Summary
Denne video artikel beskriver high throughput pipeline, som er blevet oprettet til at inficere og analysere store mængder af zebrafisk embryoner leverer et nyt stærkt værktøj til sammensatte test og lægemiddelforskning ved hjælp af et helt dyr hvirveldyr organisme.
Abstract
Zebrafisk bliver et værdifuldt redskab i den prækliniske fase af lægemiddelforskning screeninger som en helhed dyremodel med high throughput screening muligheder. De kan bruges til at bygge bro mellem cellebaserede assays på tidligere stadier og in vivo validering i pattedyr modeller, reducerer på denne måde, at antallet af forbindelser, der passerer igennem til test på de meget dyrere gnavermodeller. På denne baggrund er i den nuværende manuskript beskrevet en ny high throughput rørledning ved hjælp af zebrafisk som in vivo model for studiet af Staphylococcus epidermidis og Mycobacterium marinum infektion. Denne opsætning giver mulighed for generering og analyse af et stort antal synkrone embryoner homogent inficeret. Desuden fleksibiliteten af rørledningen giver brugeren mulighed for nemt at gennemføre andre platforme for at forbedre opløsningen af analyse, når det er nødvendigt. Kombinationen af zebrafisk sammen med innovative high throughput technologies åbnes inden for drug test og opdagelsen af nye muligheder, ikke kun på grund af styrken ved at anvende et helt dyr model, men også på grund af det store antal af transgene linier til rådighed, der kan anvendes til at dechifrere virkningsmekanisme af nye forbindelser.
Introduction
Til dato den zebrafisk (Danio rerio) er blevet oprettet som en effektiv model til at studere en række infektionssygdomme 1. Zebrafisk embryo tilbyder unikke in vivo billeddannelse muligheder på grund af deres gennemsigtighed og det store antal eksisterende transgene reporter linier udtrykker fluorescerende proteiner. Denne kraftfulde kombination gør det muligt at spore forskellige immun celletyper i tiden, mens interagere med patogener, såsom Mycobacterium marinum, den nærmeste slægtning til M. tuberkulose 2 eller Staphylococcus epidermidis, den vigtigste sygdomsfremkaldende af biomateriale associeret infektion 3-5. Forskellige smitteveje kan bruges i zebrafisk embryoner afhængigt henblik på undersøgelsen 6.
En af disse smitteveje er æggeblomme injektion af bakterier. Den væsentligste fordel ved denne metode i forhold til de andre, er, at blommen infectiden kan udføres automatisk via robot injektion, en markant reduktion injektionstiden og tillader høj reproducerbarhed af infektionen 7, 8.
Tidligere arbejde under anvendelse af zebrafisk som en high throughput in vivo-model-system til undersøgelse af S. epidermidis og M. marinum infektion viste sig at være en succes 7, 8. Dette system er i stand til at screene for sygdomsprogression via robot æggeblomme injektion af tidlige embryoner og bruge fluorescensudlæsning som en foranstaltning til den bakterielle belastning. I overensstemmelse med dette begreb har denne opsætning blevet optimeret og etableret en yderst effektiv high throughput pipeline med potentiale til at generere et stort antal af ensartet inficerede fostre og spore progression af infektion i tiden efter behandling med en række forbindelser. Med den etablerede setup er det muligt at generere op til 8.000 synkrone embryoner til at screenefor sygdomsprogression, behandling på denne måde op til 2.500 embryoner timen. Embryoer sorteret baseret på deres bakterieindhold ved hjælp af et automatiseret system, der sikrer homogene grupper af inficerede larver. Endvidere at validere setup, effekter af henvisningen kendt for at forebygge tuberkulose progression i pattedyr er blevet afprøvet på embryoer inficeret med M. marinum E11 stamme eller den mere ondartet M stamme 9.
Denne undersøgelse beskriver detaljeret high throughput rørledning, der er blevet fastslået at være i stand til at frembringe store antal inficerede embryoner og den efterfølgende analyse af den bakterielle progression under udviklingen og efter behandling med forbindelsen.
