Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

إنشاء والأمثل لإعداد إنتاجية عالية لدراسة Published: June 26, 2014 doi: 10.3791/51649
Automatic Translation
*1, *2, 3, 1, 2, 1, 1
1Institute of Biology, Leiden University, 2ZF-screens BV, 3Life Science Methods BV
* These authors contributed equally

Summary

توضح هذه المقالة الفيديو خط أنابيب الإنتاجية العالية التي أنشئت بنجاح لتصيب وتحليل أعداد كبيرة من الأجنة الزرد توفير أداة قوية جديدة لاختبار المركب واكتشاف المخدرات باستخدام كله كائن فقاري الحيوان.

Abstract

الزرد أصبحت أداة قيمة في المرحلة قبل السريرية من العروض اكتشاف المخدرات كنموذج الحيوان كله مع إنتاجية عالية الاحتمالات الفرز. أنها يمكن أن تستخدم لردم الهوة بين المقايسات الخلية التي يوجد مقرها في المراحل السابقة والتحقق من صحة في الجسم الحي في نماذج الثدييات، والحد، وبهذه الطريقة، فإن عدد المركبات التي تمر عبر لإجراء تجارب على نماذج القوارض أكثر تكلفة بكثير. في ضوء ذلك، في مخطوطة موجودة يوصف خط أنابيب إنتاجية عالية جديدة باستخدام الزرد كما هو الحال في الجسم الحي نظام نموذجي لدراسة المكورات العنقودية البشروية والعدوى marinum المتفطرة. هذا الإعداد يسمح توليد وتحليل عدد كبير من الأجنة المصابة متزامن متجانس. وعلاوة على ذلك المرونة في خط أنابيب يسمح للمستخدم لتنفيذ بسهولة منصات أخرى لتحسين القرار من تحليل عند الحاجة. مزيج من الزرد جنبا إلى جنب مع الشركة المصرية للاتصالات مبتكرة إنتاجية عاليةchnologies يفتح مجال اختبار المخدرات واكتشاف إمكانيات جديدة ليست فقط بسبب قوة باستخدام نموذج الحيوان كله ولكن أيضا بسبب وجود عدد كبير من خطوط المعدلة وراثيا المتاحة التي يمكن استخدامها لفك طريقة عمل مركبات جديدة.

Introduction

حتى الآن الزرد (دانيو rerio) وقد أنشئت بنجاح كنموذج فعال لدراسة مجموعة متنوعة من الأمراض المعدية 1. الجنين الزرد يوفر إمكانيات فريدة من نوعها في الجسم الحي التصوير بسبب شفافيتها وعدد كبير من خطوط مراسل المعدلة وراثيا الموجودة معربا عن البروتينات الفلورية. هذه تركيبة قوية يجعل من الممكن لتتبع مختلف أنواع الخلايا المناعية في الوقت المناسب أثناء التفاعل مع مسببات الأمراض مثل المتفطرة البحرية، وأقرب قريب من M. 2 السل، أو المكورات العنقودية البشروية، والمسبب الرئيسي لمادة بيولوجية العدوى المرتبطة 3-5. طرق مختلفة من العدوى يمكن أن تستخدم في الأجنة الزرد تبعا لأغراض الدراسة 6.

واحد من هذه المسارات العدوى حقن صفار من البكتيريا. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة بالمقارنة مع الآخرين هو أن infecti صفارلا يمكن أن يؤديها على تلقائيا عن طريق الحقن الروبوتية، والحد بشكل كبير من الوقت والسماح حقن استنساخ عالية من العدوى 7، 8.

العمل السابق، وذلك باستخدام الزرد باعتباره إنتاجية عالية في النظام النموذجي الجسم الحي لدراسة S. البشروية وM. أظهرت العدوى marinum أن تكون ناجحة 7، 8. هذا النظام قادر على كشف عن تطور المرض عن طريق الحقن الروبوتية صفار الأجنة المبكر وباستخدام مضان قراءات كإجراء لالحمولة الجرثومية. في اتفاق مع هذه الفكرة، وقد تم تحسين هذا الإعداد وإنشاء خط أنابيب إنتاجية عالية ذات كفاءة عالية مع القدرة على توليد عدد كبير من الأجنة المصابة متجانس وتتبع تطور العدوى خلال فترة بعد العلاج مع عدد من المركبات. مع الإعداد أنشئت فمن الممكن أن تولد ما يصل إلى 8،000 الأجنة متزامن إلى الشاشةلتطور المرض، وتجهيز بهذه الطريقة تصل إلى 2،500 الأجنة في الساعة. يتم فرز الأجنة على أساس حمولتها البكتيرية باستخدام نظام آلي، وضمان مجموعات متجانسة من اليرقات المصابة. علاوة على ذلك، للتحقق من صحة الإعداد، قد تم اختبارها آثار إشارة معروفة لمنع تطور مرض السل في الثدييات على أجنة مصابة M. marinum E11 سلالة أو أكثر ضراوة السلالة M 9.

