्यों के आधार पर zebrafish भ्रूण में इस्तेमाल किया जा सकता है.

इन संक्रमण मार्गों में से एक बैक्टीरिया की जर्दी इंजेक्शन है. दूसरों की तुलना में इस विधि का मुख्य लाभ यह है कि जर्दी infecti हैपर काफी इंजेक्शन समय को कम करने और संक्रमण 7, 8 के उच्च reproducibility की अनुमति, रोबोट इंजेक्शन के माध्यम से स्वचालित रूप से किया जा सकता है.

पिछला काम, एस के अध्ययन के लिए vivo मॉडल प्रणाली में एक उच्च throughput के रूप में zebrafish का उपयोग epidermidis और एम. marinum संक्रमण 7, 8 सफल होने के लिए दिखाया. इस प्रणाली के रोबोट की जर्दी जल्दी भ्रूण के इंजेक्शन और जीवाणु लोड के लिए एक उपाय के रूप में प्रतिदीप्ति readout का उपयोग कर के माध्यम से रोग प्रगति के लिए स्क्रीन करने में सक्षम है. इस धारणा के साथ समझौते में, इस स्थापना अनुकूलित और homogenously संक्रमित भ्रूण की बड़ी संख्या को पैदा करते हैं और यौगिकों की एक संख्या के साथ उपचार के बाद समय के दौरान संक्रमण की प्रगति को ट्रैक करने की क्षमता के साथ एक अत्यधिक कुशल उच्च throughput पाइपलाइन स्थापित किया गया है. स्थापित सेटअप के साथ यह स्क्रीन करने के लिए 8,000 तुल्यकालिक भ्रूण को उत्पन्न करने के लिए संभव हैरोग प्रगति के लिए, प्रति घंटे 2,500 भ्रूण अप करने के लिए इस तरह से प्रसंस्करण. भ्रूण संक्रमित लार्वा के समरूप समूह, यह सुनिश्चित करने के लिए एक स्वचालित प्रणाली का उपयोग कर उनके जीवाणु लोड के आधार पर हल कर रहे हैं. इसके अलावा, सेटअप को मान्य करने के लिए, स्तनधारियों में तपेदिक बढ़ने से रोकने के लिए जाना जाता है संदर्भ का प्रभाव एम. से संक्रमित भ्रूण पर परीक्षण किया गया है marinum E11 तनाव या अधिक विषमय एम तनाव 9.

इस अध्ययन में विस्तार से संक्रमित भ्रूण की बड़ी संख्या है और विकास के दौरान और यौगिक उपचार के बाद बैक्टीरियल प्रगति के बाद के विश्लेषण उत्पन्न करने में सक्षम होने के लिए स्थापित किया गया है कि उच्च पाइपलाइन का वर्णन करता है.

Protocol

1. जीवाणु उपभेदों और विकास की स्थिति

  1. एस की तैयारी epidermidis inoculum
    1. एस से कई व्यक्तिगत कालोनियों लो epidermidis तनाव हे -47, एक pWVW189 युक्त एक Luria Bertani (पौंड) 25 मिलीलीटर लेग माध्यम में 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात 10 माइक्रोग्राम / एमएल chloramphenicol और संस्कृति के साथ पूरक अगर प्लेट के साथ पूरक से mCherry अभिव्यक्ति वेक्टर (डी बोअर एल अप्रकाशित) व्युत्पन्न मंच MIDlog को 10 माइक्रोग्राम / एमएल chloramphenicol.
    2. 1 मिनट के लिए 12,000 XG पर और बाद में संस्कृति की अपकेंद्रित्र 1 मिलीलीटर उन्हें 0.3% (v / v) बीच 80 से 1 मिलीलीटर बाँझ फॉस्फेट buffered खारा (पीबीएस) के साथ 3x धो लो.
    3. 600 एनएम (600 आयुध डिपो) पर ऑप्टिकल घनत्व को मापने, और (w / v) polyvinylpyrrolidone 40 (PvP 40) पीबीएस में 2% में एक आयुध डिपो 0.3 की 600 जीवाणु निलंबन पतला. नोट: एक आयुध डिपो 600 x 10 8 1.0 से मेल खाती 0.3 की कॉलोनी इकाइयों / एमएल (CFU / एमएल) के गठन.
    4. एम. तैयार करें marinum inoculum
      1. एम. से कई व्यक्तिगत कालोनियों लो marinum तनाव एम या stably (v / v) Middlebrook OADC संवर्धन 50 ग्राम के साथ पूरक / के 10 एमएल में 28 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात hygromycin और संस्कृति एमएल 10% के साथ एक Middlebrook 7H10 अगर थाली से mCherry 10 व्यक्त pSMT3-mCherry वेक्टर युक्त E11 50 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर hygromycin के साथ पूरक 10% (v / v) Middlebrook एडीसी संवर्धन के साथ Middlebrook 7H9 शोरबा.
      2. 1 मिनट के लिए 12,000 XG पर और बाद में संस्कृति की अपकेंद्रित्र 1 मिलीलीटर यह 0.3% (v / v) बीच 80 से 1 मिलीलीटर बाँझ पीबीएस के साथ 3x धो लो.
      3. आयुध डिपो 600 उपाय, और पीबीएस में (w / v) PvP 40 2% में एक आयुध डिपो 0.3 की 600 जीवाणु निलंबन पतला. नोट: एक आयुध डिपो 1 मेल खाती है की 600 8 10 एक्स 1.0 के लिए CFU / एमएल.

