Rápido y preciso exhalado Amoníaco Medición

Introduction

El amoníaco es un subproducto ubicua de metabolismo de las proteínas ^1. Medición de amoniaco, por lo tanto puede ayudar a los médicos a evaluar diversas enfermedades y estados de bienestar ^2. Sin embargo, el amoniaco es difícil de medir con precisión, a través de la sangre o el aliento, debido a que es muy reactivo. Aunque se usa comúnmente, ensayos en sangre tienen numerosos inconvenientes, incluyendo preocupaciones básicas acerca de la precisión ^3. Pero el principal problema con los ensayos de sangre es la realidad de que sólo alguna vez recogidos episódicamente. Esto es importante porque la fisiología de amoníaco, al igual que la glucosa en sangre y muchos otros procesos metabólicos, son fluidos y siempre cambiante ^4. Por el contrario, los ensayos de respiración son totalmente no invasiva y rápida, lo que permite fácilmente medidas repetidas. Por lo tanto, la medición de amoniaco respiración es atractivo porque puede abordar una necesidad no cubierta de una manera única.

Colección aliento, sin embargo, presenta problemas únicos. Mientras que la flebotomía lleva inherente la JeoPardy de error en varias maneras impredecibles (por ejemplo, tiempo de torniquete, la contaminación sudor, hemólisis de glóbulos, retardo en la medición de laboratorio, etc ^5), los investigadores de medición de la respiración debe enfrentarse a un grupo diferente de nuevos desafíos: la variabilidad en la respiración, con la contaminación de mucosa oral o amoníaco bacteriana, la influencia de la humedad del aire y el aparato y temperatura ambiente, etc ^6. De hecho, no es prudente subestimar la tarea en la conexión de equipo experimental para los seres humanos utilizando procedimientos experimentales para descubrir la biología desconocido. En parte debido a estos obstáculos, respirar amoníaco aún no ha alcanzado su potencial.

Aquí, presentamos nuestro protocolo de medición de amoniaco aliento para obtener resultados rápidos y precisos. Nuestro protocolo tiene fuerza en tres áreas: el monitor, el sampler de la interfaz, y la atención a las influencias humanas. El monitor fue construido por colegas en la Universidad de Rice a lo descrito previamente ^7. La base de la MEAsurement es un cuarzo mejorada espectroscopia fotoacústica técnica (QEPAS) que emplea un tenedor de sintonía piezoeléctrico de cuarzo como un transductor acústico. Fotoacústica efecto se produce cuando las ondas acústicas son producidos por la absorción de la radiación láser modulado por especies de gases traza objetivo. El gas de traza se detectó utilizando una célula acústica que es acústicamente resonante a la frecuencia modulada. Longitud de onda de la absorción del amoníaco fue seleccionado que esté libre de interferencia espectral interfieran especies en el aliento. Para los propósitos de la medición aliento exhalado humana, las principales características de la pantalla incluyen una amplia gama de medición (de ~ 50 partes por mil millones, ppb a 5000 ppb al menos) y la velocidad (1 mediciones sec). La velocidad del monitor permite la resolución de tiempo durante todo el ciclo de respiración.

El monitor está acoplado a un muestreador de aire especialmente diseñado. La toma de muestras consiste en un sensor de presión y capnógrafo. Muestra y archivos en tiempo realmediciones de presión en la boca y dióxido de carbono, así como las concentraciones de amoníaco determinado por el sensor. Esta toma de muestras, por lo tanto, permite al técnico para evaluar la calidad del esfuerzo de respiración cuando se recoge la respiración. Esto nos permite exceder las recomendaciones para el análisis de aliento de óxido nítrico (FE _NO), propuesto por el grupo operativo de la American Thoracic Society / European Respiratory Society (ATS / ERS) ^8. Para todos muestras del aliento, se utilizó una válvula de una vía disponible en línea en el puerto de la boca de la toma de muestras aliento.

Debido a la velocidad del monitor y los controles de calidad proporcionada por el sampler, hemos sido capaces de evaluar cuidadosamente las influencias humanas ^9. La mayoría de los temas, por ejemplo, en un principio hiperventilar cuando se le indique para respirar. Otras influencias importantes, tales como el pH oral y enjuagues bucales, las temperaturas de la toma de muestras, el monitor y todos los tubos asociados, y el modo de respirar, se estudiaron a continuación, y son la base for los experimentos ilustrativos siguientes.

Por último, y quizás lo más importante, hay que destacar que varios grupos altamente experimentados están midiendo el aliento amoníaco utilizando completamente diferentes sensores de medición y procedimientos. Estos pueden tener ventajas y validez importantes. Una comparación completa está más allá del alcance de la presente ^10,11,12 trabajo.

