Introduction
A amônia é um subproduto onipresente do metabolismo de proteínas 1. Medição de amônia, portanto, pode ajudar os médicos a avaliar várias doenças e estados de bem-estar 2. No entanto, a amônia é difícil medir com precisão, através do sangue ou de respiração, porque é muito reativo. Embora comumente usado, ensaios de sangue têm inúmeras desvantagens, incluindo preocupações básicas sobre precisão 3. Mas o grande problema com os ensaios de sangue é a realidade que eles só já recolhidas episodicamente. Isto é importante porque a fisiologia de amoníaco, bem como a glicose no sangue e muitos outros processos metabólicos, são fluidos e sempre em mudança 4. Em contraste, os ensaios de respiração são totalmente não-invasiva e rápida, permitindo assim facilmente medidas repetidas. Assim, a medição de amônia respiração é atraente porque pode dirigir uma necessidade não atendida sério de uma forma única.
Coleta de respiração, no entanto, apresenta preocupações específicas. Considerando flebotomia inerentemente leva o jeopardy de erro de várias maneiras imprevisíveis (por exemplo, tempo de torniquete, a contaminação suor, hemólise de glóbulos, atraso na medição de laboratório, etc 5), os pesquisadores de medição respiração devem lidar com um grupo diferente de novos desafios: variabilidade em respirar, a contaminação com mucosa bucal ou amoníaco bacteriana, a influência do ar e o aparelho de humidade e temperatura ambiente, etc 6. Na verdade, não é prudente subestimar a tarefa em conectar equipamentos experimentais para os seres humanos através de procedimentos experimentais para descobrir biologia desconhecida. Em parte devido a esses obstáculos, a respiração de amônia ainda não atingiu o seu potencial.
Aqui, apresentamos o nosso protocolo de medição de amônia respiração por resultados rápidos e precisos. Nosso protocolo tem força em três áreas: o monitor, o amostrador interface, e atenção para as influências humanas. O monitor foi construído por colegas da Universidade Rice, como descrito anteriormente 7. A base do measurement é um quartzo reforçada espectroscopia fotoacústica (QEPAS), técnica que emprega um piezoelétrico afinação quartzo garfo como um transdutor acústico. Efeito fotoacústico ocorre quando as ondas acústicas são produzidos pela absorção da radiação de laser modulado pelo tipo de gás de rastreio alvo. O gás traço é detectada através de uma célula acústica que é acusticamente ressonante com a freqüência modulada. Comprimento de onda de absorção de amônia foi selecionado que é livre de interferências espectrais de espécies interferentes na respiração. Para efeitos de medição de ar exalado humano, as principais funções do monitor incluem uma ampla faixa de medição (de ~ 50 partes por bilhão, ppb, pelo menos, 5.000 ppb) e velocidade (1 medições seg). A velocidade do monitor permite a resolução de tempo ao longo do ciclo de respiração.
O monitor está ligado a um amostrador respiração especialmente concebidos. O amostrador consiste de um sensor de pressão e capnógrafo. Ele exibe e arquivos em tempo realmedições de pressão na boca e dióxido de carbono, bem como as concentrações de amoníaco determinados pelo sensor. Este amostrador, por conseguinte, permite que o técnico para avaliar a qualidade de o esforço de respiração quando a respiração é recolhido. Isso nos permite ultrapassar as recomendações para analisar respiração óxido nítrico (NO Fe), proposto pela Força-Tarefa da American Thoracic Society / European Respiratory Society (ATS / ERS) 8. Para todos amostragem respiração, um one-way válvula descartável in-line foi usado na porta boca do amostrador respiração.
Por causa da velocidade do monitor e os controles de qualidade fornecido pelo sampler, fomos capazes de avaliar cuidadosamente as influências humanas 9. A maioria dos indivíduos, por exemplo, inicialmente hiperventilar quando instruído a respirar. Outras influências importantes, como o pH oral e enxaguatórios bucais, as temperaturas do sampler, do monitor e toda a tubulação associada, e modo de respiração, foram então estudadas, e são a base for os experimentos ilustrativos abaixo.
Finalmente, e talvez mais importante, deve-se enfatizar que vários grupos altamente experientes estão medindo respiração amônia usando completamente diferentes sensores e procedimentos de medição. Estes podem ter vantagens importantes e validade. A comparação completa está além do escopo do presente trabalho 10,11,12.
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Protocol
1. Preparação de Instrumentos
- Ligue a fonte de alimentação externa para a amônia plataforma sensor óptico, controlador de laser de diodo, um costume construído unidade eletrônica de controle (CEU), o amostrador ar, bomba de ar, e laptop.
- Verifique se o escape e ventiladores do sensor de amônia estão operando. NOTA: Um está localizado na parte de trás do sensor, o segundo é encontrado dentro do sensor, que é facilmente acessível.
- Assegurar o módulo de detecção acústica e a temperatura da válvula de agulha são a 38,0 ° C, verificando o visor digital localizada no lado da caixa de sensor de amónia. Aguarde cerca de 35 minutos a partir do momento do sensor é fornecido energia para que a temperatura se estabilize.
- Definir tubulação de entrada e temperatura bocal a 55 ° C, clicando no nome de um ícone "ChangeT" encontrado na área de trabalho do amostrador respiração. A temperatura pode ser alterado clicando na seta para cima ou para baixo seguida, clicando em "UPDcomeu Temp ". Clique em "Exit" para retornar à área de trabalho. Permitir que o sistema de, pelo menos, 5 minutos para a estabilização da temperatura. Mantendo a temperatura do dispositivo de amostragem e tubo de 55 ° C minimiza a perda da superfície de amoníaco.
- Abra o software no laptop que controla o sensor de amônia. O programa pode ser acessado dentro de uma pasta chamada "NH3 Programa Sensor respiração" no ambiente de trabalho. Dentro dessa pasta, o usuário deve selecionar o ícone "software LabVIEW principal". Esta pasta contém várias aplicações, mas o usuário deve selecionar "Mainsequence.vi" para acessar a interface desejada. Selecione "run" no canto superior esquerdo da tela. NOTA: Isto começa a linha de bloqueio sequência de calibração. O laser de monitor QEPAS opera sobre uma corrente ideal, o qual é seleccionado, durante um procedimento de bloqueio de linha automatizada. Este processo demora cerca de 25 min.
- Criar uma nova sessão no amostrador de tal forma que eAsessão assunto ch tem seu próprio arquivo que está salvo em um flash drive conectado. NOTA: Isto é realizado através da abertura do programa "Respiração Sampler" encontrado na área de trabalho do amostrador. Há espaço para identificar a sessão de forma adequada. Todos os dados gerados durante a sessão serão salvos na unidade flash sob este identificador. A data do experimento é normalmente usado como parte do nome do arquivo. A entrada e temperatura bocal deve ser ajustado antes de entrar no programa respiração amostragem.
- Insira um novo bocal descartável para o tubo de entrada. Usar luvas descartáveis para evitar a contaminação bocal com amônia a partir de dedos.
2. Coleta de Amostras Respiração
NOTA: O Conselho de Revisão Institucional relevante (Conselho de Ética) deve aprovar qualquer estudo que envolva seres humanos. Há muitos fatores que podem influenciar drasticamente respiração amônia. Esses fatores podem alterar as medições de amônia respiração por diretamente umffecting níveis de amônia sistêmicas ou afectando a jornada de metabólitos de respiração dos pulmões para a instrumentação.
- Certifique-se de assuntos chegar ao laboratório em jejum, depois de ter consumido nenhum alimento por cerca de 12 horas após a chegada e que eles abstiveram-se de exercício de manhã antes do teste.
- Certifique-se de nenhuma substância foi introduzida na boca durante, pelo menos, 1 hora antes da recolha de dados. Certifique-se de que os sujeitos escovar os dentes maior do que 1 hora antes do teste.
- Assente o assunto na frente do sensor de amônia. Instrua o assunto para segurar o tubo de entrada e certifique-se que não toque no bocal para evitar a contaminação de amônia.
- Clique em "Iniciar" na interface amostrador. Já o tema expirar no bocal durante o tempo que eles podem, ou até que o operador considera que a amostra seja suficiente. NOTA: Esta é uma única expiração completa, com duração mínima de 10 segundos. Boca pressão é medida em tempo real como um substitutopara a taxa de fluxo. Um medidor de pressão com código de cores ajuda a produzir assunto e manter a pressão de expiração desejado de 10 cm de água, o que representa uma taxa de fluxo de expiração de 50 ml / seg. Este fluxo foi selecionado, uma vez que tem sido adotado pela ATS / ERS para o protocolo para determinar Fe NO. Esta taxa de fluxo de expiração é realizável por crianças e adultos. Similarmente três exalações reprodutíveis devem ser obtido que diferem menos do que 10%.
- Clique em "Stop" na interface do amostrador quando a amostra de ar é concluído.
3. Medição amostra de ar
- Uma vez que uma amostra de respiração foi analisado, o técnico de laboratório operando o monitor, tem a capacidade de analisar qualquer segmento de perfil que respiração. A parte da respiração que é de interesse é o segmento de fase III. Esta caracteriza-se por um "patamar" na concentração de dióxido de carbono e é encontrada no meio de fase tardia da breath.
- Selecione a parte da fase III da amostra, arrastando as linhas verticais na interface amostrador começar quando planaltos de dióxido de carbono e parar logo antes da queda de pressão do ar. Veja a Figura 1 para o esclarecimento.
- Salve os dados para o flash drive, clicando em "Loja" na interface de tela de toque amostrador.
- Uma vez que os dados de respiração foram armazenados, o usuário pode selecionar "Iniciar" para iniciar uma nova amostra de ar.
4. Ilustrando os efeitos da Boca Rinse e pH na respiração de amônia
- Amostra 3 respirações para estabelecer o nível de amônia linha de base. Certifique-se de que a respiração são tomadas, pelo menos, 5 min afastados uns dos outros.
- Lavar bem a boca com uma alíquota de 30 ml de água por 60 segundos.
- Coletar uma amostra de ar dentro de 60 segundos da lavagem (Seção 2). Recolher amostras de respiração ao longo da hora seguinte, para observar a mudança de amoníaco ao longo do tempo. NOTA: Samples pode ser tomado tão freqüentemente quanto cada minuto, mas intervalos mais longos são normalmente utilizados.
- Enxaguar a boca meticulosamente com uma alíquota de 30 ml de solução básica (bicarbonato de sódio em água) durante 60 segundos e repita 4.2.1.
- Enxaguar a boca meticulosamente com uma alíquota de 30 ml de solução ácida por 60 segundos e repita 4.2.1.
5. Ilustrando os efeitos da entrada e Transporte tubulação Temperaturas em Respiração Amônia
- Exemplos de três ciclos ao longo de 15 min com a temperatura de entrada ajustada para abaixo da temperatura do corpo, cerca de 30 ° C.
- Aumente as temperaturas de entrada e tubulação de transporte de 55 ° C, respectivamente, usando um ícone no desktop na interface da tela de toque do amostrador respiração. Permitir que o sistema de, pelo menos, 5 minutos para atingir o estado estacionário.
- Amostra 3 respirações, 5 min à parte na entrada aquecida.
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Representative Results
Assuntos pode ser esperado para produzir uma ampla gama de níveis de amónia respiração basais. Indivíduos saudáveis podem começar o dia com uma medição de amônia de 100-1.000 ppb respiração. Lavar a boca com qualquer fluido imediatamente altera a quantidade de amônia detectável respiração. Fluidos neutros e ácidos normalmente reduzir a quantidade de amônia observáveis por mais da metade. Estes níveis então retornar à linha de base, como os efeitos da lavagem desaparece. Os efeitos da água parece dissipar-se dentro de 15 minutos, enquanto que um ácido pode manter detectável amoníaco respiração ao mínimo durante mais de 2 horas. A lavagem básica, como bicarbonato de sódio, vai dobrar ou triplicar a quantidade de amônia detectável respiração antes de retornar à linha de base durante um período de 20 min. Notavelmente, o peróxido de hidrogênio não parece afetar exalado amônia respiração mais do que outras lavagens; portanto, não parece que as bactérias orais contribuir significativamente para a medição de amoníaco respiração.
Como notadobove, o dispositivo de amostragem ligado ao sensor de amónia fornece dados contínuos um técnico pode utilizar para avaliar a qualidade de uma amostra de ar respiratório. Pressão na boca e dióxido de carbono são as duas características de uma exalação utilizado para validar uma amostra da respiração. Pressão na boca serve como um substituto para o fluxo de ar dos pulmões para o amostrador. O técnico deve ter certeza de que um sujeito está fornecendo fluxo suficiente de ar alveolar, que contém o metabólito de interesse, para o monitor. Técnicos devem esperar um intervalo de pressão boca normal de 9 a 10,5 centímetros de água. A exalação deve ser bastante estável ao longo de 10-20 seg, que se manifesta no desvio padrão da pressão na boca. Um desvio padrão de uma lufada de qualidade deve ser de menos de 1 cm de água.
Medição de dióxido de carbono também é importante, pois permite a avaliação mais perto de processo de expiração. Durante a Fase I, a exalação é iniciada e a composição do gás expirado consiste em prédominantemente anatômica espaço de ar morto (~ 21% de oxigênio, 0,03% de dióxido de carbono, 78% de nitrogênio e 0,5% de água), ou seja., o ar que se respirava durante a fase de inalação do ciclo anterior respiração. Durante a fase II, o gás alveolar passa para dentro do espaço morto anatómico e mistura com o ar residual do espaço morto, com o resultado de que a concentração de dióxido de carbono aumenta rapidamente. A concentração de dióxido de carbono no ar expirado continua a aumentar, embora mais lentamente, durante a fase III de exalação e o valor de pico (concentração final das marés) corresponde à concentração de dióxido de carbono no sangue venoso. Este aumento gradual da concentração de dióxido de carbono durante a Fase III é devido à mistura dos gases alveolares com o restante do ar do espaço morto que é devido a retardar o esvaziamento de sacos alveolares. A composição do ar no final da Fase III é de cerca de 13% de oxigénio, 5% de dióxido de carbono, 78% de azoto, e 4% de água. Os níveis de dióxido de carbono durante a porção de fase III do breath pode variar entre 30-40 mmHg. Fase III corresponde ao local onde estes dois níveis de CO planalto (Figuras 1A-D).
Figura 1. Amostras de ar expirado que integram a porção de fase III de dados fôlego para várias condições. 1a) Uma amostra típica de respiração que integra a porção de fase III dos dados de respiração. As linhas verticais verdes e vermelhas definir a extensão em que a linha está a ser analisada. As primeiras partes da exalação são ignorados. 1b) O efeito de uma lavagem ácida tem sobre respiração amônia. A conversão de NH3 em NH 4 + drasticamente reduz a quantidade de amónia detectável. Diminuição do fluxo resulta na redução de amoníaco alveolar na respiração amostrado como visto em 1c. A diminuição do fluxo faz not permitir o máximo de ar alveolar a amostrar. 1d) A amostra de ar que integra as fases I, II, e III. A inclusão das fases I e II, na análise reduz amoníaco e dióxido de carbono consideravelmente. Esta é uma reflexão imprecisa de amônia sistêmica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A maioria dos indivíduos são capazes de produzir um fôlego aceitável em sua primeira tentativa. No entanto, alguns assuntos vai exigir uma repetição da respiração. Além disso, como a pressão e dióxido de carbono são registados, estes podem também ser considerados na análise dos dados.
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Discussion
Os benefícios de um procedimento não-invasivo capaz de detectar metabólitos traço em tempo real são óbvias. No entanto, o campo da pesquisa respiração tem se esforçado para cumprir esse potencial. Medição da respiração é um processo dinâmico vulneráveis a muitos fatores de confusão. Nossa abordagem tem pontos fortes importantes: especificamente, a sensibilidade ea velocidade do Arroz QEPAS monitor de amônia baseado acoplado ao amostrador fôlego nos permitiram avaliar e identificar os fatores de recolha de respiração pertinente para uma medição precisa. Esta abordagem é muito confiável: por exemplo, depois de algumas experiências preliminares, cada um dos cerca de 500 pontos de dados individuais coletados fôlego para experimentos recentes foi consistente com os resultados esperados 9.
Até os vários fatores que afetam a respiração exalado amônia são melhor compreendidos, é importante para fornecer instruções completas e uniformes para os assuntos antes da chegada. No momento, nós geralmente pedem para assuntosrápido depois da meia-noite para a coleta de manhã, escovar os dentes maior do que 1 hora antes da sua apresentação, e evitar exercícios, fumar ou preenchendo automóveis com combustíveis de petróleo. Embora nós avaliamos vários alimentos regimes à noite antes da coleta de dados (por exemplo, fibra de alta v baixa fibra), não estabelecemos que a dieta de dados de forma convincente os impactos iniciais da manhã do teste. Coleções da manhã também minimizar o impacto de variações diurnas aparentes, que parecem ocorrer por razões desconhecidas 13.
Pode haver outros métodos igualmente válidos ou superiores para coleta de amônia respiração exalado. É possível, por exemplo, que uma lavagem normal em um ponto de tempo definido antes da coleta de respiração pode resultar na medida útil de amônia da mucosa oral, que também pode refletir níveis sistêmicos. Outro caminho pode ser a abandonar a cavidade oral e nasal medir amônia ou ambos 10,14. Esta última abordagem pode evitar a necessidade for o amostrador interface. Independentemente disso, qualquer método deve considerar uma variedade de factores técnicos relevantes para este metabolito volátil, incluindo a humidade, a temperatura, o pH, o fluxo, assim como a biologia da orofaringe.
Naturalmente, suposições e crenças sobre o método de medição tem rolamento crítico na análise de dados. Acreditamos que a pressão e dióxido de carbono são os aspectos-chave de controle de qualidade. No entanto, não é certo, por exemplo, se a amônia deve ser relatado como medida, ou dióxido de carbono ajustados, com unidades como ppb ou picomole. À medida que mais experiência e confiança são obtidos nas diversas fontes de erro técnico, as considerações complexas incumbentes na análise de dados entram em maior foco e irá impulsionar a melhor compreensão deste biologia muito desafiador. (Figura 2: erro aleatório e não-aleatório de medição verdadeira variabilidade biológica Versus A epifenómenos ou B Biological Anormal Respiração...e Oral / Fatores nasal ou C e D. Desempenho Equipment).
Figura 2. Diagrama de paciente à interface de fôlego para um monitor de amônia. A) Paciente a ser testado e também é a parte mais imprevisível do processo de coleta de respiração. Alimentação dos pacientes, exercícios e tabagismo podem ter grandes impactos na coleta de dados. B) exalações hálito são variáveis de pessoa para pessoa, por isso, um método para padronizar respirações é importante. Fornecer uma dica visual para fornecer fluxo desejável de ar dos pulmões funciona bem para manter exalações uniforme. C) aparelho de interface de respiração está intimamente relacionado com B em que a consistência respiração é um fator importante na comparação assuntos. O amostrador inte respiraçãorface permite ao usuário visualizar vários parâmetros amostrais fôlego em tempo real. D) monitores de amônia podem manifestar-se com diferentes tecnologias. Quartz reforçada espectroscopia fotoacústica tem muitos benefícios inerentes acredita ser ideal para a análise da respiração. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Limitações importantes para o presente método deve ser reconhecido. Embora o dispositivo de amostragem é relativamente barato e portátil, o monitor de amoníaco, tal como presentemente configurado, não é. Como resultado, os indivíduos precisam vir ao nosso espaço dedicado a pesquisa respiração, já que não pode mover facilmente o nosso equipamento para a clínica. Este fator, juntamente com a exigência de que a respiração do sujeito exalar um único suspiro longo e impactos que assuntos podem ser estudados (ou seja, os pacientes doentes com cirrose hepática, uma população-alvo chave, muitas vezes são práticasticamente excluído). Além disso, porque temos apenas um monitor, que são limitados no número de indivíduos que podem ser realisticamente estudados em um determinado protocolo. Por sua vez, isso afeta o tamanho da amostra e poder.
Como mencionado acima, a coleção de óxido nítrico foi padronizado pelo esforço conjunto da American Thoracic Society e European Respiratory Society. Atualmente não existe nenhum contrato equivalente para respirar amônia, embora vários grupos estão fazendo contribuições importantes para o avanço da medição amônia respiração. Como a literatura de rastreamento medição metabólito respiração em geral e amônia em particular continua a evoluir 15 certamente haverá muitas modificações e melhorias que estão por vir. Os monitores que são menores, mais portáteis e menos dispendioso são críticos para os ensaios clínicos multicêntricos de sucesso.
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Acknowledgments
Os autores reconhecem o apoio financeiro de uma National Science Foundation (NSF) conceder CEE-0540832 intitulado "Tecnologias Mid-Infrared da Saúde e do Meio Ambiente (Mirthé)"
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rice Ammonia Monitor System | N/A | N/A | Not available for commercial purchase |
| Loccioni Breath Sampler | Loccioni Humancare | N/A | Single breath version |
| Disposable Mouth Piece | WestPrime Healthcare | G011-200 | Manufacturer is AlcoQuant |
| Laptop | Lenovo | N/A | Old model no longer sold by manufacturer |
| Acid Rinse | N/A | N/A | Household acidic drink (coffee, soft drink, citrus juices, etc) |
| Base Rinse | N/A | N/A | Water mixed with a nonexact amount of sodium bicarbonate (Arm & Hammer Baking Soda) |
| Neutral Rinse | N/A | N/A | Water |
References
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