    2. Zebrafish अंडे की तैयारी

    1. 70 पुरुष और 50 महिला जंगली Ty की एक अधिकतम रखेंबड़े प्रजनन पोत में अलग zebrafish पे. नोट: बड़े प्रजनन पोत के निचले हिस्से में महिला मछली रखें.
    2. Zebrafish प्रजनन शुरू करते हैं करने के लिए, सुबह में अगले दिन विभाजक निकालें.
    3. अंडा पानी (60 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर तत्काल महासागर समुद्री नमक) से भरा एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में अंडा कलेक्टर के माध्यम से बड़े प्रजनन पोत के तल पर अंडे ले लीजिए.

    3. इंजेक्शन सुई

    1. 10 माइक्रोन की एक आंतरिक व्यास के साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कस्टम बनाया कांच capillaries सुइयों प्राप्त करते हैं.

    इंजेक्शन के 4. प्रायोगिक रेखांकित करें

    1. लगभग 40 डिग्री सेल्सियस तक 100 1% की मिलीलीटर अंडा पानी में (w / v) agarose, और शांत उबाल लें स्वचालित microinjectors थाली में agarose डालो और agarose में 1,024 अच्छी तरह से दुनिया भर के टिकट जगह है. नोट: प्लेट नीचे जब ठंडा उपयोग के लिए तैयार है.
    2. पर स्वचालित microinjector ऑपरेटिंग सॉफ्टवेयर पर क्लिक करने पर 'चरण जांचना',फिर '1024 'अच्छी तरह से ग्रिड पर क्लिक करें और microinjector में agarose थाली जगह और अच्छी तरह से केंद्र की स्थिति पर स्क्रीन पर क्लिक करके प्लेट जांचना.
    3. 'सुई मेनू' पर जाएं और 'जांच सुई धारक' पर क्लिक करें.
    4. 100 CFU / NL एस युक्त 10 μl PvP 40 के साथ या तो एक microloader टिप का उपयोग इंजेक्शन की सुई भरें epidermidis या 30 CFU / NL एम. marinum, या नकली इंजेक्शन के रूप में उपयोग PvP 40.
    5. स्वचालित सूक्ष्म सुई लगानेवाला में सुई प्लेस और कम करने या सुई तक चलती है और सुई की स्थिति में स्क्रीन पर क्लिक करके, y स्थिति एक्स जांचना. तो सुई की नोक की स्थिति में स्क्रीन पर क्लिक करके सुई के Z स्थिति जांचना.
    6. एक प्लास्टिक हस्तांतरण pipet का उपयोग agarose ग्रिड से अधिक अंडे वितरित, और अतिरिक्त अंडा पानी निकाल दें. स्वचालित microinjector में agarose ग्रिड रखें.
    7. 'Injectio पर जाएँn मेनू 'और समायोजित करें' Femtojet सेटिंग्स मेनू पर, 1 नाथन के साथ संबद्ध है, जो '200 एचपीए के लिए सेटिंग,' इंजेक्शन दबाव इंजेक्शन समय '0.2 सेकंड और मुआवजा दबाव' 15 एचपीए,.
    8. पूरी थाली इंजेक्षन करने के लिए 'सभी इंजेक्षन' पर क्लिक करें.
    9. अंडे ले लीजिए पेट्री डिश प्रति 70 भ्रूण की एक अधिकतम के साथ एक पेट्री डिश (92 x 16 मिमी) में उन्हें धोने, और 28 डिग्री सेल्सियस पर सेते द्वारा इंजेक्शन के बाद