توضح هذه الدراسة بالتفصيل خط أنابيب إنتاجية عالية التي أنشئت لتكون قادرة على توليد أعداد كبيرة من الأجنة المصابة وتحليلها لاحقا من تطور البكتيريا خلال التنمية وبعد العلاج المركب.

Protocol

1. السلالات البكتيرية وشروط النمو

  1. إعداد S. البشروية اللقاح
    1. يستغرق عدة مستعمرات فردية من S. المستمدة سلالة البشروية O-47، التي تحتوي على pWVW189 mCherry ناقلات التعبير (دي بوير L. غير منشورة) من لوريا BERTANI (LB) لوحة أجار تستكمل مع 10 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول والثقافة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في المتوسط ​​25 مل LB تستكمل مع 10 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول لmidlog المرحلة.
    2. الطرد المركزي 1 مل من ثقافة في 12،000 x ج لمدة 1 دقيقة ثم يغسل لهم 3x أخرى مع 1 مل العقيمة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) مع 0.3٪ (V / V) توين-80.
    3. قياس الكثافة البصرية في 600 نانومتر (OD 600)، وتمييع تعليق البكتيرية إلى OD 600 من 0.3 في 2٪ (ث / ت) بوفيدون 40 (حماية الأصناف النباتية 40) في برنامج تلفزيوني. ملاحظة: إن OD 600 من 0.3 إلى 1.0 يتوافق × 10 8 مستعمرة / مل (كفو / مل).
    4. إعداد م. marinum اللقاح
      1. يستغرق عدة مستعمرات فردية من M. marinum السلالة M أو E11 تحتوي على ناقلات pSMT3-mCherry معربا عن ثابت mCherry 10 من لوحة أجار 7H10 ميدلبروك مع 10٪ (V / V) لتخصيب ميدلبروك OADC تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل هيغروميسين والثقافة بين عشية وضحاها في 28 درجة مئوية في 10 مل من ميدلبروك 7H9 مرق مع 10٪ (V / V) لتخصيب ميدلبروك ADC تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل هيغروميسين.
      2. الطرد المركزي 1 مل من ثقافة في 12،000 x ج لمدة 1 دقيقة ثم يغسل 3x أخرى مع 1 مل PBS العقيمة مع 0.3٪ (V / V) توين-80.
      3. قياس OD 600، وتمييع تعليق البكتيرية إلى OD 600 من 0.3 في 2٪ (ث / ت) حماية الأصناف النباتية 40 في برنامج تلفزيوني. ملاحظة: إن OD 600 من 1 إلى 1.0 يتوافق × 10 8 كفو / مل.

    2. إعداد الزرد بيض

    1. وضع حد أقصى قدره 70 من الذكور و 50 من الإناث البرية تايالمؤسسة العامة الزرد بشكل منفصل في الإناء تربية الكبيرة. ملاحظة: ضع السمك الإناث في الجزء السفلي من السفينة تربية الكبيرة.
    2. إزالة فاصل في اليوم التالي في الصباح، للسماح للبدء تربية الزرد.
    3. جمع البيض في الجزء السفلي من السفينة من خلال تربية كبيرة جامع البيض في أنبوب 50 مل مملوءة بالماء البيض (60 ميكروغرام / مل ملح البحر المحيط لحظة).

    3. إبر الحقن

    1. الحصول المتاحة تجاريا العرف الشعيرات الدموية الزجاج الإبر مع قطرها الداخلي 10 ميكرون.

    4. مخطط التجريبية من حقن

    1. يغلي 100 مل من 1٪ (ث / ت) الاغاروز في الماء البيض، وبارد حتى ما يقرب من 40 درجة مئوية. صب الاغاروز في microinjectors وحة الآلي ووضع ختم 1،024 جيدا في الاغاروز. ملاحظة: لوحة جاهزة للاستخدام عند تبريده.
    2. على microinjector التشغيل الآلي البرامج، انقر على "معايرة المرحلة '،ثم انقر على '1024 'الشبكة بشكل جيد ووضع لوحة الاغاروز في microinjector ومعايرة لوحة من خلال النقر على الشاشة في موقف وسط من البئر.
    3. اذهب إلى "القائمة إبرة" وانقر على 'حامل معايرة الإبرة.
    4. ملء إبرة الحقن باستخدام تلميح microloader إما مع 10 ميكرولتر حماية الأصناف النباتية 40 تحتوي على 100 ​​وت م / NL S. البشروية أو 30 وت م / م NL marinum، أو استخدام الحقن حماية الأصناف النباتية 40 كما وهمية.
    5. وضع إبرة في الآلية الدقيقة حاقن ومعايرة س، ذ الموقف عن طريق خفض أو نقل ما يصل إبرة والنقر على الشاشة في موقف الإبرة. ثم معايرة موقف ض من الإبرة من خلال النقر على الشاشة في موقف غيض من الإبرة.
    6. توزيع البيض على الشبكة الاغاروز باستخدام الماصة نقل البلاستيك، وإزالة المياه الزائدة البيض. وضع الشبكة الاغاروز في microinjector الآلي.
    7. انتقل إلى "مباشرة صبن القائمة "وضبط" الضغط حقن 'الإعداد ل200 HPA،' الوقت حقن '0.2 ثانية و' ضغط التعويض '15 HPA، الذي يرتبط مع 1 NL، في قائمة الإعدادات Femtojet.
    8. انقر على 'حقن جميع' لحقن وحة كاملة.
    9. جمع البيض بعد الحقن عن طريق غسلها في طبق بتري (92 × 16 ملم)، وبحد أقصى 70 الأجنة في طبق بيتري، واحتضان عند 28 درجة مئوية.

