Hurtig og præcis udåndingsluft Ammoniak Måling

Introduction

Ammoniak er en allestedsnærværende biprodukt af protein metabolisme ^1. Ammoniak-måling kan derfor hjælpe klinikere vurdere forskellige sygdomme og wellness-lande ^2. Imidlertid er ammoniak vanskeligt nøjagtigt at måle via blod eller ånde, fordi det er meget reaktiv. Selvom almindeligt anvendt, blod analyser har mange ulemper, herunder basale bekymringer nøjagtighed ^3. Men det største problem med blod analyser er den virkelighed, som de altid kun indsamlet episodisk. Dette er vigtigt, fordi ammoniak fysiologi, ligesom blodglucose og mange andre metaboliske processer, er flydende og stadigt skiftende ^4. I modsætning hertil ånde assays er fuldstændig ikke-invasiv og hurtig, hvilket let muliggør gentagne foranstaltninger. Således måling ånde ammoniak er attraktivt, fordi det kan afhjælpe en alvorlig udækket behov på en unik måde.

Breath indsamling,, præsenterer dog unikke bekymringer. Betragtninger tapning sagens natur bærer Jeopardy af fejl på flere uforudsigelige måder (f.eks tourniquet tid, sved forurening blodlegemer hæmolyse, forsinkelse i målingen laboratorium, osv. ⁵⁾ skal ånde måling forskere slås med en anden gruppe af nye udfordringer: variation i vejrtrækning, forurening med oralmucosal eller bakteriel ammoniak, påvirkning af omgivende luft og apparater luftfugtighed og temperatur, osv. ^6.. Ja, det er uklogt at undervurdere den opgave i at koble eksperimentelle udstyr til mennesker ved hjælp af eksperimentelle procedurer til at opdage ukendte biologi. Dels på grund af disse hindringer, har ånde ammoniak endnu ikke opfyldt sit potentiale.

Heri præsenterer vi vores åndedræt måling ammoniak protokol for hurtige og præcise resultater. Vores protokol har styrke i tre områder: monitoren, grænsefladen sampler, og opmærksomhed på de menneskelige påvirkninger. Skærmen er bygget af kolleger på Rice University som tidligere beskrevet ^7. Grundlaget for MEAsurement er et kvarts forbedret fotoakustisk spektroskopi (QEPAS) teknik, der anvender en piezoelektrisk kvarts stemmegaffel som en akustisk transducer. Fotoakustisk effekt opstår, når akustiske bølger fremstilles ved absorption af modulerede laserstråling ved målspor gasart. Sporgassen detekteres ved hjælp af en akustisk celle, der er akustisk resonans til modulerede frekvens. En absorption bølgelængde for ammoniak blev valgt, der er fri spektral interferens fra at blande arter i vejret. Ved anvendelsen af ​​udåndingsluft måling menneske, hovedtrækkene i monitoren omfatter en bred måleområde (fra ~ 50 dele pr milliard, ppb til mindst 5.000 ppb) og hastighed (1 sek målinger). Hastigheden af ​​skærmen muliggør tidsopløsning hele åndedrag cyklus.

Skærmen er koblet til en specielt designet ånde sampler. Sampleren består af en tryksensor og capnograph. Det viser og arkiverer realtidmålinger af munden tryk og kuldioxid samt ammoniak koncentrationer bestemt af sensoren. Denne sampler, derfor gør det muligt for teknikeren at evaluere kvaliteten af ​​åndedrættet indsats som åndedrættet opsamles. Dette gør det muligt for os at overskride anbefalingerne for at analysere ånde nitrogenoxid (Fe _NO) foreslået af Task Force af American Thoracic Society / European Respiratory Society (ATS / ERS) ^8.. For alle ånde prøveudtagning blev en engangs envejs in-line ventil bruges på munden port ånde sampler.

På grund af hastigheden på skærmen og den kvalitetskontrol, som sampler, var vi i stand til nøje at vurdere menneskelige påvirkninger ^9. De fleste fag, for eksempel, i første omgang hyperventilere når bedt om at trække vejret. Andre vigtige indflydelser, såsom oral pH og mundskyllemidler, temperaturer af sampler, skærm og alle tilhørende slanger og tilstanden af ​​vejrtrækning, blev derefter undersøgt, og er grundlaget for de illustrative eksperimenter nedenfor.

Endelig, og måske mest markant, det skal understreges, at flere meget erfarne grupper måler ånde ammoniak ved hjælp af helt forskellige følere og målemetoder. Disse kan have vigtige fordele og gyldighed. En komplet sammenligning er uden for rammerne af det nuværende arbejde ^10,11,12.

Protocol

1.. Udarbejdelse af instrumenter

1. Tænd for den eksterne strømforsyning til ammoniak optiske sensor platform, laser diode controller, et specialbygget styreelektronik enhed (CEU), ånde sampler, luftpumpe, og laptop.
2. Kontroller at både udstødning og ventilatorer af ammoniakken sensor opererer. BEMÆRK: Den ene er placeret i den bageste del af sensoren er den anden inden for føleren, som er let tilgængelig.
3. Sørg for den akustiske afsløring modul og nåleventil temperatur er ved 38,0 ° C ved at kontrollere den digitale display er placeret på den side af ammoniak sensor kassen. Vent cirka 35 minutter fra det tidspunkt sensoren tilvejebringes strøm til temperatur stabiliseres.
4. Sæt indløbsslangen og talerør temperatur til 55 ° C ved at klikke på et ikon navnet "ChangeT" findes på skrivebordet på den ånde sampler. Temperaturen kan derefter ændres ved at klikke på pil op eller ned, efterfulgt ved at klikke på "Opd.spiste Temp ". Klik på "Exit" for at vende tilbage til skrivebordet. Lad systemet mindst 5 min for temperatur stabiliseres. Opretholdelse af temperaturen af ​​sampler og slangen ved 55 ° C minimerer overfladen tab af ammoniak.
5. Åbn softwaren på den bærbare computer, der styrer ammoniak sensor. Kan tilgås af programmet i en mappe med navnet _"NH3 Breath Sensor Program" på skrivebordet. Inden for denne mappe, skal brugeren vælge ikonet "main LabVIEW software". Denne mappe indeholder flere programmer, men brugeren skal vælge "Mainsequence.vi" for at få adgang til den ønskede grænseflade. Vælg "run" i øverste venstre hjørne af skærmen. BEMÆRK: Dette begynder den linje låsning kalibreringssekvens. Laseren af ​​QEPAS monitoren opererer på en optimal strøm, som vælges i en automatiseret linje låsning procedure. Denne proces tager ca 25 min.
6. Opret en ny session på sampler sådan at each emne session har sin egen fil, der er gemt på en vedhæftet flash-drev. BEMÆRK: Dette udføres ved at åbne programmet "Breath Sampler" findes på skrivebordet af prøvetageren. Der er plads til at identificere sessionen korrekt. Alle data, der genereres i løbet af sessionen vil blive gemt i flash-drev under denne identifikator. Datoen for eksperimentet anvendes typisk som en del af filnavnet. Indløbet og mundstykke temperatur skal justeres før ind i programmet ånde-sampling.
7. Indsæt et nyt engangs mundstykke i indløbsrøret. Bær engangshandsker for at undgå at forurene talerør med ammoniak fra fingrene.

2.. Breath Prøvetagning

BEMÆRK: Den relevante Institutional Review Board (Ethics Board) skal godkende enhver undersøgelse, der involverer mennesker. Der er mange faktorer, der kan drastisk påvirke ånde ammoniak. Disse faktorer kan ændre ånde ammoniak målinger ved direkte enffecting systemiske ammoniak niveauer eller ved at påvirke rejse ånde metabolitter fra lungerne til instrumentering.

1. Sørg emner ankommer til laboratoriet i en fastende tilstand, efter at have indtaget ingen mad til cirka 12 timer ved ankomsten, og at de har afholdt sig fra motion om morgenen før testning.
2. Sikre ingen substans er blevet indført i munden i mindst 1 time før dataindsamling. Sørg for, at emner børste deres tænder mere end 1 time før testning.
3. Seat emnet foran ammoniak sensoren. Instruer motivet til at holde indløbsrøret, og sørg for at de ikke rører mundstykket for at undgå forurening af ammoniak.
4. Klik på "Start" på sampler interface. Har emnet udånder ind i mundstykket, så længe de kan, eller indtil operatøren anser prøven for at være tilstrækkelige. BEMÆRK: Dette er en enkelt fuld udånding varer mindst 10 sek. Mouth Trykket måles i realtid som et surrogatfor flow. En farvekodet trykmåler hjælper emnet producere og vedligeholde det ønskede udånding tryk på 10 cm vand, hvilket svarer til en udånding flow på 50 ml / sek. Dette flow blev valgt da det er blevet vedtaget af ATS / ERS for protokollen at bestemme Fe _NO. Denne udånding strømningshastighed er opnåeligt ved børn og voksne. Tilsvarende tre reproducerbare uddunstninger bør opnås der afviger mindre end 10%.
5. Klik på "Stop" på sampler-interfacet, når udåndingsprøverne er afsluttet.

3.. Breath Sample Måling

1. Når et åndedrag prøve er blevet analyseret, den laborant driver skærm har så evnen til at analysere ethvert segment af denne ånde profil. Den del af åndedrættet, der er af interesse er fase III-segment. Dette er karakteriseret ved en "plateau" i koncentrationen af ​​kuldioxid og er fundet i midten til sent i breath.
2. Vælg fase III-delen af ​​prøven ved at trække de lodrette linjer på sampler interface til at begynde, når kuldioxid plateauer og stopper lige før trykfaldet af åndedrættet. Se figur 1 for afklaring.
3. Gemme data til flash-drev ved at klikke på "Gem" på sampler touch screen interface.
4. Når ånde data er blevet gemt, kan brugeren vælge "Start" for at starte en ny åndedrag prøve.

4.. Belyser effekterne af Mouth Skyl og pH på Breath Ammoniak

1. Prøve 3 indåndinger for at etablere baseline ammoniak niveau. Sørg for at vejrtrækninger taget mindst 5 min fra hinanden.
2. Skyl munden grundigt med en 30 ml portion vand i 60 sek.
3. Saml et åndedrag prøve inden for 60 sekunder af skylning (afsnit 2). Saml udåndingsluftprøver i løbet af den næste time til at observere ændringen i ammoniak over tid. BEMÆRK: Samningseksempler tages så ofte som hvert minut, men længere intervaller anvendes typisk.
4. Skyl munden grundigt med en 30 ml portion af den grundlæggende løsning (natriumbicarbonat i vand) i 60 sek og gentag 4.2.1.
5. Skyl munden grundigt med en 30 ml prøve af sur opløsning i 60 sekunder og gentag 4.2.1.

5.. Belyser effekterne af indsugnings-og Transport Tubing Temperaturer på Breath Ammoniak

1. Sample tre vejrtrækninger i løbet af 15 min med indløbstemperaturen sat til under legemstemperatur, cirka 30 ° C.
2. Øge temperaturer indløb og transport slangen til 55 ° C hhv hjælp af en desktop ikon på touch screen interface af ånde sampler. Lad systemet mindst 5 min for at nå steady-state.
3. Prøve 3 vejrtrækninger, 5 min fra hinanden i den opvarmede indløb.

Representative Results

Emner kan forventes at producere en bred vifte af baseline ånde ammoniak niveauer. Raske personer kan begynde dagen med en breath ammoniak måling af 100-1.000 ppb. Skylning af munden med enhver væske umiddelbart ændrer mængden af ​​påviselig ånde ammoniak. Neutrale og syreholdige væsker typisk reducere mængden af ​​observerbare ammoniak med mere end halvdelen. Disse niveauer derefter vende tilbage til baseline som virkningerne af skyllevandet aftager. Virkningerne af vand synes at sprede inden for 15 minutter, mens en syre kan holde påviselig ånde ammoniak til et minimum i over 2 timer. En grundlæggende skylning, såsom natriumhydrogencarbonat, vil fordoble eller tredoble mængden af ​​påviselig ånde ammoniak før han vendte tilbage til baseline i løbet af en 20 min periode. Især betyder hydrogenperoxid synes ikke at påvirke udåndingsluft ammoniak mere end andre skylninger; Således synes det ikke, at orale bakterier bidrage væsentligt til måling ånde ammoniak.

Som bemærket enBove, sampler koblet til ammoniak sensor giver kontinuerte data en tekniker kan bruge til at vurdere kvaliteten af ​​et åndedrag prøve. Mouth pres og kuldioxid er de to egenskaber ved en udånding bruges til at validere et pust prøve. Mouth tryk tjener som et surrogat for strømmen af ​​luft fra lungerne til prøvetageren. Teknikeren skal sikre sig, at et emne er at give nok strøm af alveoleluften, som indeholder metabolit af interesse, ind i skærmen. Teknikere skal forvente en normal mund trykområde på 9 til 10.5 cm vand. Udånding skal være ret stabil i løbet af 10-20 sekunder, som manifesterer sig i standardafvigelsen i munden pres. En standard afvigelse af en kvalitet åndedrag bør være under 1 cm vand.

Kuldioxid måling er også vigtigt, da det giver tættere evaluering af processen udånding. I løbet af fase I, udånding indledt, og sammensætningen af ​​udåndet gas består af præovervejende anatomiske dødrum luft (~ 21% oxygen, 0,03% carbondioxid, 78% nitrogen og 0,5% vand), dvs. den luft, der blev indåndet under inhalation fase af tidligere vejrtrækningscyklus. I løbet af fase II, alveolær gas passerer ind i det anatomiske dødrum og blander med resterende dødrum luft med det resultat, at koncentrationen af ​​kuldioxid stiger hurtigt. Koncentrationen af ​​carbondioxid i udåndingsluften fortsætter med at stige, om end langsommere, i fase III udånding og spidsværdien (end-tidal koncentration) svarer til koncentrationen af ​​kuldioxid i venøst ​​blod. Denne gradvise stigning i kuldioxid koncentrationen under fase III skyldes sammenblanding af de alveolære gasser med den resterende del af det døde rum luft og er på grund af langsom tømning af alveolære sække. Sammensætningen af ​​åndedrag ved slutningen af ​​fase III er ca 13% oxygen, 5% carbondioxid, 78% nitrogen og 4% vand. Kuldioxid niveauerne i løbet af fase III-delen af ​​breath kan variere fra 30 til 40 mmHg. Fase III svarer til, hvor disse CO ₂ niveauer plateau (figur 1A-D).

Figur 1.. Udåndingsprøver der integrerer fase III delen af ånde-data for forskellige forhold. 1a) Et typisk ånde prøve, der integrerer fase III del af ånde data. De grønne og røde lodrette linjer indstille span hvor linjen skal analyseres. De første dele af udånding ignoreres. 1b) virkning en sur skylning har på ånde ammoniak. Omdannelsen af _NH3 til _NH4 ⁺ drastisk nedsætter mængden af påviselig ammoniak. Nedsat flow resulterer i en reduktion af alveolær ammoniak i stikprøven åndedrag som set i 1c. Den faldt flow gør not give så meget alveoleluft der skal udtages prøver. 1d) Et pust prøve, der integrerer fase I, II og III. Medtagelsen af ​​fase I og II i analysen sænker ammoniak og carbondioxid betydeligt. Dette er en ukorrekt afspejling af systemisk ammoniak. Klik her for at se en større version af dette tal.

De fleste emner er i stand til at producere en acceptabel ånde på deres første forsøg. Dog vil nogle fag kræver en gentagelse af vejret. Yderligere, som tryk og kuldioxid er optaget, kan disse også overvejes i dataanalyse.

Discussion

Fordelene ved en ikke-invasiv procedure, der kan detektere spor metabolitter i realtid er indlysende. Imidlertid har inden for ånde forskning kæmpet for at opfylde dette potentiale. Breath måling er en dynamisk proces, sårbare over for mange forstyrrende faktorer. Vores tilgang har vigtige styrker: specifikt har følsomhed og hastighed af Rice QEPAS baseret ammoniak skærm koblet til ånde sampler muligt for os at vurdere og identificere ånde indsamling faktorer germane til nøjagtig måling. Denne fremgangsmåde er meget pålidelig: for eksempel, efter nogle indledende forsøg, hver af de næsten 500 individuelle ånde datapunkter indsamlet for de seneste eksperimenter var i overensstemmelse med det forventede resultat ^9.

Indtil de forskellige faktorer udåndingsluft ammoniak påvirker er bedre forstået, er det vigtigt at give grundige og ensartede instrukser til emner forud for ankomst. I øjeblikket er vi generelt beder emnerhurtigt efter midnat til morgen indsamling, børste deres tænder på mere end 1 time før præsentationen, og undgå motion, rygning, eller fylde biler med brændstoffer. Selvom vi har evalueret forskellige fødevarer regimer aftenen før dataindsamling (f.eks fiberrig v. lav fiber), har vi ikke bevist, at kost overbevisende påvirkninger grundlæggende data om morgenen den test. Morning samlinger også minimere virkningerne af tilsyneladende daglige variationer, som synes at opstå af ukendte årsager ^13.

Der kan være andre lige så gyldige eller overlegne metoder til udåndingsluft ammoniak samling. Det er for eksempel muligt, at en standard skylning på et sæt tidspunkt før ånde samling kan resultere i anvendelige måling af oralmucosal ammoniak, som også kan afspejle systemiske niveauer. En anden vej kunne være at opgive mundhulen og måle nasal ammoniak eller begge ^10,14. Sidstnævnte fremgangsmåde kunne overflødiggøre behovet for grænsefladen sampler. Uanset, enhver metode skal nøje overveje en række tekniske faktorer er relevante for denne flygtige metabolit herunder fugtighed, temperatur, pH, flow, samt svælg biologi.

Naturligvis antagelser og overbevisninger om målemetode har afgørende indflydelse på dataanalyse. Vi mener, at pres og kuldioxid er centralt aspekt af kvalitetskontrol. Men det er ikke sikkert, for eksempel om ammoniak bør rapporteres som målt eller kuldioxid justeret, med enheder som ppb eller picomol. Som mere erfaring og selvtillid er opnået i de forskellige tekniske fejlkilder, de komplekse overvejelser etablerede i dataanalyse kommer i større fokus og vil drive en bedre forståelse af denne meget udfordrende biologi. (Figur 2: Tilfældig og ikke-tilfældige fejl måle sand Biologisk Variability Versus et biologisk Epiphenomena eller B Unormal vejrtrækning...og orale / nasale faktorer eller C og D. Udstyr ydeevne.)

Figur 2. Diagram over patienten at ånde interface til en ammoniak-skærm. A) patient der skal testes, og er også den mest uforudsigelige del af åndedrættet indsamlingen. Patienternes spise, motion og rygevaner kan have stor indvirkning på dataindsamlingen. B) Breath exhalations er variabel fra person til person, så en metode til at standardisere vejrtrækninger er vigtig. Giver en visuel cue at tilvejebringe ønskelig strømning af luft fra lungerne fungerer godt at holde exhalations uniform. C) apparat med ånde er tæt knyttet til B at ånde konsistens er en vigtig faktor i at sammenligne forsøgspersoner. Åndedrættet sampler interface giver brugeren mulighed for at se forskellige ånde prøve parametre i real-tid. D) Ammoniak-skærme kan manifestere sig med forskellige teknologier. Quartz forbedret Photoacoustic spektroskopi har mange iboende fordele menes at være ideel til alkotest. Klik her for at se en større version af dette tal.

Vigtige begrænsninger i den nuværende metode skal anerkendes. Mens sampler er relativt billig og bærbar, skærmen ammoniak, som i øjeblikket er konfigureret, er ingen af ​​delene. Som et resultat, fag har brug for at komme til vores dedikerede ånde forskning rum, som vi ikke nemt kan flytte vores udstyr til klinikken. Denne faktor, sammen med kravet om, at emnet ånde udånder en enkelt lang åndedrag, konsekvenser fag kan studeres (dvs. syge patienter med levercirrose, en vigtig målgruppe, er ofte praktiskmatisk undtaget). Endvidere fordi vi kun har én skærm, er vi begrænset antallet af emner, der realistisk set kan studeres i en given protokol. Til gengæld dette påvirker prøve størrelse og magt.

Som nævnt ovenfor blev samlingen af ​​nitrogenoxid standardiseret af en fælles indsats fra American Thoracic Society og European Respiratory Society. Der er i øjeblikket ingen tilsvarende aftale efter vejret ammoniak, selvom flere grupper gør kritiske bidrag til fremme af målingen ånde ammoniak. Da litteraturen om spor ånde metabolit måling i almindelighed og ammoniak især fortsætter med at udvikle ¹⁵ vil der sikkert være mange ændringer og forbedringer til at komme. Skærme, der er mindre, mere bærbar og billigere er kritiske for en vellykket multicenter kliniske forsøg.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rice Ammonia Monitor System	N/A	N/A	Not available for commercial purchase
Loccioni Breath Sampler	Loccioni Humancare	N/A	Single breath version
Disposable Mouth Piece	WestPrime Healthcare	G011-200	Manufacturer is AlcoQuant
Laptop	Lenovo	N/A	Old model no longer sold by manufacturer
Acid Rinse	N/A	N/A	Household acidic drink (coffee, soft drink, citrus juices, etc)
Base Rinse	N/A	N/A	Water mixed with a nonexact amount of sodium bicarbonate (Arm & Hammer Baking Soda)
Neutral Rinse	N/A	N/A	Water