    5. प्रवाह cytometer विश्लेषण

    1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार cytometer बड़े कण प्रवाह को तैयार है और अंडे पानी के साथ नमूना कप और म्यान तरल पदार्थ कंटेनर भरें.
    2. ऑपरेटिंग सॉफ्टवेयर, 'पीएमटी' मेनू में जाएँ और निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग: 'ग्रीन' और 'पीला' चैनल के लिए 650 'लाल' चैनल के लिए वी और 0 वी. फिर 'सीमारेखा' मेनू में जाएँ और निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग: 'Opticaमलबे के प्रभाव को कम करने के क्रम में एल घनत्व 'दहलीज संकेत: 975 एम वी (Copas एक्स्ट्रा लार्ज मूल्य: 50) और' 320 μsec (800 Copas एक्स्ट्रा लार्ज मूल्य) के लिए उड़ान के समय '(TOF) न्यूनतम.
    3. भ्रूण के विश्लेषण के लिए, 5.4 चरण पर जाएँ छँटाई और एक पेट्री डिश में भ्रूण छँटाई 5.5 या विश्लेषण के लिए कदम करने के लिए जाने के लिए और एक 96 अच्छी तरह से थाली में भ्रूण छँटाई के बिना विश्लेषण के लिए 5.6 चरण पर जाएँ.
    4. नमूना कप में भ्रूण प्लेस और विश्लेषण शुरू करने के लिए 'आरंभ' पर क्लिक करें. सभी भ्रूण विश्लेषण कर रहे हैं जब 'बंद' पर क्लिक करके विश्लेषण करना बंद करो. 'सभी स्टोर' पर क्लिक करके डेटा को बचाओ. नोट: सभी डेटा TXT, LMD, Dat, सीएसवी और BSRT फ़ाइलों के रूप में जमा हो जाती है. कदम 5.7 में प्रोटोकॉल का पालन करें.
    5. नमूना कप में भ्रूण रखें और 'सॉर्ट' मेनू में 70 दर्ज करके हल किया जाना प्लेट प्रति 70 भ्रूण की अधिकतम परिभाषित. सॉर्टर के तहत एक खाली पेट्री डिश प्लेस और 'मैनुअल के आधार पर क्रमबद्ध' पर क्लिक करें. जब पेट्री di श भर जाता है, 'सभी स्टोर' पर क्लिक करके डेटा को बचाने के. नोट: सभी डेटा TXT, LMD, Dat, सीएसवी और BSRT फ़ाइलों के रूप में संग्रहीत किया जाता है. कदम 5.7 में प्रोटोकॉल का पालन करें.
    6. नमूना कप में भ्रूण रखें और 'सॉर्ट' मेनू में 1 दर्ज करके हल किया जाना अच्छी तरह से प्रति 1 भ्रूण की अधिकतम परिभाषित. बाईं थाली धारक में एक खाली 96 अच्छी तरह से थाली प्लेस और 'थाली भरें' पर क्लिक करें. 96 अच्छी तरह से थाली भर जाता है, 'सभी स्टोर' पर क्लिक करके डेटा को बचाने के. नोट: सभी डेटा TXT, LMD, Dat, सीएसवी और BSRT फ़ाइलों के रूप में संग्रहीत किया जाता है. कदम 5.7 में प्रोटोकॉल का पालन करें.
    7. 'स्थिति' चुनें: निम्न डेटा फ़िल्टर सेटिंग्स का उपयोग, कच्चे डेटा की प्रक्रिया करने के लिए TXT फ़ाइल करें. 6 फिर 'लाल से कुल प्रतिदीप्ति संकेत से नंबर का उपयोग करें: 40, और तरह मॉड्यूल' स्थिति के आधार पर क्रमबद्ध 'यदि का उपयोग औसत और मतलब की मानक त्रुटि की गणना करने के लिए 'चैनल. बार या बिखराव रेखांकन में इन डेटा सेट प्लॉट.
    ve_title "> 6. औषध उपचार

    1. विश्लेषण और प्रकार में 3 दिनों के बाद इंजेक्शन (डीपीआई), एम. marinum बड़े कण (कदम 5.5) प्रवाह cytometer का उपयोग कर दो बराबर समूहों में भ्रूण संक्रमित. एक अपने कैरियर विलायक में ब्याज की एक परिसर के साथ समूह और अकेले विलायक वाहक (नियंत्रण) के साथ दूसरे का इलाज. एंटीबायोटिक दुष्प्रभावों के लिए परीक्षण करने के लिए इंजेक्शन नियंत्रण नकली इसी तरह के उपचार लागू करें.
    2. 4 और 5 डीपीआई पर विश्लेषण दोहराएँ (5.5 कदम) और अंडे का पानी या युक्त यौगिक अंडा पानी को ताजा करें.

    7. उच्च संकल्प इमेजिंग

    1. 0.02% के साथ भ्रूण चतनाशून्य (w / v) विश्लेषण से पहले अंडा पानी में 10 मिनट 3 aminobenzoic एसिड एथिल एस्टर (Tricaine) buffered.
    2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार हड्डीवाला स्वचालित स्क्रीनिंग तकनीक प्रणाली और बड़े कण नमूना तैयार करें.
    3. वस्तु - 'इमेजिंग से भ्रूण की उम्र को इसी संदर्भ छवियों का चयन करें211; डिटेक्शन सेटअप 'मेनू.
    4. मेनू - 'ऑटो दुकान छवियों इमेजिंग' से हड्डीवाला स्वचालित स्क्रीनिंग तकनीक प्रणाली द्वारा किए जाने के चित्रों की राशि और ओरिएंटेशन का चयन करें.
    5. बड़े कण पारखी की बाईं थाली धारक में (कदम 5.6 से) भ्रूण से भरा एक 96 अच्छी तरह से थाली प्लेस, और 'भागो थाली' पर क्लिक करें.
    6. एक भ्रूण का पता चला और सही ढंग से तैनात है जब; छवि सिर और CLSM एक 10X सादे ड्राई उद्देश्य का उपयोग और इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग बाद में छवियों सिलाई के साथ अलग से पूंछ.

Representative Results

वर्तमान परिणाम उच्च throughput पाइपलाइन एस अध्ययन करने के लिए बताते हैं कि epidermidis और एम. marinum संक्रमण सफलतापूर्वक स्थापित कर दिया गया है और कहा कि अन्य संक्रमण मॉडल के लिए बढ़ाया जा सकता है. सबसे पहले, Adatto एट अल द्वारा प्रकाशित प्रणाली पर आधारित बड़े प्रजनन पोत (चित्रा 1 ए),. (2011) 11 के उपयोग, spawning प्रक्रिया का एक उच्च नियंत्रण affording एकल घटनाओं में तुल्यकालिक अंडे की बड़ी संख्या उत्पन्न करने के लिए सक्षम बनाता है. पहले से विकसित स्वचालित सूक्ष्म इंजेक्शन प्रणाली 7 के एक उन्नत संस्करण (चित्रा 1 ए) का इस्तेमाल किया गया था, समय की एक छोटी अवधि में भ्रूण की बड़ी संख्या इंजेक्षन करने में सक्षम होने के लिए अगले. जर्दी संक्रमण के लिए सबसे अच्छा विकास मंच, एस के साथ इंजेक्शन है जो गधों epidermidis और एम. marinum किमेल एट अल द्वारा किए गए विवरण के अनुसार, 1 और 512 सेल मंच के बीच सभी विभिन्न चरणों में प्रदर्शन किया गया. (1995) 12

100 CFU एस के साथ इंजेक्शन epidermidis 16 और 128 सेल मंच के बीच सबसे अच्छा संक्रमण पैटर्न (चित्रा 2) प्रदान की. बैक्टीरिया 3 दिनों के लिए जर्दी अंदर proliferated और उसके बाद 3 डीपीआई से शरीर में फैल गया. 256 सेल चरण भ्रूण के शरीर के अंदर फैल शायद ही कोई बैक्टीरिया के साथ की जर्दी के अंदर मुख्य रूप से बैक्टीरियल वृद्धि से पता चला के बाद 16 सेल चरण से पहले इंजेक्शन प्रदर्शन 4 डीपीआई, और इंजेक्शन से उच्च मृत्यु दर के लिए नेतृत्व किया. बैक्टीरियल बोझ की मात्रा Veneman एट अल द्वारा वर्णित के रूप में बड़े कण प्रवाह cytometer का उपयोग कर प्रतिदीप्ति तीव्रता विश्लेषण के द्वारा प्रदर्शन किया गया था. (2013) 8 (चित्रा 3).

टिप्पणियों से पता चला है कि 30 CFU एम. के इंजेक्शन के लिए इष्टतम विकास मंच marinum इंजेक्शन E11 तनाव (चित्रा -4 ए) के लिए और अधिक उग्र एम strai साथ 16-64 सेल मंच के बीच 16-128 सेल मंच के बीच हैN (चित्रा 4 बी). इन चरणों में इंजेक्शन भ्रूण की जर्दी अंदर बैक्टीरियल वृद्धि से पता चला है और भ्रूण (चित्रा 7) के माध्यम से बैक्टीरिया के प्रसार. पहले चरण में दोनों उपभेदों के साथ संक्रमण 4 डीपीआई के बाद मरने के लिए भ्रूण प्रमुख अविशिष्ट सामान्यीकृत बैक्टीरिया विकास को प्रस्तुत किया. दूसरी ओर, बाद के चरणों में इंजेक्शन भ्रूण में बैक्टीरियल बोझ जर्दी के लिए प्रतिबंधित किया गया था.

इसके बाद, बड़े कण के साथ presorting (चित्रा 1 बी) गैर या अत्यधिक संक्रमित भ्रूण (आंकड़े 5 ए और 6A) को छोड़कर संक्रमित मछली की एक बड़ी समरूप समूह उत्पन्न प्रवाह cytometer. Presorting बाद, एम. marinum संक्रमित भ्रूण रिफैम्पिसिन, एक पहली पंक्ति क्षयरोगनिवारक दवा के साथ इलाज किया गया. पिछले अध्ययनों से 200 माइक्रोन की एक खुराक पर रिफैम्पिसिन साथ इलाज कुशलतापूर्वक एम. कम कर देता है कि प्रदर्शन zebrafish 7, 13 में marinum संक्रमण. लाभ उठाते हुएविभिन्न खुराक प्रदर्शन किया गया था के साथ उच्च throughput सेटअप, उपचार के साथ उत्पन्न homogenously संक्रमित भ्रूण की बड़ी संख्या के ए. एम. से संक्रमित भ्रूण marinum एम तनाव और 12, 24 के साथ 48 घंटे के लिए इलाज किया, और 200 माइक्रोन रिफैम्पिसिन एक खुराक पर निर्भर ढंग से (चित्रा 5 ब) में कुशलता माइक्रोबैक्टीरियल संक्रमण को कम करने के लिए दिखाया. इस एकाग्रता भविष्य प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया था 200 माइक्रोन की एक खुराक पर रिफैम्पिसिन का उपयोग संक्रमण के कुशल कमी को देखते हुए. पिछले परिणाम के साथ लाइन में, बैक्टीरियल बोझ प्रगति का अध्ययन एम. का उपयोग marinum E11 तनाव एक महत्वपूर्ण कमी 24 घंटा और उसके बाद 200 माइक्रोन रिफैम्पिसिन साथ उपचार के बाद (चित्रा 6B) मनाया गया.

उच्च वृद्धि इमेजिंग इन भ्रूण की आवश्यकता है इसके अलावा, अगर, वे नमूनों का विश्लेषण का उपयोग किया जा सकता है, जहां से 96 अच्छी तरह प्लेटें (चित्रा 1C), में स्वचालित रूप से प्रदर्शित किया जा सकता हैबड़े कण पारखी के साथ हड्डीवाला स्वचालित स्क्रीनिंग तकनीक प्रणाली एक CLSM पर मुहिम शुरू की.

बड़े कण पारखी के साथ हड्डीवाला स्वचालित स्क्रीनिंग तकनीक प्रणाली या तो एक CLSM या स्टीरियो माइक्रोस्कोप पर रखा जा सकता है कि एक प्रणाली है. इस डिवाइस स्वचालित रूप से एक गिलास केशिका के माध्यम से एक 96 अच्छी तरह से थाली या थोक कंटेनर से रहते हैं या तय भ्रूण की लोडिंग की अनुमति देता है, और वांछित कोण (जैसे, पृष्ठीय या पार्श्व) में कैमरे के सामने यह orientates. सभी झुकाव में भ्रूण की छवियों पर बोर्ड कैमरा के साथ या एक बाहरी CLSM (चित्रा 7) के साथ बनाया जा सकता है. भ्रूण बाद में संग्रह या अपशिष्ट कंटेनर में स्थानांतरित कर दिया जाएगा.

चित्रा 1
चित्रा 1. मुख्यधारा प्रयोगात्मक outline. बड़े से ए) वयस्क मछली के अंडे, एकत्र एक agarose थाली में गठबंधन और इंजेक्ट कर रहे हैं, दोस्त के लिए एक साथ डाल रहे हैं. बी) इंजेक्शन अंडे 28 डिग्री सेल्सियस पर incubated हैं और संभव दवा उपचार के लिए पूर्व हल किया जाएगा. सी) बाद के विश्लेषण कण CLSM साथ cytometer और / या बड़े कण पारखी / हड्डीवाला स्वचालित स्क्रीनिंग तकनीक का प्रवाह. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
एस के लिए सबसे अच्छा सेल चरण के 2. स्थापना चित्रा epidermidis इंजेक्शन की जर्दी. zebrafish भ्रूण एस के 100 CFU साथ 1 512 सेल मंच से विभिन्न विकासात्मक चरणों में जर्दी में इंजेक्शन थे epidermidis. 1 एक के बीच इंजेक्शन भ्रूणएन डी 8 सेल चरण 4 डीपीआई से जर्दी और उच्च मृत्यु दर में बैक्टीरियल वृद्धि देखी गई. 16 और 128 सेल मंच के बीच इंजेक्शन भ्रूण की जर्दी में और 3 डीपीआई पर शुरू शरीर के अंदर बैक्टीरियल वृद्धि देखी गई. 256 और 512 सेल मंच के बीच इंजेक्शन भ्रूण की जर्दी के अंदर कई बैक्टीरियल वृद्धि देखी गई. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
एस के cytometer बड़े कण प्रवाह का उपयोग बैक्टीरियल बोझ के चित्रा 3. मात्रा. 100 CFU epidermidis zebrafish भ्रूण की जर्दी में इंजेक्शन थे. ए) 5 डीपीआई तक, हर दिन, 10 भ्रूण के समूहों के दो जैविक प्रतिकृतियां (त्रुटि सलाखों के आधार पर औसत घातीय वृद्धि दिखा, homogenized और सीधे चढ़ाया गयाविश्लेषण cytometer = SEM). बी) बड़े कण प्रवाह गैर इंजेक्शन और एस से औसत प्रतिदीप्ति संकेत से पता चलता है epidermidis भ्रूण इंजेक्शन. . नहीं महत्वपूर्ण मतभेद सी) CFU के बीच सहसंबंध और: शर्त प्रति 30-160 भ्रूण (त्रुटि सलाखों = SEM), विभिन्न पत्र एनोवा Tukey के बाद अस्थायी टेस्ट (पी <0.001), एन द्वारा पीछा एक तरह से सांख्यिकीय महत्वपूर्ण मतभेद का संकेत विश्लेषण किया गया 10 एस के समूह का औसत प्रतिदीप्ति संकेत epidermidis (त्रुटि सलाखों = SEM) भ्रूण संक्रमित. यह आंकड़ा Veneman एट अल से संशोधित किया गया है. (2013) 8. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
चित्रा 4. Establisएम. के लिए सबसे अच्छा सेल चरण के hment marinum जर्दी इंजेक्शन. zebrafish भ्रूण एम. के 30 CFU साथ 1 512 सेल मंच से सभी विभिन्न विकासात्मक चरणों में इंजेक्ट किया गया marinum E11 और एम तनाव. ए, बी) भ्रूण दिखाया 1-8 सेल मंच से इंजेक्शन भी इसी तरह फैल रहा है और उन इंजेक्शन जबकि E11 तनाव granulomas और प्रणालीगत संक्रमण के गठन से पता चला है साथ दोनों उपभेदों के साथ मृत्यु दर. ए) भ्रूण 16-128 सेल मंच के बीच इंजेक्शन 256 512 सेल मंच. बी) की जर्दी में बैक्टीरियल बोझ रखा से भ्रूण 512 सेल चरण के लिए 128 से इंजेक्शन उन जर्दी में बैक्टीरियल बोझ रखा जबकि संरचनाओं और प्रणालीगत संक्रमण की तरह ग्रेन्युलोमा के गठन दिखाया एम तनाव के साथ 16-64 सेल मंच के बीच इंजेक्शन . इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5 चित्रा 5. एम. के उपचार marinum तीव्र संक्रमण एक पहली पंक्ति विरोधी तपेदिक दवा के साथ. भ्रूण एम. के 30 CFU साथ 16-64 सेल मंच के बीच इंजेक्शन marinum एम तनाव दोनों समूहों में व्यक्तिगत भ्रूण की गैर और / या अत्यधिक संक्रमित भ्रूण. ए) प्रतिदीप्ति discarding के बाद दो समूहों में हल किया जाना 3 डीपीआई पर प्रवाह cytometer बड़े कण के माध्यम से चलाए जा रहे थे. बी) भ्रूण रिफैम्पिसिन (राइफल्स के साथ इलाज ) 12, 24, और 200 माइक्रोन 4 डीपीआई पर विश्लेषण किया गया की खुराक पर 48 घंटे के लिए; उनके जीवाणु लोड काफी. सी) प्रतिनिधि Copas 12, 24 की खुराक पर DMSO और रिफैम्पिसिन साथ इलाज भ्रूण की प्रोफाइल, और 24 घंटे के लिए 200 माइक्रोन से कम है. बैक्टीरियल लोड और वितरण लाल चोटियों ने संकेत दिया है. ब्लू लाइन zebrafish ई DPF क्रमबद्ध तत्व का प्रोफाइल (4 का प्रतिनिधित्व करता हैmbryo) Copas द्वारा. हालत प्रति 60-90 भ्रूण विश्लेषण किया गया. प्रत्येक डेटा बिंदु एक व्यक्ति भ्रूण का प्रतिनिधित्व करता है. मतलब ± SEM मानों संकेत कर रहे हैं. एनएस: महत्वपूर्ण नहीं मतभेद. मतभेद के सांख्यिकीय महत्व का विश्लेषण एनोवा Tukey के posthoc परीक्षण के बाद एक जिस तरह से प्रदर्शन किया गया था. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 6
चित्रा 6. एम. के उपचार marinum पुराने संक्रमण एक पहली पंक्ति क्षयरोगनिवारक दवा के साथ. भ्रूण एम. के 30 CFU साथ 16-64 सेल मंच के बीच इंजेक्शन marinum E11 तनाव गैर और / या अत्यधिक संक्रमित भ्रूण discarding के बाद दो समूहों में हल किया जाना 3 डीपीआई पर cytometer बड़े कण प्रवाह के माध्यम से चलाए जा रहे थे. ए) दोनों समूहों में व्यक्तिगत भ्रूण की प्रतिदीप्ति. बी) 4 दिनों के दौरान 200 माइक्रोन पर रिफैम्पिसिन (राइफल्स) के साथ इलाज भ्रूण उपचार के 1 दिन के बाद जीवाणु लोड की एक महत्वपूर्ण कमी दिखा विश्लेषण किया गया. हालत प्रति 90 भ्रूण विश्लेषण किया गया. मतलब ± SEM मानों संकेत कर रहे हैं. विभिन्न पत्र एक ही इलाज के समय अंक के बीच महत्वपूर्ण अंतर से संकेत मिलता है. * नियंत्रण समूह के साथ महत्वपूर्ण अंतर को दर्शाता है. एनएस: महत्वपूर्ण नहीं मतभेद. मतभेद के सांख्यिकीय महत्व का विश्लेषण एनोवा Tukey के posthoc परीक्षण के बाद एक जिस तरह से प्रदर्शन किया गया था. (पी <0.05). चित्रा बी) Spaink एट अल से संशोधित किया गया है. (2013) 13. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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एम. चित्रा 7. परिणाम marinum E11 जर्दी इंजेक्शन हड्डीवाला स्वचालित स्क्रीनिंग तकनीक और CLSM का उपयोग imaged. एक 5 डीपीआई FLI1-EGFP 14 भ्रूण की (3 छवियों सिले) Confocal Z ढेर. एम. के ए) लाइव भ्रूण दिखा प्रसार शरीर. बी भर marinum E11 बैक्टीरिया (लाल)) एम. दिखा फिक्स्ड 5 डीपीआई FLI-EGFP भ्रूण पूरे शरीर में marinum E11 बैक्टीरिया (लाल) ल्यूकोसाइट एल plastin 15 immunostaining द्वारा पता लगाया (हल्का नीला) के साथ सह स्थानीयकृत.

Discussion

इस पत्र में वर्णित उच्च throughput कार्यप्रणाली संक्रमण के विभिन्न प्रकार के साथ मछली भ्रूण और लार्वा की उच्च संख्या स्क्रीन करने के लिए एक तेजी से और लागत प्रभावी पाइप लाइन में हैं. बजाय पारंपरिक एकल या परिवार प्रजनन टैंक की बड़ी प्रजनन पोत का उपयोग spawning प्रक्रिया का नियंत्रण और तुल्यकालिक अंडे की बड़ी संख्या की पीढ़ी में मदद की. स्वचालित सूक्ष्म इंजेक्शन प्रणाली 7 के एक उन्नत संस्करण के साथ, यह 1 घंटे के भीतर एक ही सेल चरण में लगभग सभी 2,500 अंडे को इंजेक्षन करने के लिए संभव है. इन अद्यतन और बेहतर सॉफ्टवेयर के साथ एक पढ़ा बाहर के रूप में बैक्टीरियल प्रसार के साथ बड़ी दवा स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो पहले संभव था और अधिक से अधिक अंडे इंजेक्षन करने के लिए संभव है. हालांकि इस पद्धति अभी भी इंजेक्शन, Benard एट अल द्वारा वर्णित उदाहरण के लिए अन्य इंजेक्शन मार्गों जर्दी तक सीमित है. (2012) 6, उम्मीद है कि निकट भविष्य में स्वचालित सूक्ष्म इंजेक्शन प्रणाली में शामिल किया जाएगा.

<इन तरीकों zebrafish स्क्रीनिंग के लिए बेंचमार्क हालांकि पी वर्ग = "jove_content">, यह रूप में अच्छी तरह से अन्य मछली प्रजातियों के साथ अनुप्रयोगों के लिए उपयोगी होगा. उदाहरण के लिए, कॉमन कार्प दवा स्क्रीन के लिए फायदे हैं करने के लिए संकेत किया गया है. Zebrafish की तरह, अंडे और कॉमन कार्प से प्रारंभिक चरण भ्रूण पारदर्शी लेकिन सौ अंडे के हजारों और एक अधिक स्थिर आनुवंशिक पृष्ठभूमि 16 प्रस्ताव है कि जन्मजात लाइनों की उपलब्धता के अपने बड़े अंडे के आकार का मुख्य लाभ के साथ कर रहे हैं.

संक्रमित भ्रूण की बड़ी मात्रा का विश्लेषण cytometer उच्च throughput बड़े कण प्रवाह के साथ किया जाता है. इस डिवाइस के आधार पर क्रमबद्ध बहु अच्छी तरह प्लेटें या यौगिकों की बड़ी संख्या के परीक्षण के लिए यह विशेष रूप से उपयुक्त बना एक पेट्री डिश में भ्रूण का विश्लेषण कर सकते हैं. एक उच्च इमेजिंग संकल्प की जरूरत है, तो सेटअप प्रौद्योगिकी cytometer बड़े कण प्रवाह पूर्व स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक तरह से अनुकूल है और बाद में के माध्यम से एक मध्यम पर नमूनों का विश्लेषण किया जाता है के अलावाएक उच्च संकल्प पर डाल दिया. इस हड्डीवाला स्वचालित स्क्रीनिंग तकनीक 17, 18 का उपयोग किया जा सकता है. इस डिवाइस स्वचालित रूप से एक बहु अच्छी तरह से थाली या थोक कंटेनर, छवि CLSM या स्टीरियो माइक्रोस्कोपी का उपयोग एक केशिका के माध्यम से 360 डिग्री से 2 और 7 दिनों के बाद निषेचन के बीच रहते हैं या तय भ्रूण लीजिए और आधारित भ्रूण के मैनुअल छँटाई की अनुमति 2 थोक कंटेनरों में फिर से निपटान कर सकते हैं सूक्ष्म चित्र पर. भविष्य में सुधार इसलिए यह संभव CLSM के साथ समय पर व्यक्तिगत भ्रूण की स्वचालित रूप से बड़ी संख्या में स्क्रीन करने के लिए कर रही है, बहु अच्छी तरह से थाली में इमेजिंग के बाद भ्रूण की छंटाई की अनुमति देगा. भविष्य अनुप्रयोगों में हड्डीवाला स्वचालित स्क्रीनिंग तकनीक प्रणाली भी बहु अच्छी तरह प्लेटें में पूर्व वितरण लार्वा की आवश्यकता के बिना प्रौद्योगिकी cytometer बड़े कण प्रवाह से जोड़ा जा सकता है कि मान लिया जाये कि, एक और अधिक उन्नत सॉर्टिंग को बढ़ावा मिलेगा.

इस पत्र स्थापना एक का वर्णनएस अध्ययन करने के लिए एक उच्च throughput सेटअप के डी अनुकूलन epidermidis और एम. दवाओं की खोज के लिए एक मॉडल के रूप में marinum संक्रमण. यह जर्दी में इंजेक्शन इन बैक्टीरिया के परिणाम इंजेक्शन के समय पर अंडे के विकास के चरण पर निर्भर करता है कि यह दर्शाता है. एम. इंजेक्शन लगाने 16-128 सेल मंच या 16-64 सेल स्तर पर एम तनाव में marinum E11 दुम नस इंजेक्शन 2, 6 के रूप में ही संक्रमण पैटर्न की ओर जाता है. हालांकि इस सेटअप केवल बैक्टीरियल रोगज़नक़ों के प्रसार तक ही सीमित नहीं है. यह रोबोट क्रमशः 13, अभिव्यक्ति और जीन दस्तक नीचे पढ़ाई transgenesis के लिए डीएनए, आरएनए या morpholinos युक्त समाधान इंजेक्षन करने के लिए संभव है कि पहले दिखाया गया था. इसके अलावा, यह इस स्थापना भी कैंसर सेल प्रसार और प्रवास के अध्ययन के लिए उपयोगी है कि दिखाया गया था. इसलिए इस पाइपलाइन के संदर्भ में संकेत तंत्र की एक किस्म के उच्च throughput स्क्रीन के लिए एक बहुमुखी विधि प्रस्तुत करता हैजन्मजात उन्मुक्ति की, संक्रामक रोग और कैंसर के विकास के लिए लागू होता है. ये स्क्रीन दवा की खोज के लिए अन्य लोगों के साथ, लेकिन यह भी पहचान लागू दवाओं के संभावित विषाक्त प्रभाव के विश्लेषण के साथ जोड़ा जा सकता है.

Disclosures

जेएस इस लेख में प्रयुक्त उपकरणों का उत्पादन है कि जीवन विज्ञान के तरीके BV के मालिक है.

Acknowledgments

हम एस के साथ हमें प्रदान करने के लिए Leonie डे बोअर और बास Zaat (शैक्षणिक मेडिकल सेंटर) के आभारी हैं epidermidis हे -47 तनाव. हम Copas एक्स्ट्रा लार्ज और विशाल BioImager विश्लेषण के साथ मदद और सलाह के लिए रीको Bongaarts, फ्रांसिस Smet और एंजेला comas (संघ Biometrica) धन्यवाद. हम मछली Caretaking, और उपयोगी विचार विमर्श के लिए लीडेन विश्वविद्यालय से अन्य सहयोगियों के लिए डेवी डे विट, उल्रिके Nehrdich, और लौरा वैन Hulst धन्यवाद. इस शोध सामग्री बायोमेडिकल संस्थान, आर्थिक मामलों के डच मंत्रालय द्वारा सह वित्त पोषित के अनुसंधान कार्यक्रम की परियोजना P5.03 इबीसा का एक हिस्सा है, और आर्थिक मामलों के मंत्रालय ने नीदरलैंड के स्मार्ट मिक्स कार्यक्रम (NWOA_6QY9BM) की और से शिक्षा, संस्कृति और विज्ञान के मंत्रालय ने नीदरलैंड. अतिरिक्त समर्थन यूरोपीय संघ परियोजना जेडएफ स्वास्थ्य (FP7 स्वास्थ्य 2009-242048) से प्राप्त किया गया था, और RMJ यूरोपीय संघ के प्रारंभिक प्रशिक्षण नेटवर्क FishForPharma (PITN-ga-201 में अनुभवी शोधकर्ता के रूप में मैरी क्यूरी फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया1-289209). SJR 115,337 ° अनुदान समझौते n के तहत अभिनव दवाओं पहल के संयुक्त उपक्रम से धन प्राप्त किया, संसाधनों, जिनमें से यूरोपीय संघ के सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम (FP7/2007-2013) और तरह contribution.The लेखकों में EFPIA कंपनियों आगे मानने से वित्तीय योगदान से बना रहे हैं रोबोटिक्स के लिए लीडेन विश्वविद्यालय कोष (LUF) से और Cyttron से वित्तीय सहायता, बदले में आर्थिक रूप से इमेजिंग सुविधाओं के लिए वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए नीदरलैंड संगठन द्वारा समर्थित है जो Besluit सब्सिडी Investeringen Kennisinfrastructuur कार्यक्रम में. Copas प्रणाली अधिग्रहण आंशिक रूप से वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए नीदरलैंड संगठन (NWO, 834.10.004) से वित्तीय सहायता के साथ पृथ्वी और लाइफ साइंसेज (ALW) के लिए विभाग द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Middlebrook 7H10 agar BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA 262710
Middlebrook 7H9 broth BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA 271310
BBL Middlebrook oleic acid albumin dextrose catalase (OADC) enrichment BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA 211886
BBL Middlebrook albumin dextrose catalase (ADC) enrichment BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA 211887
LB agar Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA L5542 Multiple suppliers
LB broth Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA L3022 Multiple suppliers
Chloramphenicol Bio-connect, Huissen, the Netherlands 16785.03 Multiple suppliers
Hygromycin Bio-connect, Huissen, the Netherlands 25966.01 Multiple suppliers
Tween-80 Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA P1754 Multiple suppliers
Polyvinylpyrrolidone40 Calbiochem, San Diego, California, USA 529504 Multiple suppliers
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA A5040
Agarose Sphaero-Q, Gorinchem, the Netherlands S103 Multiple suppliers
Instant ocean sea salt Sera Marin, Heinsberg, Germany 5460
iSPAWN Techniplast, Buguggiate, Italy iSPAWN
Automated microinjection system Life Science Methods BV, Leiden, the Netherlands Automated microinjection system
Complex Object Particle Analyzer and Sorter XL (COPAS XL) Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA COPAS XL
Vertebrate Automated Screening Technology BioImager (VAST BioImager) Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA VAST BioImager
LP Sampler Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA LP Sampler
Confocal laser scanning microscope Leica Microsystems, Wetzlar, Germany TCS SL
Injection needle 10 µm inner diameter Qvotek, Mississauga, Canada

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References

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संक्रमण अंक 88 zebrafish, स्वचालित इंजेक्शन उच्च throughput प्रदर्शन Copas एक्स्ट्रा लार्ज विशाल BioImager मेजबान रोगज़नक़ बातचीत दवा स्क्रीन CLSM
स्थापना और अध्ययन करने के लिए एक उच्च throughput सेटअप का अनुकूलन<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; और<em&gt; माइकोबैक्टीरियम marinum</em&gt; संक्रमण ड्रग डिस्कवरी के लिए एक मॉडल के रूप में
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Veneman, W. J., Marín-Juez, R., de Sonneville, J., Ordas, A., Jong-Raadsen, S., Meijer, A. H., Spaink, H. P. Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery. J. Vis. Exp. (88), e51649, doi:10.3791/51649 (2014).

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