    5. تحليل تدفق عداد الكريات-

    1. إعداد تدفق عداد الكريات الجسيمات الكبيرة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة وملء كوب عينة وغمد حاوية السائل مع الماء البيض.
    2. في برنامج التشغيل، انتقل إلى القائمة "PMT 'واستخدام الإعدادات التالية: 650 V ل' الأحمر 'وقناة V 0 ل' الأخضر 'وقنوات' صفراء '. ثم انتقل إلى القائمة "العتبات" واستخدام الإعدادات التالية: 'بصرياتل كثافة 'إشارة عتبة: 975 بالسيارات (القيمة COPAS XL: 50) و "وقت الرحلة" (TOF) الحد الأدنى إلى 320 μsec (COPAS XL القيمة: 800) وذلك للحد من تأثير الحطام.
    3. للتحليل دون فرز الأجنة انتقل إلى الخطوة 5.4، لتحليل وفرز الأجنة في طبق بتري انتقل إلى الخطوة 5.5 أو للتحليل وفرز الأجنة في لوحة 96 جيدا انتقل إلى الخطوة 5.6.
    4. وضع الأجنة في كأس عينة وانقر على "ابدأ" لبدء التحليل. عندما يتم تحليل جميع الأجنة وقف التحليل عن طريق النقر على 'توقف'. حفظ البيانات عن طريق النقر على 'تخزين جميع'. ملاحظة: يتم تخزين كافة البيانات في TXT، LMD، DAT، CSV وملفات BSRT. اتباع البروتوكول في خطوة 5.7.
    5. وضع الأجنة في كأس العينة وتحديد الحد الأقصى للأجنة في 70 لوحة ليتم فرزها عن طريق إدخال 70 في القائمة 'ترتيب'. وضع طبق بيتري فارغة تحت فارز وانقر على 'دليل الترتيب. عندما دي بتري شغل في ركلات الترجيح، وتوفير البيانات عن طريق النقر على 'تخزين جميع'. ملاحظة: يتم تخزين كافة البيانات في TXT، LMD، DAT، CSV وملفات BSRT. اتباع البروتوكول في خطوة 5.7.
    6. وضع الأجنة في كأس العينة وتحديد الحد الأقصى ل1 الجنين لكل بئر ليتم فرزها عن طريق إدخال 1 في القائمة 'ترتيب'. وضع فارغة لوحة 96 جيدا في حامل لوحة اليسار وانقر على 'املأ وحة'. عندما يتم تعبئة وحة 96 جيدا، وحفظ البيانات عن طريق النقر على 'تخزين جميع'. ملاحظة: يتم تخزين كافة البيانات في TXT، LMD، DAT، CSV وملفات BSRT. اتباع البروتوكول في خطوة 5.7.
    7. الحصول على ملف TXT لمعالجة البيانات الخام، واستخدام إعدادات التصفية البيانات التالية: "الحالة اختر ': 40، وإذا كان استخدام وحدة النوع" نوع الحالة ": 6 ثم استخدم الأرقام من مجموع إشارة مضان من' الأحمر 'قناة لحساب متوسط ​​والخطأ المعياري للمتوسط. رسم هذه مجموعات البيانات في شريط أو مبعثر الرسوم البيانية.
    ve_title "> 6. علاج المخدرات

    1. تحليل والفرز في 3 أيام بعد الحقن (نقطة في البوصة)، M. marinum إصابة الأجنة في مجموعتين متساويتين باستخدام تدفق الجسيمات الكبيرة عداد الكريات (الخطوة 5.5). علاج مجموعة واحدة مع مجمع المصالح في المذيبات الناقل وغيرها من المذيبات مع الناقل وحده (مراقبة). تطبيق علاجات مماثلة للسخرية السيطرة حقن لاختبار الآثار الجانبية للمضادات الحيوية.
    2. تكرار في 4 و 5 نقطة في البوصة تحليل (الخطوة 5.5) وتجديد الماء البيض أو البيض المياه التي تحتوي على مركب.

    7. التصوير عالية الدقة

    1. تخدير الأجنة مع 0.02٪ (ث / ت) مخزنة 3 أمينوبنزويك اثيل استر حامض (تريكين) في الماء البيض 10 دقيقة قبل التحليل.
    2. إعداد نظام تقنية فحص الفقارية الآلي والجسيمات عينات كبيرة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    3. حدد الصور المرجعية المقابلة لعمر الأجنة من 'التصوير - كائن211؛ إعداد كشف 'القائمة.
    4. حدد مقدار واتجاه الصور التي سيقوم بها نظام تكنولوجيا الفرز الآلي الفقارية من 'التصوير - مخزن السيارات الصور' القائمة.
    5. وضع لوحة 96 جيدا مليئة الأجنة (من الخطوة 5.6) في حامل لوحة الأيسر من الجسيمات عينات كبيرة، وانقر على "لوحة تشغيل.
    6. عندما تم الكشف عن الجنين وضعه بشكل صحيح؛ صورة الرأس والذيل منفصل مع CLSM باستخدام الهدف 10X الجافة عادي وغرزة الصور بعد ذلك باستخدام برامج معالجة الصور.