Protocol
1.. Bakteriestammer-og vækstbetingelser
- Forbered S. epidermidis Inokulum
- Tag flere individuelle kolonier fra S. epidermidis stamme O-47, der indeholder en pWVW189 afledt mCherry ekspressionsvektor (De Boer L. upubliceret) fra en Luria Bertani (LB) agarplader suppleret med 10 ug / ml chloramphenicol og kultur natten over ved 37 ° C i 25 ml LB-medium suppleret med 10 ug / ml chloramphenicol til midlog fase.
- Centrifugeres 1 ml af kulturen ved 12.000 x g i 1 min og derefter vaske dem 3x med 1 ml sterilt phosphatbufret saltvand (PBS) med 0,3% (v / v) Tween-80.
- Mål den optiske densitet ved 600 nm (OD 600), og fortynd den bakterielle suspension til en OD600 på 0,3 i 2% (w / v) polyvinylpyrrolidon 40 (PVP 40) i PBS. Bemærk: En OD600 på 0,3 svarer til 1,0 x 10 8 kolonidannende enheder / ml (cfu / ml).
- Forbered M. marinum Inokulum
- Tag flere individuelle kolonier fra M. marinum stamme M eller E11 indeholdende pSMT3-mCherry vektor stabilt udtrykker mCherry 10 fra en Middlebrook 7H10 agar plade med 10% (v / v) Middlebrook OADC berigelse suppleret med 50 ug / ml hygromycin og kultur natten over ved 28 ° C i 10 ml Middlebrook 7H9 bouillon med 10% (v / v) Middlebrook ADC berigelse suppleret med 50 ug / ml hygromycin.
- Centrifugeres 1 ml af kulturen ved 12.000 x g i 1 min og derefter vaske det 3x med 1 ml steril PBS med 0,3% (v / v) Tween-80.
- Måle OD600 og fortyndes bakteriesuspensionen til en OD600 på 0,3 i 2% (w / v) PVP 40 i PBS. Bemærk: En OD600 på 1 svarer til 1,0 x 10 8 cfu / ml.
2.. Forbered zebrafisk Æg
- Placer maksimalt 70 mandlige og 50 kvindelige vilde type zebrafisk separat ind i den store opdrætningsbassin. Bemærk: Placer hunfisken i den nedre del af det store opdrætningsbassin.
- Fjern separator den næste dag om morgenen, for at lade zebrafisk starte avl.
- Indsamle æg i bunden af det store avl beholderen gennem ægget samleren i et 50 ml rør fyldt med æg vand (60 ug / ml øjeblikkelig ocean havsalt).
3.. Kanyler
- Opnå kommercielt tilgængelige specialfremstillede glaskapillarer nåle med en indvendig diameter på 10 um.
4.. Eksperimentel Outline af Injection
- Kog 100 ml 1% (w / v) agarose i æg vand og afkøles indtil ca 40 º C. Hæld agarose i automatiserede microinjectors tallerken og placer 1.024-godt stempel i agarose. Bemærk: Pladen er klar til brug, når afkølet.
- På den automatiserede mikroinjektor operativsystem softwaren klikker du på "Kalibrer stage«,klik derefter på '1024 'godt nettet og placere agarose plade i mikroinjektor og kalibrere pladen ved at klikke på skærmen på midterposition af brønden.
- Gå til "nål menu 'og klik på' kalibrere nål indehaver«.
- Fyld kanylen ved hjælp af en microloader spids med enten 10 ul pvp 40 indeholdende 100 cfu / nl S. epidermidis eller 30 cfu / nl M. marinum eller brug pvp 40 som mock injektion.
- Placer nålen i automatiserede mikro-injektor og kalibrere x, y position ved at sænke eller flytte nålen op og klikke på skærmen ved positionen af nålen. Kalibrer z position af nålen ved at klikke på skærmen ved positionen af spidsen af nålen.
- Fordel æg over agarose gitter med en plastik overførselspipette, og fjerne overskydende æg vand. Placer agarose nettet i den automatiserede mikroinjektor.
- Gå til 'injection menu 'og juster "Indsprøjtningstryk' indstilling til 200 hPa," Injection tid "0,2 sek og" Kompensation pres «15 hPa, som korrelerer med 1 nl, på menuen FemtoJet indstillinger.