Protocol

1. Preparación de Instrumentos

1. Encienda la fuente de alimentación externa a la plataforma de sensor óptico amoníaco, controlador de láser de diodo, una unidad electrónica de control a la medida (CEU), el muestreador de aire, bomba de aire, y un ordenador portátil.
2. Compruebe que tanto el tubo de escape y ventiladores de refrigeración del sensor de amoniaco están operando. NOTA: Se encuentra situada en la parte posterior del sensor, el segundo se encuentra dentro del sensor, que es fácilmente accesible.
3. Asegúrese de que el módulo de detección acústica y temperatura de la válvula de aguja están en 38,0 ° C mediante la comprobación de la pantalla digital situada en el lado de la caja de sensor de amoniaco. Espere unos 35 minutos desde el momento en que el sensor se suministra energía para que la temperatura se estabilice.
4. Establecer tubo de entrada y la temperatura de la boquilla a 55 ° C haciendo clic en un icono de nombre "ChangeT" que se encuentra en el escritorio del muestreador aliento. La temperatura puede ser cambiado haciendo clic en la flecha arriba o abajo seguido haciendo clic en "Actucomió Temp ". Haga clic en "Exit" para volver al escritorio. Deje que el sistema por lo menos 5 minutos para que la temperatura se estabilice. El mantenimiento de la temperatura de la toma de muestras y el tubo a 55 º C reduce al mínimo la pérdida de superficie de amoniaco.
5. Abra el software en la computadora portátil que controla el sensor de amoníaco. El programa se puede acceder dentro de una carpeta llamada "NH ₃ Programa Sensor Breath" en el escritorio. Dentro de esta carpeta, el usuario debe seleccionar el icono de "software principal labview". Esta carpeta contiene varias aplicaciones, pero el usuario debe seleccionar "Mainsequence.vi" para acceder a la interfaz deseada. Seleccione "Ejecutar" en la esquina superior izquierda de la pantalla. NOTA: Esto comienza la línea de bloqueo de secuencia de calibración. El láser del monitor QEPAS opera en una corriente óptima, que se selecciona durante un procedimiento de línea de bloqueo automático. Este proceso tendrá una duración aproximada de 25 min.
6. Crear una nueva sesión en la toma de muestras de tal manera que easesión sujeto ch tiene su propio archivo que se guarda en una memoria adjunta. NOTA: Esto se realiza mediante la apertura del programa "Sampler Aliento" que se encuentra en el escritorio del sampler. Hay espacio para identificar la sesión apropiadamente. Todos los datos generados durante la sesión se guardarán en la unidad flash en virtud de este identificador. La fecha del experimento se utiliza típicamente como parte del nombre de archivo. La entrada y la temperatura de la boquilla se deben ajustar antes de entrar en el programa de la respiración de muestreo.
7. Inserte una nueva boquilla desechable en la tubería de entrada. Use guantes desechables para evitar la contaminación de boquilla con el amoníaco de los dedos.

2. Respiración Sample Collection

NOTA: La Junta de Revisión Institucional correspondiente (Consejo de Ética) debe aprobar cualquier estudio que involucra sujetos humanos. Hay muchos factores que pueden influir drásticamente aliento amoníaco. Estos factores pueden alterar las mediciones de amoniaco por el aliento directamente unffecting niveles de amoníaco sistémicos o afectando el viaje de los metabolitos de respiración de los pulmones a la instrumentación.

1. Asegúrese sujetos llegan al laboratorio en ayunas, después de haber consumido ningún alimento durante aproximadamente 12 horas a la llegada y que se han abstenido de ejercicio por la mañana antes de la prueba.
2. Asegúrese de ninguna sustancia ha sido introducida en la boca por lo menos 1 hora antes de la recogida de datos. Asegúrese de que los sujetos se cepillan los dientes superior a 1 hora antes de la prueba.
3. Asiente el sujeto delante del sensor de amoníaco. Instruya al sujeto que mantenga la tubería de entrada y asegúrese de que no se toquen la boquilla para evitar la contaminación de amoníaco.
4. Haga clic en "Inicio" en la interfaz de sampler. Haga que el sujeto exhala en la boquilla durante el tiempo que pueden, o hasta que el operador considere que la muestra es suficiente. NOTA: Se trata de una sola exhalación completa de al menos 10 segundos. Presión en la boca se mide en tiempo real como un sustitutopara la tasa de flujo. Un medidor de presión de un código de colores ayuda a que el producto sujeto y mantener la presión de espiración deseado de 10 cm de agua, lo que representa una tasa de flujo de exhalación de 50 ml / seg. Se seleccionó este caudal, ya que ha sido adoptado por la ATS / ERS para el protocolo para determinar Fe _NO. Este caudal de exhalación es alcanzable por los niños y adultos. Del mismo modo tres exhalaciones reproducibles deben obtenerse que difieren en menos de 10%.
5. Haga clic en "Stop" en la interfaz de sampler cuando se completa la muestra de aliento.

3. Aliento medición de la muestra

1. Una vez que una muestra de aliento se ha analizado, el técnico de laboratorio de utilizar el monitor a continuación, tiene la capacidad de analizar cualquier segmento de que el perfil de la respiración. La porción de la respiración que es de interés es el segmento de la fase III. Este se caracteriza por una "meseta" en la concentración de dióxido de carbono y se encuentra en el centro para la etapa tardía de la BREath.
2. Seleccione la parte de fase III de la muestra arrastrando las líneas verticales en la interfaz de sampler para comenzar cuando mesetas de dióxido de carbono y detener justo antes de la caída de presión del aire. Consulte la Figura 1 para una aclaración.
3. Guarde los datos en la unidad flash haciendo clic en "Guardar" en la interfaz de pantalla táctil sampler.
4. Una vez que los datos se han almacenado de aliento, el usuario puede seleccionar en "Inicio" para iniciar una nueva muestra de aliento.

4. Ilustra los efectos de Enjuague Bucal y pH en amoníaco Breath

1. Muestra 3 respiraciones para establecer el nivel de amoníaco de línea de base. Asegúrese de que las respiraciones se toman al menos 5 minutos el uno del otro.
2. Enjuagar bien la boca con una alícuota de 30 ml de agua durante 60 segundos.
3. Se recoge una muestra de aliento dentro de 60 segundos del enjuague (Sección 2). Recoger muestras de aliento en el transcurso de la siguiente hora para observar el cambio en amoniaco con el tiempo. NOTA: Samplos se puede tomar tan frecuentemente como cada minuto, pero intervalos más largos se utilizan típicamente.
4. Enjuagar bien la boca con una alícuota de 30 ml de la solución básica (bicarbonato de sodio en agua) durante 60 segundos y repita 4.2.1.
5. Enjuagar bien la boca con una alícuota de 30 ml de solución ácida durante 60 segundos y repita 4.2.1.

5. Ilustra los efectos de las temperaturas de entrada y de transporte de tubos de amoníaco Breath

1. Ejemplos de tres respiraciones en el transcurso de 15 min con la temperatura de entrada fijada por debajo de la temperatura corporal, aproximadamente 30 ° C.
2. Aumente la temperatura de entrada y la tubería de transporte a 55 ° C, respectivamente, utilizando un icono de escritorio en la interfaz de pantalla táctil del muestreador aliento. Deje que el sistema por lo menos 5 minutos para alcanzar el estado de equilibrio.
3. Muestra 3 respiraciones, 5 min aparte en la entrada climatizada.

Representative Results

Los sujetos se pueden esperar para producir una amplia gama de niveles de amoniaco de respiración de línea de base. Las personas sanas pueden comenzar el día con una medición de amoniaco aliento de 100-1.000 ppb. Enjuagar la boca con el líquido cambia de inmediato la cantidad de aire amoníaco detectable. Fluidos neutros y ácidos típicamente cortan la cantidad de amoníaco observable por más de la mitad. Estos niveles luego regresan a la línea de base como los efectos de la enjuague desaparece. Los efectos del agua parecen disipar dentro de 15 min, mientras que un ácido puede mantener la respiración amoniaco detectable a un mínimo durante más de 2 horas. Un enjuague de base, tal como bicarbonato de sodio, se duplicará o triplicará la cantidad de aire amoníaco detectable antes de regresar a la línea de base en un período de 20 min. En particular, el peróxido de hidrógeno no parece afectar exhalado aliento amoniaco más que otros enjuagues; por lo tanto, no parece que las bacterias orales contribuyen significativamente a la medición de amoniaco aliento.

Como se señalóBove, el muestreador acoplado al sensor de amoniaco proporciona datos continuos un técnico puede utilizar para evaluar la calidad de una muestra de aliento. Presión en la boca y el dióxido de carbono son las dos características de una exhalación se utiliza para validar una muestra de aliento. Presión en la boca sirve como un sustituto para el flujo de aire desde los pulmones hacia el muestreador. El técnico debe asegurarse de que un sujeto está proporcionando suficiente flujo de aire alveolar, que contiene el metabolito de interés, en el monitor. Los técnicos deben esperar un rango normal de presión en la boca de 9-10,5 cm de agua. La exhalación debe ser bastante constante en el transcurso de 10-20 seg, que se manifiesta en la desviación estándar de la presión en la boca. Una desviación estándar de un soplo de calidad debe ser de menos de 1 cm de agua.

Medición de dióxido de carbono también es importante ya que permite la evaluación más cerca de proceso de la exhalación. Durante la fase I, se inicia la exhalación y la composición del gas exhalado se compone de predominantemente aire espacio muerto anatómico (~ 21% de oxígeno, dióxido de carbono 0,03%, 78% de nitrógeno, y 0,5% de agua), es decir., el aire que se respira en durante la fase de inhalación del ciclo de respiración anterior. Durante la Fase II, el gas alveolar pasa en el espacio muerto anatómico y se mezcla con el aire del espacio muerto residual con el resultado de que la concentración de dióxido de carbono aumenta rápidamente. La concentración de dióxido de carbono en el aliento exhalado sigue aumentando, aunque más lentamente, durante la exhalación la Fase III y el valor de pico (concentración final de marea) corresponde a la concentración de dióxido de carbono en la sangre venosa. Este aumento gradual en la concentración de dióxido de carbono durante la Fase III es debido a la mezcla de los gases alveolares con el resto del aire del espacio muerto y es debido a la lentitud vaciado de sacos alveolares. La composición de la respiración al final de la Fase III es de aproximadamente 13% de oxígeno, dióxido de carbono al 5%, 78% de nitrógeno, y 4% de agua. Los niveles de dióxido de carbono durante la porción de fase III de la breATH puede variar de 30-40 mmHg. Fase III corresponde al lugar en estos niveles de CO ₂ meseta (Figuras 1A-D).

Figura 1. Las muestras de aliento que integran la porción de fase III de los datos de aliento para varias enfermedades. 1a) Una muestra de aliento típico que integra la parte de la fase III de los datos de aliento. Las líneas verticales verdes y rojas marcan el lapso en el que la línea se va a analizar. Se ignoran las primeras porciones de la exhalación. 1b) El efecto de un aclarado ácido tiene en el aliento de amoníaco. La conversión de NH NH ₃ a ₄ ⁺ drásticamente disminuye la cantidad de amoníaco detectable. Disminución de los resultados de flujo en la reducción de amoniaco alveolar en el aliento como se ve en la muestra 1c. La disminución del flujo tiene not permite mayor cantidad de aire alveolar a muestrear. 1d) Una muestra de aliento que integra las fases I, II, y III. La inclusión de las fases I y II en el análisis reduce amoniaco y dióxido de carbono considerablemente. Esto es un reflejo inexacto de amoniaco sistémica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La mayoría de los sujetos son capaces de producir una respiración aceptable en su primer intento. Sin embargo, algunos temas requieren una repetición de la respiración. Además, tal como se registran la presión y dióxido de carbono, estos pueden también ser consideradas en el análisis de datos.

Discussion

Los beneficios de un procedimiento no invasivo capaz de detectar metabolitos traza en tiempo real son obvias. Sin embargo, el campo de la investigación aliento ha tenido problemas para cumplir con este potencial. La medición de la respiración es un proceso dinámico vulnerable a muchos factores de confusión. Nuestro enfoque tiene ventajas importantes: en concreto, la sensibilidad y la velocidad del monitor amoniaco basado Arroz QEPAS junto al muestreador aliento nos han permitido evaluar e identificar los factores de recogida de aliento germano a la medida exacta. Este enfoque es muy eficaz: por ejemplo, después de algunos experimentos preliminares, cada uno de los casi 500 puntos de datos individuales recogidos aliento para experimentos recientes fue consistente con los resultados esperados ^9.

Hasta que se comprenden mejor los diversos factores que afectan el aire exhalado de amoníaco, es importante proporcionar instrucciones detalladas y uniformes a los sujetos antes de la llegada. En la actualidad, por lo general, pedimos a los sujetosrápido después de la medianoche para la recolección de la mañana, lavarse los dientes más de 1 hora antes de la presentación, y evitar el ejercicio, el tabaquismo, o llenar los automóviles con combustibles derivados del petróleo. Aunque hemos evaluado los distintos alimentos regímenes de la tarde antes de la recolección de datos (por ejemplo, baja en fibra rica en fibra v), no hemos establecido que la dieta de datos de forma convincente los efectos iniciales de la mañana de la prueba. Colecciones de la mañana también minimizan el impacto de las variaciones diurnas aparente, que parecen ocurrir por motivos desconocidos ^13.

Puede haber otros métodos igualmente válidos o superiores para la recogida de amoniaco aliento exhalado. Es posible, por ejemplo, que un enjuague estándar en un punto antes de la recogida del aliento tiempo establecido podría resultar en la medición útil de amoniaco de la mucosa oral, que también puede reflejar los niveles sistémicos. Otra vía de acceso puede ser a abandonar la cavidad oral y medir amoniaco nasal o ambos ^10,14. Este último enfoque podría obviar la necesidad FOr el muestreador interfaz. Independientemente, cualquier método necesita considerar cuidadosamente una variedad de factores técnicos pertinentes a este metabolito volátil incluyendo humedad, temperatura, pH, flujo, así como la biología de la orofaringe.

Naturalmente, las suposiciones y creencias sobre el método de medición tienen influencia crítica en el análisis de datos. Creemos que la presión y el dióxido de carbono son aspecto clave de control de calidad. Sin embargo, no es cierto, por ejemplo, si el amoníaco debe ser reportado como medir, o dióxido de carbono-ajustado, con unidades como ppb o picomol. A medida que más experiencia y confianza se obtienen en las diversas fuentes técnicas de error, las complejas consideraciones predominantes en el análisis de datos entran en mayor concentración y se impulsará una mejor comprensión de la biología de este gran desafío. (Figura 2: Error aleatorio y no aleatorio de medición Verdadero Variabilidad Biológica Versus Un epifenómenos o B Biológica respiración anormal...y Factores orales / nasales o C y D. Rendimiento del equipo.)

La Figura 2. Diagrama de paciente a la interfaz de respiración a un monitor de amoníaco. A) Paciente que ser probado y es también la parte más impredecible del proceso de recolección de aliento. Alimentación de los pacientes, el ejercicio y el hábito de fumar pueden tener grandes impactos en la recopilación de datos. B) exhalaciones aliento son variables de persona a persona, por lo que un método para estandarizar las respiraciones es importante. Proporcionar una señal visual para proporcionar un flujo deseable de aire de los pulmones funciona bien para mantener exhalaciones uniforme. C) aparato de interfaz de respiración está estrechamente relacionado con B en la respiración que la consistencia es un factor importante en la comparación de los sujetos. El sampler inte alientorface permite al usuario ver diferentes parámetros de la muestra aliento en tiempo real. D) monitores de amoníaco pueden manifestarse con diferentes tecnologías. Cuarzo mejorada espectroscopia fotoacústica tiene muchos beneficios inherentes que se consideran ideales para el análisis del aliento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Limitaciones importantes para el presente método deben ser acreditados. Mientras que el muestreador es relativamente barato y portátil, el monitor de amoniaco, tal como está configurado en la actualidad, no es ni. Como resultado de ello, los sujetos tienen que venir a nuestro espacio dedicado investigación aliento, ya que no podemos mover fácilmente de nuestro equipo a la clínica. Este factor, junto con el requisito de que la respiración del sujeto exhalar un solo aliento largo, los impactos que los sujetos pueden ser estudiados (es decir, pacientes enfermos con cirrosis hepática, una población objetivo clave, a menudo son prácticasexcluidos ticamente). Además, dado que sólo tenemos un monitor, estamos limitados en el número de sujetos que pueden ser estudiados de manera realista en un protocolo dado. A su vez, esto afecta el tamaño de la muestra y el poder.

Como se señaló anteriormente, la colección de óxido nítrico fue estandarizado por el esfuerzo conjunto de la American Thoracic Society y la European Respiratory Society. Actualmente, no existe un acuerdo equivalente para respirar amoníaco, aunque varios grupos están haciendo contribuciones importantes para el avance de la medición de amoniaco aliento. Como la literatura sobre la medición de metabolito aliento rastro en general y, en particular, el amoníaco sigue evolucionando ¹⁵ sin duda habrá muchas modificaciones y mejoras en el futuro. Monitores que son más pequeños, más portátiles, y menos costoso son críticos para los ensayos clínicos multicéntricos de éxito.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rice Ammonia Monitor System	N/A	N/A	Not available for commercial purchase
Loccioni Breath Sampler	Loccioni Humancare	N/A	Single breath version
Disposable Mouth Piece	WestPrime Healthcare	G011-200	Manufacturer is AlcoQuant
Laptop	Lenovo	N/A	Old model no longer sold by manufacturer
Acid Rinse	N/A	N/A	Household acidic drink (coffee, soft drink, citrus juices, etc)
Base Rinse	N/A	N/A	Water mixed with a nonexact amount of sodium bicarbonate (Arm & Hammer Baking Soda)
Neutral Rinse	N/A	N/A	Water