Representative Results

وتظهر النتائج ان خط الانابيب الحالي إنتاجية عالية لدراسة S. البشروية وM. وقد أنشئت العدوى marinum بنجاح والتي يمكن أن تمتد إلى نماذج العدوى الأخرى. أولا، استخدام سفينة كبيرة تربية (الشكل 1A)، استنادا إلى نظام نشرته Adatto وآخرون (2011) 11، وتمكن لتوليد أعداد كبيرة من البيض في وقت واحد واحد وتكفل الأحداث عنصر تحكم عالية من عملية وضع البيض. المقبل لتكون قادرة على حقن عدد كبير من الأجنة في فترة قصيرة من الزمن، تم استخدام نسخة محسنة من وضعت من قبل النظام الآلي لحقن الصغرى 7 (الشكل 1A). لتقييم الذي هو أفضل مرحلة تنموية للعدوى صفار، والحقن مع S. البشروية وM. أجريت marinum في جميع مراحل مختلفة بين 1 و 512 مرحلة الخلية، وفقا للوصف الذي أدلى به كيميل وآخرون (1995) 12

الحقن مع 100 وت م س. البشروية بين مرحلة 16 و 128 خلية تقديم أفضل نمط الإصابة (الشكل 2). البكتيريا انتشرت داخل صفار البيض لمدة 3 أيام وتنتشر في الجسم من 3 نقطة في البوصة فصاعدا. أداء الحقن قبل مرحلة 16 خلية أدى إلى ارتفاع معدل الوفيات من 4 نقطة في البوصة، والحقن بعد أن أظهرت المرحلة الخلية 256 نمو البكتيريا أساسا داخل صفار البيض مع أي البكتيريا تنتشر داخل الجسم من الجنين. تم إجراء القياس الكمي للعبء البكتيرية عن طريق تحليل كثافة مضان باستخدام تدفق عداد الكريات الجسيمات الكبيرة كما وصفها فينمان وآخرون (2013) 8 (الشكل 3).

أظهرت الملاحظات أن المرحلة التنموية المثلى للحقن من 30 م وت حقن marinum ما بين 16-128 مرحلة الخلية لسلالة E11 (الشكل 4A) وبين 16-64 مرحلة الخلية مع M الاجهاد أكثر ضراوةن (الشكل 4B). أظهرت الأجنة حقن في هذه المراحل نمو البكتيريا داخل صفار البيض وانتشار البكتيريا من خلال الجنين (الشكل 7). قدم العدوى مع كل من السلالات في المراحل المبكرة نمو البكتيريا المعمم غير محددة مما يؤدي إلى موت الأجنة بعد 4 نقطة في البوصة. من ناحية أخرى، في الأجنة حقن في مراحل لاحقة كان مقتصرا عبء البكتيرية للصفار.

المقبل، presorting مع الجسيمات الكبيرة تدفق عداد الكريات (الشكل 1B) ولدت مجموعات متجانسة كبيرة من الأسماك المصابة باستثناء الأجنة المصابة غير الحكومية أو غاية (أرقام 5A 6A و). بعد presorting، M. وعولج الأجنة المصابة marinum مع ريفامبيسين، وهو أول دواء خط لسل. أظهرت دراسات سابقة أن العلاج مع ريفامبيسين بجرعة 200 ميكرومتر يقلل كفاءة M. عدوى marinum في الزرد 7، 13. أخذ الميزه(ه) من عدد كبير من الأجنة المصابة متجانس ولدت مع إنتاجية عالية الإعداد والعلاج أجريت مع جرعات مختلفة. أجنة مصابة M. أظهرت marinum M سلالة وعلاجها لمدة 48 ساعة مع 12، 24، و 200 ميكرومتر ريفامبيسين للحد من العدوى الفطرية بكفاءة في جرعة تبعا للطريقة (الشكل 5B). نظرا لانخفاض كفاءة للعدوى باستخدام ريفامبيسين بجرعة 200 ميكرومتر كان يستخدم هذا التركيز على التجارب في المستقبل. تمشيا مع النتيجة السابقة، ودراسة تطور عبء البكتيرية باستخدام M. سلالة marinum E11 لوحظ انخفاض كبير على مدار 24 ساعة وما بعده بعد العلاج مع 200 ميكرومتر ريفامبيسين (الشكل 6B).

علاوة على ذلك، إذا كان مطلوبا التصوير التكبير عالية من هذه الأجنة، يمكن عرضها تلقائيا في لوحات 96 جيدا (الشكل 1C)، من حيث يمكن تحليل العينات باستخدامنظام تكنولوجيا الفرز الآلي الفقارية مع الجسيمات عينات كبيرة شنت على لCLSM.