- Klik på 'indsprøjtes all' for at injicere hele pladen.
- Indsamle æg efter indsprøjtning ved at vaske dem i en petriskål (92 x 16 mm), med et maksimum på 70 embryoner pr petriskål og inkuberes ved 28 ° C.
5.. Flow-cytometer Analysis
- Forbered store partikler flowcytometer ifølge producentens anvisninger og fylde prøvekop og kappe væskebeholder med æg vand.
- Ved drift software, gå til "PMT-menuen og brug følgende indstillinger: 650 V til 'Red' kanal og 0 V til 'Grøn' og 'Yellow' kanaler. Så gå til "Tærskler 'menu, og brug følgende indstillinger:' Optical tæthed «tærskel signal: 975 mV (Copas XL værdi: 50) og" Time Of Flight (TOF) minimum til 320 mikrosekunder (Copas XL værdi: 800) med henblik på at reducere indflydelsen af vragrester.
- Til analyse uden at sortere de befrugtede æg gå til trin 5.4, til analyse og sortering af fostre i en petriskål gå til trin 5.5 eller til analyse og sortering af fostre i en 96-brønds plade gå til trin 5.6.
- Placer embryoner i prøven kop og klikke på 'start' for at starte analysen. Når alle embryoner analyseres stoppe analysen ved at klikke på "stop". Gem dataene ved at klikke på "Gem alle". Bemærk: Alle data gemmes som TXT, LMD, DAT, CSV og BSRT filer. Følg protokollen på trin 5.7.
- Placer embryoner i prøven kop og definere maksimalt 70 embryoner per plade skal sorteres ved at indtaste 70 i 'Sort' menuen. Placer en tom petriskål under sorteringsanlæg og klik på 'Manual Sort'. Når Petri di sh er fyldt, skal du gemme dataene ved at klikke på 'Gem alle ". Bemærk: Alle data lagres som TXT, LMD, DAT, CSV og BSRT filer. Følg protokollen på trin 5.7.
- Placer embryoner i prøven kop og definere maksimalt 1 foster per brønd skal sorteres ved at indtaste 1 i 'Sort' menuen. Placer en tom 96-brønds plade i venstre pladeholderen og klik på 'Fyld plade'. Når 96-brønds plade er fyldt, skal du gemme dataene ved at klikke på 'Gem alle ". Bemærk: Alle data lagres som TXT, LMD, DAT, CSV og BSRT filer. Følg protokollen på trin 5.7.
- Få den TXT-fil til at behandle de rå data, skal du bruge følgende data filter indstillinger: 'Status Vælg': 40, og hvis du bruger den slags modul "status slags ':. 6 Da bruge tallene fra det samlede fluorescens signalet fra' Red 'kanal til at beregne gennemsnit og standardfejlen af middelværdien. Plot disse datasæt i bar eller scatter grafer.
- Analysere og sortere på 3 dage efter injektion (dpi), M. marinum smittet embryoner i to lige store grupper ved hjælp af den store partikel flowcytometer (trin 5.5). Behandling af én gruppe med en forbindelse af interesse i sin bæreropløsningsmiddel og andre med bæreopløsningsmidlet alene (kontrol). Anvende lignende behandlinger at håne injiceret kontrol til test for antibiotika bivirkninger.
- Gentag på 4. og 5. dpi analysen (trin 5.5) og opfriske æg vand eller æg vand, der indeholder stoffet.
7.. High Resolution Imaging
- Bedøver embryoner med 0,02% (w / v) bufret 3-aminobenzoesyre-ethylester (tricaine) i æg vand 10 minutter før analyse.
- Forbered hvirveldyr Automatiseret Screening Technology, og Large Particle Sampler i henhold til producentens anvisninger.
- Vælg de reference billeder, der svarer til en alder af embryoner fra "Imaging - Object211; Opsætning Detection 'menu.
- Vælg den mængde billeder og orientering, der skal foretages af hvirveldyr Automated Screening Technology systemet fra "Imaging - Auto gemme billeder 'i menuen.
- Placer en 96-brønds plade fyldt med embryoner (fra trin 5.6) i den venstre plade indehaveren af store partikler Sampler, og klik på 'Kør plade'.
- Når der registreres et foster og korrekt placeret; billede hovedet og halen separat med CLSM ved hjælp af en 10X almindelig tør mål og sy billederne bagefter ved hjælp af billedbehandling software.
Representative Results
De foreliggende resultater viser, at den højt gennemløb rørledningen at studere S. epidermidis og M. marinum infektion er blevet oprettet, og som kan udvides til andre infektionsmodeller. For det første er anvendelsen af store opdrætningsbassin (figur 1A), der er baseret på den offentliggjorte system ved Adatto et al. (2011) 11, gør det muligt at frembringe store antal synkrone æg i enkeltstående begivenheder der giver en høj kontrol af gydning processen. Desuden kunne injicere store antal embryoer i en kort periode, en forbedret version af den tidligere udviklet automatiserede mikroinjektion systemet 7 blev anvendt (Figur 1A). At vurdere som er den bedste udviklingsstadiet for æggeblomme infektion, injektioner med S. epidermidis og M. marinum blev udført på alle de forskellige stadier mellem 1 og 512 celle stadiet, ifølge beskrivelsen fra Kimmel et al. (1995) 12.
Injektioner med 100 cfu S. epidermidis mellem 16 og 128 cellestadiet forudsat den bedste infektion mønster (figur 2). De bakterier spredt inde i blommen i 3 dage og spredes i kroppen fra 3 dpi fremefter. Udførelse injektioner før 16 celle scenen førte til høj dødelighed fra 4 dpi, og injektion efter 256 celle scenen viste primært bakterievækst inde i blommen med næppe nogen bakterier sprede sig i kroppen af embryoet. Kvantificering af bakteriel belastning blev udført ved fluorescensintensitet analyse under anvendelse af store partikler flowcytometer som beskrevet af Veneman et al. (2013) 8 (figur 3).
Observationer viste, at den optimale udviklingsstadiet til injektion på 30 cfu M. marinum injektion er mellem 16-128 celle scenen for E11-stammen (figur 4A) og mellem 16-64 celle scenen med de mere virulente M strain (figur 4B). Embryoner injiceret på disse stadier viste bakterievækst inde blommen og spredning af bakterier gennem embryo (figur 7). Infektion med begge stammer på tidligere stadier præsenterede uspecifik generaliseret bakteriel vækst, der fører embryoner til at dø efter 4 dpi. På den anden side, bakteriel byrde i embryoner injiceret i senere faser var begrænset til æggeblomme.
Dernæst forsortering med stor partikel flowcytometer (Figur 1B) skabt store homogene grupper af inficerede fisk eksklusive ikke-eller meget inficerede embryoner (5A og 6A). Efter forsortering, M. marinum inficerede embryoer blev behandlet med rifampicin, en første linje antituberkuloseaktivitet stof. Tidligere studier har vist, at behandling med Rifampicin i en dosis på 200 uM reducerer effektivt M. marinum infektion i zebrafisk 7, 13. Tager advantage af det store antal af homogent inficerede embryoner genereret med højt gennemløb setup, behandling med forskellige doser blev udført. Embryoner inficeret med M. marinum M-stamme og behandlet i 48 timer med 12, 24 og 200 uM Rifampicin viste sig at reducere effektivt mycobakteriel infektion på en dosisafhængig måde (figur 5B). I lyset af den effektive reduktion af infektion ved anvendelse af Rifampicin i en dosis på 200 uM denne koncentration blev anvendt til de fremtidige eksperimenter. I tråd med den foregående resultat, studere bakteriel byrde progression hjælp M. marinum E11 stamme en signifikant reduktion i 24 timer og frem efter behandling med 200 uM Rifampicin blev observeret (figur 6B).
Desuden, hvis høj forstørrelse billeddannelse der kræves af disse embryoer, de kan vises automatisk i 96-brønds plader (figur 1C), hvorfra prøverne kan analyseres ved hjælp afhvirveldyr Automatiseret Screening Technology system med den store partikler Sampler monteret på en CLSM.
Den Vertebrate Automatiseret Screening Technology system med den store partikler Sampler er et system, der kan enten monteres på en CLSM eller stereo mikroskop. Denne enhed gør det muligt for lastning af levende eller faste embryoner fra en 96-brønds plade eller bulk container automatisk gennem et glas kapillar, og orienterer det foran kameraet i den ønskede vinkel (f.eks, bryst eller lateral). Billeder af embryoet i alle retninger kan gøres med om bord kamera eller med en ekstern CLSM (figur 7). Embryoner vil efterfølgende blive overført i samlingen eller affaldsbeholder.
Figur 1.. Mainstream eksperimentel outline. A) Voksne fisk er sat sammen for at parre, æg indsamles, rettet ind i en agarose plade og injiceres. B) De injicerede æg inkuberes ved 28 ° C og vil blive forsorteret til eventuel medicinsk behandling. C) Efterfølgende analyse af store partikel flowcytometer og / eller Stor Partikel Sampler / Vertebrate Automatiseret Screening Teknologi med CLSM. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2.. Etablering af bedste celle scenen for S. epidermidis æggeblomme injektion. Zebrafisk embryoner blev injiceret i blommen på forskellige udviklingsstadier 1-512 celle stadie med 100 cfu af S. epidermidis. Embryoner injiceret mellem 1 and 8 celle stadiet viste bakterievækst i æggeblomme og høj dødelighed fra 4. dpi. Embryoner injiceret mellem 16 og 128 cellestadiet viste bakterievækst i æggeblomme og inde i kroppen startende med 3 dpi. Embryoner injiceret mellem 256 og 512 celle stadie viste mange bakterievækst inde i blommen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Fig. 3. Kvantificering af bakteriel belastning ved hjælp af store partikler flowcytometer. 100 cfu af S. epidermidis blev injiceret i blommen i zebrafisk embryoner. A) Op til 5 dpi, hver dag, grupper af 10 fostre blev homogeniseret og belagt direkte, og viser den gennemsnitlige eksponentiel vækst baseret på to biologiske replikaer (fejlsøjler= SEM). B) store partikel flowcytometer analyse viser den gennemsnitlige fluorescens-signalet fra ikke-injicerede og S. epidermidis injicerede embryoner. 30-160 embryoner pr betingelse blev analyseret (fejlmargener = SEM), forskellige bogstaver angiver statistisk signifikante forskelle ved at envejs-ANOVA efterfulgt af Tukey post-hoc test (P <0,001), ns:. Ikke signifikante forskelle C) Sammenhæng mellem cfu og gennemsnitlig fluorescens signal grupper af 10 S. epidermidis inficerede embryoner (fejlsøjler = SEM). Dette tal er blevet ændret fra Veneman et al. (2013) 8.. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4.. Establishment af de bedste celle scenen for M. marinum æggeblomme injektion Zebrafisk embryoner blev injiceret på alle de forskellige udviklingsstadier 1-512 celle stadie med 30 cfu M.. marinum E11 og M stamme. A, B) Embryoner injiceret 1-8 cellestadiet viste lignende spredning og dødelighed med begge stammer. A) Embryoner injiceres mellem 16-128 cellestadiet med E11-stamme viste dannelse af granulomer og systemisk infektion, mens de injicerede 256-512 cellestadiet holdes bakterielle belastning i æggeblomme. B) Embryoner injiceres mellem 16-64 celle stadiet med M-stamme viste dannelse af granuloma lignende strukturer og systemisk infektion, mens de injiceret 128-512 cellestadiet holdes bakterielle belastning i blommen . Klik her for at se en større version af dette tal.
Fig. 5. Behandling af M. marinum akut infektion med en første-line anti-tuberkulose narkotika. Embryoner injiceret mellem 16-64 celle scenen med 30 cfu M. marinum M stamme blev kørt gennem den store partikel flowcytometer ved 3 dpi skal sorteres i to grupper efter kassere ikke-og / eller stærkt inficerede fostre. A) Fluorescens individuelle fostre i begge grupper. B) Embryoner behandlet med Rifampicin (RIF ) i 48 timer i doser på 12, 24 og 200 uM blev analyseret ved 4 dpi; deres bakteriebelastning bliver væsentligt reduceret. C) Repræsentative copas profiler af embryoer blev behandlet med DMSO og Rifampicin i doser på 12, 24 og 200 uM i 24 timer. Bakteriel belastning og distribution er angivet med de røde toppe. Blå linje repræsenterer profilen af elementet sorteres (4 dpf zebrafisk embryo) af copas. 60-90 embryoer pr betingelse blev analyseret. Hvert datapunkt repræsenterer et enkelt foster. Værdier er angivet som middelværdi ± SEM. ns: ikke signifikante forskelle. Analyse af statistiske signifikans af forskelle blev udført af envejs-ANOVA efterfulgt af Tukeys posthoc test. Klik her for at se en større version af dette tal.
Fig. 6. Behandling af M. marinum kronisk infektion med en første linje antituberkuloseaktivitet stof. Embryoner injiceret mellem 16-64 celle scenen med 30 cfu M. marinum E11 stamme blev kørt gennem den store partikel flowcytometer ved 3 dpi skal sorteres i to grupper efter kassere ikke-og / eller stærkt inficerede embryoner. A) Fluorescens af individuelle embryoer i begge grupper. B) Embryonerne blev behandlet med Rifampicin (RIF) ved 200 pM i 4 dage var analyseret viser en signifikant reduktion af den bakterielle belastning efter 1. behandlingsdag. 90 embryoner pr betingelse blev analyseret. Værdier er angivet som middelværdi ± SEM. Forskellige bogstaver angiver signifikante forskelle mellem tidspunkter i den samme behandling. * Angiver signifikante forskelle med kontrolgruppen. ns: ikke signifikante forskelle. Analyse af statistiske signifikans af forskelle blev udført af envejs-ANOVA efterfulgt af Tukeys posthoc test. (P <0,05). Figur B) er blevet ændret fra Spaink et al. (2013) 13.. Klik her for at se en større version af dette tal.
hres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51649/51649fig7.jpg "/>
Figur 7. Resultat af M. marinum E11 æggeblomme injektion filmede med Vertebrate Automatiseret Screening Teknologi og CLSM. Konfokal Z stak (syet 3 billeder) af et 5 dpi fli1-EGFP 14 foster. A) Levende embryo viser spredning af M. marinum E11 bakterier (røde) i hele kroppen. B) Fast 5 dpi Fli-EGFP foster viser M. marinum E11 bakterier (røde) i hele kroppen co-lokalisering med leukocytter (lyseblå) detekteres af L-plastin immunfarvning 15.
Discussion
Den high throughput metode som beskrevet i dette papir giver en hurtig og omkostningseffektiv rørledning til at screene et stort antal af fisk embryoner og larver med forskellige typer af infektioner. Brug den store avl fartøj i stedet for de traditionelle enkelt-eller familiemæssige avl tanke lettet styring af gyde-processen og generering af større antal synkrone æg. Med en forbedret version af den automatiserede mikroinjektion systemet 7, er det muligt at tilføre op til 2.500 æg næsten alle i den samme celle stadiet inden for 1 time. Med disse opdateringer og forbedret software er det muligt at injicere flere æg end tidligere var muligt, som kan bruges til at udføre store narkotika skærme med bakteriel spredning som en læst op. Men denne metode er stadig begrænset til æggeblomme injektion, andre injektionssteder ruter for eksempel beskrevet af Benard et al. (2012) 6, vil forhåbentlig blive indarbejdet i den automatiserede mikro-indsprøjtningssystem i den nærmeste fremtid.
<p class = "jove_content"> Selv om disse metoder er benchmarkes til screening zebrafisk, ville det være nyttigt for applikationer med andre fiskearter så godt. For eksempel har den almindelig karpe blevet angivet til at have fordele for narkotika skærme. Ligesom zebrafisk, æg og embryoer fra almindelig karpe tidlige er gennemsigtige, men med den største fordel af sin store spawn størrelse hundrede tusinder af æg og tilgængeligheden af indavlede linjer, der tilbyder en mere konstant genetisk baggrund 16.Analysen af store mængder inficerede embryoner gøres med højt gennemløb store partikler flowcytometer. Denne enhed kan sortere analyseret embryoner i multi brøndplader eller en petriskål gør det særligt velegnet til at teste et stort antal forbindelser. Hvis der er behov højere billedbehandling opløsning, end opsætningen er tilpasset på en sådan måde, at den store partikel flowcytometret teknologi kan bruges til pre-screening og efterfølgende analysere prøverne ved et medium gennembragt i en højere opløsning. Dette kan gøres ved hjælp af hvirveldyr Automated Screening Technology 17, 18. Denne enhed kan automatisk indsamle levende eller faste fostre mellem 2 og 7 dage efter befrugtning fra en multi godt plade eller bulk container, billede 360 ° gennem en kapillær hjælp CLSM eller stereo mikroskopi og bortskaffes igen i 2 bulkcontainere tillader manuel sortering af embryonerne baseret de mikroskopiske billeder. Fremtidige forbedringer vil gøre det muligt for sortering af embryo efter billeddannelse i multi godt plade, derfor gør det muligt at screene automatisk stort antal individuelle embryoner over tid med CLSM. Antages det, at i fremtidige ansøgninger hvirveldyr Automatiseret Screening teknologisk system kan også være forbundet med store partikler flowcytometer teknologi uden behov for forudgående udlevering larver i multi-brønds plader, vil føre til en mere avanceret sortering.
Dette papir beskriver oprettelsen af end optimering af et high throughput setup til at studere S. epidermidis og M. marinum infektion som en model for lægemiddelforskning. Det viser, at resultatet af disse bakterier injiceret i blommen afhænger af udviklingsstadiet af æggene på tidspunktet for injektion. Injektion af M. marinum E11 på 16-128 celle stadie eller M stamme på 16-64 celle stadium fører til samme infektion mønster som caudalvenen injektion 2, 6.. Denne opsætning er dog ikke begrænset til udbredelsen af kun bakterielle patogener. Det blev vist før, at det er muligt at robotersvejsede injicere opløsninger, der indeholder DNA, RNA eller morpholinos for gensplejsning, over-ekspression og gen knock-down undersøgelser henholdsvis 13. Desuden blev det vist, at denne opsætning er også nyttig til undersøgelse af cancercelleproliferation og migration. Derfor er denne rørledning præsenterer en alsidig fremgangsmåde til screeninger med højt gennemløb af forskellige signal mekanismer i forbindelseaf medfødte immunitet, anvendt på smitsomme sygdomme og udvikling af kræft. Disse skærme kan kombineres med andre for medicin opdagelse, men også med analyse af mulige toksiske effekter af identificerede gældende narkotika.
Disclosures
JS er ejer af Life Science Metoder BV, der producerer instrumenter, der anvendes i denne artikel.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for Leonie de Boer og Bas Zaat (Academic Medical Centre) for at give os den S. epidermidis O-47-stamme. Vi takker Rico Bongaarts, Francis Smet og Angela Comas (Union Biometrica) for hjælp og rådgivning med Copas XL og VAST BioImager analyse. Vi takker Davy de Witt, Ulrike Nehrdich og Laura van Hulst for fisk bevogtning og andre kolleger fra Leiden University for nyttige diskussioner. Denne forskning er en del af projektet P5.03 IBIZA af forskningsprogrammet for Biomedicinske materialer institut, co-finansieret af det hollandske økonomiministerium, og Smart Mix Program (NWOA_6QY9BM) i Holland økonomiministerium og Det nederlandske ministerium for uddannelse, kultur og videnskab. Yderligere støtte blev opnået fra EU-projektet ZF-sundhed (FP7-Sundhed-2009 til 242.048), og RMJ blev støttet af Marie Curie-stipendium som erfaren forsker i EU grunduddannelsesnet FishForPharma (PITN-GA-2011-289209). SJR modtaget støtte fra initiativet om innovative lægemidler fællesforetagende under tilskudsaftale nr. 115337 anslåede, midler, som er sammensat af finansielle bidrag fra Den Europæiske Unions syvende rammeprogram (FP7/2007-2013) og EFPIA selskaber i naturalier contribution.The forfattere anerkender endvidere økonomisk støtte fra Leiden University Fund (LUF) til robotteknik og fra Cyttron, i Besluit Tilskud Investeringen Kennisinfrastructuur program, som igen er støttet af den nederlandske Organisation for Videnskabelig Forskning for billeddannende. Systemet købet Den Copas blev delvist støttet af afdelingen for Jorden og Life Sciences (ALW) med finansiel støtte fra den nederlandske Organisation for Videnskabelig Forskning (NWO, 834.10.004).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Middlebrook 7H10 agar | BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA | 262710 | |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA | 271310 | |
| BBL Middlebrook oleic acid albumin dextrose catalase (OADC) enrichment | BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA | 211886 | |
| BBL Middlebrook albumin dextrose catalase (ADC) enrichment | BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA | 211887 | |
| LB agar | Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA | L5542 | Multiple suppliers |
| LB broth | Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA | L3022 | Multiple suppliers |
| Chloramphenicol | Bio-connect, Huissen, the Netherlands | 16785.03 | Multiple suppliers |
| Hygromycin | Bio-connect, Huissen, the Netherlands | 25966.01 | Multiple suppliers |
| Tween-80 | Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA | P1754 | Multiple suppliers |
| Polyvinylpyrrolidone40 | Calbiochem, San Diego, California, USA | 529504 | Multiple suppliers |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA | A5040 | |
| Agarose | Sphaero-Q, Gorinchem, the Netherlands | S103 | Multiple suppliers |
| Instant ocean sea salt | Sera Marin, Heinsberg, Germany | 5460 | |
| iSPAWN | Techniplast, Buguggiate, Italy | iSPAWN | |
| Automated microinjection system | Life Science Methods BV, Leiden, the Netherlands | Automated microinjection system | |
| Complex Object Particle Analyzer and Sorter XL (COPAS XL) | Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA | COPAS XL | |
| Vertebrate Automated Screening Technology BioImager (VAST BioImager) | Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA | VAST BioImager | |
| LP Sampler | Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA | LP Sampler | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | TCS SL | |
| Injection needle 10 µm inner diameter | Qvotek, Mississauga, Canada |
References
- Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. Curr Drug Targets. 12, 1000-1017 (2011).
- Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis. Cell Microbiol. 10, 1027-1039 (2008).
- Boelens, J. J., et al. Biomaterial-associated persistence of Staphylococcus epidermidis in pericatheter macrophages. J Infect Dis. 181, 1337-1349 (2000).
- Broekhuizen, C. A., et al. Tissue around catheters is a niche for bacteria associated with medical device infection. Crit Care Med. 36, 2395-2402 (2008).
- Busscher, H. J., et al. Biomaterial-associated infection: locating the finish line in the race for the surface. Sci Transl Med. 4, (2012).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. J Vis Exp. , (2012).
- Carvalho, R., et al. A high-throughput screen for tuberculosis progression. PLoS One. 6, (2011).
- Veneman, W. J., et al. A zebrafish high throughput screening system used for Staphylococcus epidermidis infection marker discovery. BMC Genomics. 14, 255 (2013).
- Sar, A. M., et al. Mycobacterium marinum strains can be divided into two distinct types based on genetic diversity and virulence. Infect Immun. 72, 6306-6312 (2004).
- Stoop, E. J. M., et al. Zebrafish embryo screen for mycobacterial genes involved in the initiation of granuloma formation reveals a newly identified ESX-1 component. Disease Model., & Mechanisms. 4, 526-536 (2011).
- Adatto, I., et al. A new system for the rapid collection of large numbers of developmentally staged zebrafish embryos. PLoS One. 6, (2011).
- Kimmel, C. B., et al. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Spaink, H. P., et al. Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models. Methods. 62, 246-254 (2013).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev Biol. 248, 307-318 (2002).
- Mathias, J. R., et al. Live imaging of chronic inflammation caused by mutation of zebrafish Hai1. J Cell Sci. 120, 3372-3383 (2007).
- Henkel, C. V., et al. Comparison of the exomes of common carp (Cyprinus carpio) and zebrafish (Danio rerio). Zebrafish. 9, 59-67 (2012).
- Chang, T. -Y., et al. Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing. Lab on a Chip. 12, 711 (2012).
- Pardo-Martin, C., et al. High-throughput in vivo vertebrate screening. Nature Methods. 7, 634-636 (2010).