نظام تكنولوجيا الفرز الآلي الفقارية مع الجسيمات عينات كبيرة هو النظام الذي يمكن إما أن يتم تنظيمها في الصعود إلى CLSM أو المجهر ستيريو. هذا الجهاز يسمح التحميل من أجنة حية أو الثابتة من 96 لوحة جيدا أو حاوية السوائب تلقائيا من خلال الزجاج الشعرية، ويرشد ذلك أمام الكاميرا في زاوية المطلوب (على سبيل المثال، أو الظهرية الجانبية). ويمكن إجراء صور للجنين في جميع التوجهات مع كاميرا على متن الطائرة أو مع CLSM الخارجية (الشكل 7). وبعد ذلك يتم نقل الأجنة في حاويات خاصة لجمع النفايات أو.

الشكل 1
الشكل 1. outl التجريبية تعميمالمعهد الوطني للإحصاء. أ) يتم وضع الأسماك الكبار معا لزميله، يتم جمع البيض والانحياز إلى لوحة الاغاروز وحقن باء) يتم تحضين البيض حقن عند 28 درجة مئوية، وسيتم فرزها قبل للعلاج من المخدرات ممكن. C) تحليل لاحقة من قبل كبير تدفق الجسيمات عداد الكريات و / أو عينات الجسيمات الكبيرة / الفقارية الآلي تقنية فحص مع CLSM. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الرقم 2. إنشاء خلية لأفضل مرحلة S. البشروية صفار الحقن. تم حقن الأجنة الزرد في صفار البيض في مراحل تنموية مختلفة 1-512 مرحلة الخلية مع 100 وت م س البشروية. حقن الأجنة بين 1 لأظهرت المرحلة الثانية 8 خلية نمو البكتيريا في صفار البيض وارتفاع معدل الوفيات من 4 نقطة في البوصة. أظهرت الأجنة حقن ما بين 16 و 128 خلية مرحلة نمو البكتيريا في صفار البيض وداخل الجسم ابتداء من الساعة 3 نقطة في البوصة. أظهرت الأجنة حقن بين المرحلة 256 و 512 خلية العديد من نمو البكتيريا داخل صفار البيض. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3
الرقم 3. الكمي لعبء البكتيرية باستخدام تدفق عداد الكريات الجسيمات الكبيرة. 100 وت م س تم حقن البشروية في صفار البيض من الأجنة الزرد. A) حتى 5 نقطة في البوصة، كل يوم، وكانت مجموعات من 10 أجنة المتجانس ومطلي مباشرة، والتي تبين أن متوسط ​​النمو الأسي على أساس نسختين متماثلتين البيولوجية (أشرطة الخطأ= SEM). B) كبير تدفق الجسيمات عداد الكريات تحليل يبين متوسط ​​إشارة مضان من غير حقن وS. حقن الأجنة البشروية. وقد تم تحليل 30-160 الأجنة في حالة (أشرطة الخطأ = SEM)، ورسائل مختلفة تشير إلى فروق ذات دلالة إحصائية عن طريق واحد أنوفا تليها اختبار توكي بعد مخصصة (P <0.001)، نانوثانية: لا فروق ذات دلالة إحصائية C) العلاقة بين وت و متوسط ​​إشارة مضان من مجموعات من 10 S. إصابة الأجنة البشروية (أشرطة الخطأ = SEM). تم تعديل هذا الرقم من فينمان وآخرون (2013) 8. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الشكل 4. establis لhment من أفضل مرحلة الخلية لM. marinum صفار الحقن. تم حقن الأجنة الزرد في جميع مراحل تنموية مختلفة 1-512 المرحلة زنزانة مع 30 وت م. marinum E11 وM السلالة. A، B) حقن الأجنة 1-8 مرحلة الخلية أظهرت مماثلة الانتشار والوفيات مع كل السلالات. حقن) الأجنة بين 16-128 مرحلة الخلية مع سلالة E11 أظهرت تشكيل حبيبية والعدوى النظامية في حين أن حقن أبقى من 256 إلى 512 مرحلة الخلية البكتيرية العبء في صفار البيض. B) الأجنة حقن بين 16-64 مرحلة الخلية مع M سلالة أظهرت تشكيل الورم الحبيبي مثل الهياكل والعدوى النظامية في حين أن حقن 128-512 مرحلة الخلية البكتيرية أبقى العبء في صفار البيض . الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5 الرقم 5. معاملة M. العدوى الحادة marinum مع المخدرات الخط الأول المضادة للسل. حقن الأجنة بين 16-64 مرحلة الخلية مع 30 وت م. تم تشغيل marinum M سلالة من خلال تدفق عداد الكريات الجسيمات الكبيرة في 3 نقطة في البوصة ليتم فرزها في مجموعتين بعد التخلص من غير و / أو الأجنة المصابة للغاية. A) الإسفار الأجنة الفردية في كلا المجموعتين. B) الأجنة تعامل مع ريفامبيسين (RIF ) لمدة 48 ساعة على جرعات من 12، 24، وحللت 200 ميكرومتر في 4 نقطة في البوصة؛ يتم تخفيض حمولتها البكتيرية بشكل كبير. C) لمحات COPAS الممثل الأجنة تعامل مع DMSO وريفامبيسين في جرعة من 12، 24، و 200 ميكرومتر لمدة 24 ساعة. يشار الحمولة الجرثومية والتوزيع من قبل القمم الحمراء. الخط الازرق يمثل الملف الشخصى عنصر فرز (4 DPF ه الزردmbryo) من قبل COPAS. وقد تم تحليل 60-90 الأجنة في حالة. كل نقطة بيانات يمثل الجنين الفردية. يشار إلى القيم كما يعني ± SEM. نانوثانية: الفروق لم تكن كبيرة. تم إجراء تحليل دلالة إحصائية الخلافات عن طريق واحد أنوفا تليها اختبار توكي posthoc. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 6
الرقم 6. علاج M. marinum عدوى مزمنة مع أول دواء خط لسل. حقن الأجنة بين 16-64 مرحلة الخلية مع 30 وت م. تم تشغيل سلالة marinum E11 من خلال تدفق الجسيمات الكبيرة في عداد الكريات 3 نقطة في البوصة ليتم فرزها في مجموعتين بعد التخلص من غير و / أو الأجنة المصابة للغاية. A) الإسفار الأجنة الفردية في كلا المجموعتين. B) وقد تم تحليل الأجنة تعامل مع ريفامبيسين (RIF) في 200 ميكرومتر خلال 4 أيام مما يدل على انخفاض كبير في الحمولة الجرثومية بعد 1 يوم من العلاج. وقد تم تحليل 90 الأجنة في حالة. يشار إلى القيم كما يعني ± SEM. رسائل مختلفة تشير إلى فروق ذات دلالة إحصائية بين نقاط الوقت من نفس العلاج. * يشير إلى فروق ذات دلالة إحصائية مع المجموعة الضابطة. نانوثانية: الفروق لم تكن كبيرة. تم إجراء تحليل دلالة إحصائية الخلافات عن طريق واحد أنوفا تليها اختبار posthoc توكي. (P <0.05). تم تعديل الرقم B) من Spaink وآخرون (2013) 13. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

hres.jpg "سرك =" / files/ftp_upload/51649/51649fig7.jpg "/>
الرقم 7. نتيجة M. تصوير marinum E11 حقن صفار باستخدام الفقارية الآلي تكنولوجيا الفحص وCLSM. متحد البؤر Z المكدس (مخيط 3 صور) من 5 نقطة في البوصة fli1-EGFP 14 الجنين. أ) الجنين لايف انتشار عرض من م. البكتيريا marinum E11 (الأحمر) في جميع أنحاء الجسم. B) ثابت 5 نقطة في البوصة FLI-EGFP الجنين تظهر M. البكتيريا marinum E11 (الأحمر) في جميع أنحاء الجسم توطين شارك مع كريات الدم البيضاء (الضوء الأزرق) الكشف عنها بواسطة L-15 بلاستين المناعية.

Discussion

منهجية إنتاجية عالية وصفها في هذه الورقة يوفر خط أنابيب فعالة من حيث التكلفة وسريعة لفحص عدد كبير من الأجنة الأسماك واليرقات مع أنواع مختلفة من الالتهابات. باستخدام سفينة تربية كبيرة بدلا من الدبابات تربية واحدة أو الأسرة التقليدية سهلت السيطرة على عملية التبويض وتوليد عدد أكبر من البيض متزامن. مع نسخة محسنة من نظام حقن الصغرى الآلي 7، فمن الممكن لحقن ما يصل إلى 2،500 بيضة تقريبا كل خلية في المرحلة نفسها في حدود 1 ساعة. مع هذه التحديثات وتحسين البرمجيات فمن الممكن لحقن المزيد من البيض مما كان ممكنا في السابق والتي يمكن استخدامها لأداء شاشات كبيرة مع انتشار المخدرات البكتيرية باعتبارها تلا. ولكن هذه الطريقة لا تزال تقتصر على صفار الحقن، حقن الطرق الأخرى على سبيل المثال التي وصفها بينارد وآخرون. (2012) 6، ونأمل أن تدمج في نظام حقن الصغرى الآلي في المستقبل القريب.

<ع الطبقة = "jove_content"> على الرغم من أن تقاس هذه الطرق لفحص الزرد، فإنه سيكون من المفيد للتطبيقات مع أنواع الأسماك الأخرى كذلك. على سبيل المثال، قد أشار الكارب الشائع لديها مزايا للشاشات المخدرات. مثل الزرد والبيض والأجنة في مرحلة مبكرة من الكارب الشائع وشفافية، ولكن مع الميزة الرئيسية لحجمها تفرخ كبيرة من مئات الآلاف من البيض وتوافر خطوط الفطرية التي تقدم خلفية وراثية أكثر ثباتا 16.

ويتم تحليل كميات كبيرة من الأجنة المصابة مع إنتاجية عالية كبيرة تدفق الجسيمات عداد الكريات. هذا الجهاز يمكن تحليلها نوع الأجنة في لوحات متعددة جيدا أو طبق بتري مما يجعلها مناسبة خاصة لاختبار أعداد كبيرة من المركبات. إذا كان هناك حاجة لقرار التصوير العالي، ويتم تكييف من الإعداد بطريقة تدفق الجسيمات الكبيرة عداد الكريات التكنولوجيا يمكن استخدامها للفحص المسبق، وبعد ذلك تحليل العينات في المتوسط ​​خلالوضعت بدقة أعلى. ويمكن أن يتم ذلك باستخدام تقنية فحص الفقارية الآلي 17، 18. هذا الجهاز يمكن أن تجمع تلقائيا الأجنة الحية أو الثابتة بين الإخصاب 2 و 7 أيام آخر من لوحة متعددة جيدا أو حاوية السوائب، الصورة 360 درجة من خلال الشعيرات الدموية باستخدام CLSM أو المجهر ستيريو والتصرف مرة أخرى في 2 حاويات السوائب السماح الفرز اليدوي للأجنة يستند على الصور المجهرية. وإدخال تحسينات في المستقبل تسمح للفرز الجنين بعد التصوير في لوحة جيدا متعددة، مما يجعل من الممكن لفحص عدد كبير من الأجنة الفردية تلقائيا بمرور الوقت مع CLSM. على افتراض أن يمكن أيضا أن تكون متصلا نظام تكنولوجيا فحص الفقارية الآلي في التطبيقات المستقبلية لتدفق الجسيمات الكبيرة عداد الكريات التكنولوجيا دون الحاجة اليرقات قبل صرفها في لوحات متعددة جيدا، وسوف يؤدي إلى فرز أكثر تقدما.

وتصف هذه الورقة مؤسسةد الأمثل من الإعداد إنتاجية عالية لدراسة S. البشروية وM. عدوى marinum كنموذج لاكتشاف المخدرات. فإنه يدل على أن نتائج هذه البكتيريا تحقن في صفار يعتمد على مرحلة تنموية من البيض في وقت الحقن. عن طريق الحقن M. marinum E11 في المرحلة 16-128 خلية أو سلالة M 16-64 في مرحلة الخلية يؤدي إلى نمط العدوى نفس المنوال الذيلية حقن 2، 6. ولكن هذا الإعداد لا يقتصر على انتشار مسببات الأمراض البكتيرية فقط. وقد تبين ذلك من قبل أنه من الممكن لحقن آليا المحاليل المحتوية على الحمض النووي، والجيش الملكي النيبالي أو morpholinos لنقل الجينات، والإفراط في التعبير الجيني وتدق إلى أسفل الدراسات، على التوالي 13. علاوة على ذلك، فقد تبين أن هذا الإعداد مفيد أيضا لدراسة انتشار الخلايا السرطانية والهجرة. لذا يقدم هذا الخط وسيلة تنوعا للشاشات إنتاجية عالية من مجموعة متنوعة من آليات إشارة في سياقالحصانة الفطرية، وتطبيقها على الأمراض المعدية وتطور السرطان. هذه الشاشات يمكن الجمع مع الآخرين لاكتشاف الدواء ولكن أيضا مع تحليل الآثار السامة المحتملة من الأدوية المطبقة التي تم تحديدها.

Disclosures

JS هو صاحب طرق علوم الحياة BV التي تنتج الأدوات المستخدمة في هذه المقالة.

Acknowledgments

نحن ممتنون ليوني دي بوير وباس زات (المركز الأكاديمي الطبي) لتزويدنا S. البشروية O-47 سلالة. نشكر ريكو بونجارتس، فرانسيس سميت وأنجيلا كوماس (الاتحاد Biometrica) طلبا للمساعدة والمشورة مع COPAS XL وتحليل BioImager الشاسعة. نشكر ديفي دي ويت، أولريك Nehrdich، ولورا فان هولست للأسماك كالة الاشراف على العقار، وزملاء آخرين من جامعة ليدن لإجراء مناقشات مفيدة. يشكل هذا البحث جزء من مشروع P5.03 IBIZA من برنامج البحوث في المعهد المواد الطبية الحيوية، بتمويل مشترك من قبل وزارة الشؤون الاقتصادية الهولندية، وبرنامج ميكس الذكية (NWOA_6QY9BM) من وزارة الشؤون الاقتصادية الهولندية و وزارة هولندا التعليم والثقافة والعلوم. تم الحصول على دعم إضافي من مشروع الاتحاد الأوروبي ZF-الصحية (FP7-الصحية 2009-242048)، وكان مدعوما من قبل RMJ ماري كوري الزمالة كما شهدت باحث في التدريب الأولي شبكة FishForPharma (PITN-GA-201 الاتحاد الأوروبي1-289209). تلقى SJR التمويل من الأدوية المبتكرة المبادرة المشتركة التعهد بموجب اتفاق منحة رقم 115337، والموارد التي تتكون من مساهمة مالية من برنامج الاتحاد الأوروبي الإطاري السابع (FP7/2007-2013) والشركات EFPIA في الكتاب contribution.The نوع تقر الدعم المالي من صندوق جامعة ليدن (LUF) لالروبوتات ومن Cyttron، في برنامج الإعانات Investeringen Kennisinfrastructuur Besluit، والذي بدوره يدعم ماليا من قبل المنظمة الهولندية للأبحاث العلمية لمرافق التصوير. وأيد اقتناء نظام COPAS جزئيا من قبل شعبة علوم الأرض والحياة (ALW) مع مساعدات مالية من المنظمة الهولندية للبحوث العلمية (NWO، 834.10.004).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Middlebrook 7H10 agar BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA 262710
Middlebrook 7H9 broth BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA 271310
BBL Middlebrook oleic acid albumin dextrose catalase (OADC) enrichment BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA 211886
BBL Middlebrook albumin dextrose catalase (ADC) enrichment BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA 211887
LB agar Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA L5542 Multiple suppliers
LB broth Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA L3022 Multiple suppliers
Chloramphenicol Bio-connect, Huissen, the Netherlands 16785.03 Multiple suppliers
Hygromycin Bio-connect, Huissen, the Netherlands 25966.01 Multiple suppliers
Tween-80 Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA P1754 Multiple suppliers
Polyvinylpyrrolidone40 Calbiochem, San Diego, California, USA 529504 Multiple suppliers
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA A5040
Agarose Sphaero-Q, Gorinchem, the Netherlands S103 Multiple suppliers
Instant ocean sea salt Sera Marin, Heinsberg, Germany 5460
iSPAWN Techniplast, Buguggiate, Italy iSPAWN
Automated microinjection system Life Science Methods BV, Leiden, the Netherlands Automated microinjection system
Complex Object Particle Analyzer and Sorter XL (COPAS XL) Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA COPAS XL
Vertebrate Automated Screening Technology BioImager (VAST BioImager) Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA VAST BioImager
LP Sampler Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA LP Sampler
Confocal laser scanning microscope Leica Microsystems, Wetzlar, Germany TCS SL
Injection needle 10 µm inner diameter Qvotek, Mississauga, Canada

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. Curr Drug Targets. 12, 1000-1017 (2011).
  2. Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis. Cell Microbiol. 10, 1027-1039 (2008).
  3. Boelens, J. J., et al. Biomaterial-associated persistence of Staphylococcus epidermidis in pericatheter macrophages. J Infect Dis. 181, 1337-1349 (2000).
  4. Broekhuizen, C. A., et al. Tissue around catheters is a niche for bacteria associated with medical device infection. Crit Care Med. 36, 2395-2402 (2008).
  5. Busscher, H. J., et al. Biomaterial-associated infection: locating the finish line in the race for the surface. Sci Transl Med. 4, (2012).
  6. Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. J Vis Exp. , (2012).
  7. Carvalho, R., et al. A high-throughput screen for tuberculosis progression. PLoS One. 6, (2011).
  8. Veneman, W. J., et al. A zebrafish high throughput screening system used for Staphylococcus epidermidis infection marker discovery. BMC Genomics. 14, 255 (2013).
  9. Sar, A. M., et al. Mycobacterium marinum strains can be divided into two distinct types based on genetic diversity and virulence. Infect Immun. 72, 6306-6312 (2004).
  10. Stoop, E. J. M., et al. Zebrafish embryo screen for mycobacterial genes involved in the initiation of granuloma formation reveals a newly identified ESX-1 component. Disease Model., & Mechanisms. 4, 526-536 (2011).
  11. Adatto, I., et al. A new system for the rapid collection of large numbers of developmentally staged zebrafish embryos. PLoS One. 6, (2011).
  12. Kimmel, C. B., et al. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
  13. Spaink, H. P., et al. Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models. Methods. 62, 246-254 (2013).
  14. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev Biol. 248, 307-318 (2002).
  15. Mathias, J. R., et al. Live imaging of chronic inflammation caused by mutation of zebrafish Hai1. J Cell Sci. 120, 3372-3383 (2007).
  16. Henkel, C. V., et al. Comparison of the exomes of common carp (Cyprinus carpio) and zebrafish (Danio rerio). Zebrafish. 9, 59-67 (2012).
  17. Chang, T. -Y., et al. Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing. Lab on a Chip. 12, 711 (2012).
  18. Pardo-Martin, C., et al. High-throughput in vivo vertebrate screening. Nature Methods. 7, 634-636 (2010).

Tags

العدوى، العدد 88، الزرد،
إنشاء والأمثل لإعداد إنتاجية عالية لدراسة<em&gt; المكورات العنقودية البشروية</em&gt; و<em&gt; المتفطرة البحرية</em&gt; عدوى نموذجا لاكتشاف المخدرات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Veneman, W. J., Marín-Juez, R., … More

Veneman, W. J., Marín-Juez, R., de Sonneville, J., Ordas, A., Jong-Raadsen, S., Meijer, A. H., Spaink, H. P. Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery. J. Vis. Exp. (88), e51649, doi:10.3791/51649 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter