Rask og nøyaktig utåndet pust Ammoniakk Måling

Introduction

Ammoniakk er en allestedsnærværende biprodukt av protein metabolismen ^en. Ammoniakk måling kan derfor hjelpe klinikere vurdere ulike sykdommer og velvære stater ^to. Imidlertid er ammoniakk vanskelig å måle nøyaktig, via blod-eller ånde, fordi det er svært reaktiv. Selv brukte, blod analyser har mange ulemper, blant annet grunnleggende spørsmål om nøyaktighet ^tre. Men det store problemet med blodanalyser er realiteten at de bare har samlet episodisk. Dette er viktig fordi ammoniakk fysiologi, omtrent som blodglukose og mange andre metabolske prosesser, er flytende og stadig skiftende ^4.. I kontrast, pusten assays er fullstendig ikke-invasiv og hurtig, for derved lett å aktivere gjentatt tiltak. Således er pusten ammoniakk måling attraktivt fordi det kan løse et alvorlig udekket behov på en unik måte.

Breath samling, men gir unike problemer. Mens blodprøvetaking iboende bærer JeoPardy av feil på flere uforutsigbare måter (f.eks tourniquet tid, svette forurensning, blodlegemer hemolyse, forsinkelse i laboratoriemåling, etc ^5), må pusten måleforskere stri med en annen gruppe av nye utfordringer: variasjon i puste, forurensning med munnslimhinnen eller bakteriell ammoniakk, påvirkning av omgivende luft og en anordning fuktighet og temperatur, etc ^6.. Faktisk, er det uklokt å undervurdere oppgaven i å koble eksperimentelt utstyr til mennesker ved hjelp av eksperimentelle prosedyrer for å oppdage ukjente biologi. Delvis på grunn av disse hindringene, har pust ammoniakk ennå ikke oppfylt sitt potensial.

Heri presenterer vi våre pusten ammoniakk måleprotokoll for raske og nøyaktige resultater. Vår protokollen har styrke i tre områder: monitoren, grensesnittet sampler, og oppmerksomhet til de menneskelige påvirkninger. Skjermen ble bygget av kolleger ved Rice University som tidligere beskrevet ^syv. Grunnlaget for measurement er et kvarts forbedret fotoakustisk spektroskopi (QEPAS) teknikk som anvender en piezoelektrisk kvarts stemmegaffel som en akustisk transduser. Foto-akustisk effekt oppstår når akustiske bølger fremstilles ved absorpsjon av modulerte laserstråling ved måltrasen gassarter. Den sporgass blir detektert ved hjelp av en akustisk celle som er akustisk resonans til den modulerte frekvens. En absorpsjonsbølgelengde for ammoniakk er valgt som er fritt for spektral interferens fra interfererende arter i pusten. Ved anvendelsen av menneskelig utåndet pust måling, de viktigste funksjoner på skjermen inkluderer et bredt måleområde (fra ~ 50 deler per milliard, ppb til minst 5000 ppb) og hastighet (1 sek målinger). Hastigheten på monitoren muliggjør tidsoppløsningen i løpet av pustesyklusen.

Monitoren er koplet til et spesielt utformet pust sampler. Prøvetakeren består av en trykksensor og kapnografen. Den viser og arkiverer sanntidmålinger av munn trykk og karbondioksid, i tillegg til ammoniakk-konsentrasjonen bestemmes ved hjelp av føleren. Dette sampler, og derfor gjør det mulig for teknikeren å vurdere kvaliteten av puste krefter som pusten blir oppsamlet. Dette gjør oss i stand til å overstige anbefalingene for å analysere pusten nitrogenoksid (Fe _NO) foreslått av Task Force av American Thoracic Society / European Respiratory Society (ATS / ERS) ^8. For alle pust sampling, ble en engangs enveis in-line ventilen brukes på munningen port av pusten sampler.

På grunn av hastigheten på skjermen og kvalitetskontrollene levert av sampler, var vi i stand til å nøye vurdere menneskelige påvirkninger ^ni. De fleste fag, for eksempel, i utgangspunktet hyperventilere når du får beskjed om å puste. Andre viktige påvirkninger, slik som oral pH og munnskylle, temperaturer på sampler, monitor og alle tilhørende slange, og modusen for å puste, ble deretter undersøkt, og er grunnlaget for de illustrerende eksperimenter under.

Til slutt, og kanskje aller viktigst, det må understrekes at flere svært erfarne grupper måler pusten ammoniakk ved hjelp av helt ulike sensorer og måleprosedyrer. Disse kan ha viktige fordeler og validitet. En fullstendig sammenligning er utenfor rammen av dette arbeidet ^10,11,12.

Protocol

En. Utarbeidelse av Instruments

1. Slå på den eksterne strømforsyningen til ammoniakk optisk sensorplattform, laser diode-kontrolleren, en spesialbygget styreelektronikk enhet (CEU), pusten sampler, luftpumpe, og laptop.
2. Kontroller at både eksos og kjølevifter av ammoniakken sensor opererer. MERK: En er plassert på baksiden av sensoren, blir den andre innenfor føleren, som er lett tilgjengelig.
3. Sikre den akustiske deteksjonsmodulen og nåleventilen temperatur er ved 38,0 ° C ved å kontrollere den digitale skjerm som er plassert på siden av den ammoniakk sensorboks. Vent i omtrent 35 minutter fra den tid sensoren er gitt strøm for at temperaturen har stabilisert seg.
4. Sett innløpsslangen og munnstykket temperatur til 55 ° C ved å klikke på et ikon navnet "ChangeT" funnet på skrivebordet på pusten sampler. Temperaturen kan da bli endret ved å klikke på pil opp eller ned etterfulgt ved å klikke på "Oppdspiste Temp ". Klikk "Avslutt" for å gå tilbake til skrivebordet. La systemet minst 5 min etter at temperaturen har stabilisert seg. Opprettholdelse av temperaturen i sampler og rør ved 55 ° C reduserer overflate tap av ammoniakk.
5. Åpne programvaren på den bærbare datamaskinen som styrer ammoniakk sensor. Programmet kan nås innenfor en mappe som heter "NH ₃ Breath Sensor Program" på skrivebordet. Innenfor denne mappen, må brukeren velge ikonet "main LabVIEW software". Denne mappen inneholder flere programmer, men brukeren må velge "Mainsequence.vi" for å få tilgang til ønsket grensesnitt. Velg "kjør" i øvre venstre hjørne av skjermen. MERK: Dette begynner linjen låsing kalibreringssekvensen. Laseren av QEPAS monitor opererer på en optimal strøm, som velges i løpet av en automatisk linje-låsing prosedyre. Denne prosessen vil ta ca 25 min.
6. Lag en ny økt på sampler slik at each lagt sesjon har sin egen fil som er lagret på en vedlagt flash-stasjon. MERK: Dette er utført ved å åpne programmet "Breath Sampler" funnet på skrivebordet på sampler. Det er plass til å identifisere sesjonen på riktig måte. Alle data som genereres under økten blir lagret i flash-stasjonen under Denne identifikatoren. Datoen for eksperimentet er vanligvis brukt som en del av filnavnet. Innløpet og munnstykket temperatur må justeres før vi går i ånde-prøvetakingsprogram.
7. Sett inn en ny engangsmunnstykke i innløpsrøret. Bruk engangshansker for å unngå forurensing av munnstykket med ammoniakk fra fingrene.

2. Breath Prøvetaking

MERK: Det aktuelle Institutional Review Board (Etikk Board) skal godkjenne eventuell studie som involverer mennesker. Det er mange faktorer som drastisk kan påvirke pusten ammoniakk. Disse faktorene kan endre pusten ammoniakk målinger ved direkte enffecting systemiske ammoniakknivåer eller ved å påvirke reisen av pusten metabolitter fra lungene til instrumentering.

1. Sørg for fagene kommer til laboratoriet i en fastende tilstand, etter å ha konsumert ingen mat for ca 12 timer ved ankomst, og at de har avstått fra trening på morgenen før testing.
2. Sikre ingen substans er blitt innført i munnen i minst 1 time før datainnsamlingen. Sørg for at fagene pusse tennene mer enn en time før testing.
3. Sete gjenstand foran ammoniakksensor. Be lagt holde innløpsrøret, og pass på at de ikke berører munnstykket for å unngå ammoniakk forurensning.
4. Klikk "Start" på sampler-grensesnittet. Har faget puster ut inn i munnstykket for så lenge som de kan, eller til operatøren anser at prøven til å være tilstrekkelig. MERK: Dette er en enkelt full utpust som varer i minst 10 sek. Munn trykket måles i sanntid som et surrogatfor strømningsrate. En fargekodet manometer hjelper faget produsere og opprettholde den ønskede utånding trykk på 10 cm vann, noe som representerer en exhalation strømningshastighet på 50 ml / sek. Dette flow rate ble valgt siden det har blitt vedtatt av ATS / ERS for protokollen som skal bestemme Fe _NO. Dette utånding strømningshastighet er oppnåelig ved barn og voksne. Tilsvar tre reproduserbare exhalations bør innhentes som avviker med mindre enn 10%.
5. Klikk på "Stop" på sampler-grensesnittet når pusten prøven er fullført.

Tre. Breath Sample Måling

1. Når en pust prøven er analysert, har laboratorietekniker bruke skjermen da evnen til å analysere en hvilken som helst segment av at ånde-profil. Den del av pusten som er av interesse er et fase III segment. Dette er karakterisert ved et "platå" i konsentrasjonen av karbondioksyd, og er funnet i midten til sent stadium av breath.
2. Velg fase III del av prøven ved å dra de vertikale linjene på sampler-grensesnittet til å begynne når karbondioksid platåer og stopper rett før trykkfallet av pusten. Se figur 1 for avklaring.
3. Lagre dataene til flash-stasjonen ved å klikke på "Store" på sampler berøringsskjerm.
4. Når pusten data har blitt lagret, kan brukeren velge "start" for å starte en ny pust prøve.

4. Illustrerer effekten av munn skyll og pH på Breath Ammoniakk

1. Prøve 3 åndedrag for å etablere referanseammoniakknivå. Påse at pust blir tatt minst 5 min fra hverandre.
2. Skyll munnen grundig med en 30 ml porsjon av vann i 60 sek.
3. Samle en pust prøve innen 60 sek av skylle (§ 2). Samle pusteprøver i løpet av den neste time for å observere endringen i ammoniakk over tid. MERK: Samsipper kan tas så ofte som hvert minutt, men lengre intervaller er vanligvis brukt.
4. Skyll munnen grundig med en 30 ml aliquot av basisløsning (natriumbikarbonat i vann) i 60 sekunder og gjentar 4.2.1.
5. Skyll munnen grundig med en 30 ml delmengde av sur løsning for 60 sek og gjenta 4.2.1.

5. Illustrerer effekten av innløps-og transport Tubing Temperaturer på Breath Ammoniakk

1. Eksempel på tre åndedrag i løpet av 15 min med innløpstemperatur satt til under kroppstemperatur, omtrent 30 ° C.
2. Øk temperaturen i innløp og transport rør til 55 ° C henholdsvis ved hjelp av en skrivebordsikon på berøringsskjermgrensesnittet på pusten sampler. La systemet minst 5 minutter for å nå likevekt.
3. Eksempel 3 åndedrag, 5 min fra hverandre i det oppvarmede innløpet.

Representative Results

Emner kan forventes å produsere et bredt spekter av baseline pusten ammoniakknivåer. Friske personer kan starte dagen med en pust ammoniakk måling av samtidig inntar 100-1000 ppb. Skylling av munnen med en hvilken som helst fluid endrer seg umiddelbart mengden av påvisbart ånde ammoniakk. Nøytrale og sure fluider typisk redusere mengden av observer ammoniakk med mer enn halvparten. Disse nivåene deretter tilbake til baseline som virkningene av skylle slites av. Virkningene av vann synes å forsvinne i løpet av 15 min, mens en syre kan holde påvisbar ånde ammoniakk til et minimum i over 2 timer. En grunnleggende skylling, slik som natriumbikarbonat, vil doble eller tredoble mengden av påvisbart ånde ammoniakk før retur til utgangspunktet, over en 20 minutters periode. Spesielt, ikke hydrogen peroxide ikke ut til å påvirke utåndet pust ammoniakk mer enn andre skyllinger; Dermed ser det ikke ut som oral bakterier bidra betydelig til pusten ammoniakk måling.

Som nevnt enBove, sampler koblet til ammoniakk sensor gir kontinuerlige data en tekniker kan bruke for å vurdere kvaliteten på en pust prøve. Munn trykk og karbondioksyd er de to egenskapene til en utånding som brukes til å validere en pust prøve. Munntrykket fungerer som et surrogat til strømmen av luft fra lungene og inn i sampler. Teknikeren må være sikker på at et emne er å gi nok strøm av alveolære luft, som inneholder metabolitten av interesse, inn i skjermen. Teknikere bør forvente en normal munn trykkområde på 9 til 10.5 cm vann. Den utånding bør være ganske stabil i løpet av 10-20 sekunder, noe som gir seg utslag i standardavviket til munn trykk. Et standardavvik av en kvalitet pust bør være under 1 cm vann.

Karbondioksid målingen er også viktig fordi den gjør nærmere evaluering av prosessen med utpust. I løpet av fase I, er exhalation initiert og sammensetningen av utåndet gass består av predominant anatomiske dødrom luft (~ 21% oksygen, 0,03% karbon-dioksyd, 78% nitrogen og 0,5% vann) ie. den luft som ble pustet inn under innåndingsfasen av de foregående pustesyklusen. Under fase II, passerer alveolar gass inn i den anatomiske dødrom, og blander seg med gjenværende dødrom luft med det resultat at konsentrasjonen av karbondioksid øker raskt. Konsentrasjonen av karbondioksid i utåndet pust fortsetter å stige, om enn langsomt, i løpet av fase III utånding, og toppverdien (end tidal konsentrasjon) tilsvarer konsentrasjonen av karbondioksid i veneblod. Denne gradvise økning i karbondioksidkonsentrasjonen i fase III er på grunn av blanding av de alveolære gasser med resten av dødrom luft og er på grunn av langsom tømming av alveolære sekker. Sammensetningen av pusten ved slutten av fase III er omtrent 13% oksygen og 5% karbondioksyd, 78% nitrogen og 4% vann. Karbondioksidnivået i løpet av fase III del av breath kan variere 30-40 mmHg. Fase III tilsvarer hvor disse CO ₂ nivåer platå (figur 1A-D).

Figur 1. Breath prøver som integrerer fase III del av pusten data for ulike forhold. 1a) En typisk pust prøve som integrerer fase III parti av pusten data. De grønne og røde vertikale linjer angir utstrekningen i hvilken linjen er som skal analyseres. De første delene av utpust ignoreres. 1b) Effekten en syrlig skylling har på pusten ammoniakk. Omdannelsen av _3-NH i NH ₄ ⁺ drastisk reduserer mengden av påvisbart ammoniakk. Redusert strømnings resulterer i reduksjon av alveolar ammoniakk i samplet pusten som sett i 1c. Den redusert flyt gjør not tillate så mye alveolære luft å bli samplet. 1d) En pust sample som integrerer faser I, II, og III. Inkluderingen av fasene I og II i analysen senker ammoniakk og karbondioksyd betraktelig. Dette er en unøyaktig refleksjon av systemisk ammoniakk. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

De fleste fag er i stand til å produsere et akseptabelt pust på sin første prøve. Imidlertid vil enkelte fag krever en gjentakelse av pusten. Videre, som trykk og karbondioksyd blir registrert, disse kan også tas i betraktning i dataanalysen.

Discussion

Fordelene med en ikke-invasiv fremgangsmåte i stand til å detektere spor metabolitter i sanntid er åpenbare. Men, har feltet pusten forskning kjempet for å realisere dette potensialet. Breath måling er en dynamisk prosess sårbar for mange konfunderende faktorer. Vår tilnærming har viktige styrker: spesifikt, har følsomhet og hastighet av Rice QEPAS basert ammoniakk-skjerm koblet til pusten sampler gjort oss i stand til å vurdere og identifisere pusten samling faktorer germane til nøyaktig måling. Denne tilnærmingen er svært pålitelig, for eksempel etter noen foreløpige eksperimenter, hver av de nesten 500 individuelle pusten innsamlede datapunktene for siste forsøkene var i tråd med den forventede utfallet ^ni.

Frem til de forskjellige faktorer som påvirker utåndet pust ammoniakk bedre forstått, er det viktig å gi en grundig og ensartet instruksjoner til fag før ankomst. I dag, vi vanligvis spør fag åraskt etter midnatt for morgensamling, pusse tennene mer enn en time før presentasjonen, og unngå mosjon, røyking, eller fylle biler med fyringsolje. Selv om vi har evaluert ulike mat regimer kvelden før datainnsamling (f.eks, høy fiber v. lite fiber), har vi ikke fastslått at slankebevisende virkninger baseline data formiddagens av testen. Morgensamlinger også minimere virkningen av åpen dagaktive variasjoner, som synes å oppstå av ukjente grunner ^13.

Det kan være andre like gyldige eller overlegen metoder for utåndet pust ammoniakk samling. Det er mulig, for eksempel, at en standard skylling på et angitt tidspunkt forut for pust samling kan resultere i den nyttige måling av oral mucosal ammoniakk som også kan gjenspeile systemiske nivåer. En annen bane kan være å forlate munnhulen og måle nasal ammoniakk eller begge ^10,14. Denne sistnevnte tilnærmingen kunne overflødiggjør for grensesnittet sampler. Uansett, må en hvilken som helst metode for å vurdere nøye et utvalg av tekniske faktorer som er relevante for denne flyktige metabolitt inkludert fuktighet, temperatur, pH-verdi, strømning, samt oropharyngeal biologi.

Naturligvis, antagelser og oppfatninger om målemetode har avgjørende betydning for dataanalyse. Vi tror at trykk og karbondioksyd er viktig aspekt ved kvalitetskontroll. Det er imidlertid ikke sikkert, for eksempel hvorvidt ammoniakk skal rapporteres som måles, eller karbondioksid-justert, med enheter som ppb eller picomol. Som mer erfaring og tillit er oppnådd i de ulike tekniske feilkilder, de komplekse hensyn sittende i dataanalysen kommer inn større fokus og vil drive bedre forståelse av dette svært utfordrende biologi. (Figur 2: Random og Non-Random Feil Måling Ekte biologiske variasjoner Versus en biologisk Epiphenomena eller B unormal pust...og muntlig / Nese Faktorer eller C og D. Utstyr Performance.)

Figur 2. Diagram av pasienten å puste grensesnitt til en ammoniakk-skjerm. A) pasient som skal testes, og er også den uforutsigbare parti av pusten innsamlingsprosessen. Pasientenes spising, trening og røykevaner kan ha store konsekvenser for datainnsamling. B) Breath exhalations er variabel fra person til person, så en metode for å standardisere åndedrag er viktig. Å gi en visuell indikator for å gi ønskelige strømning av luft fra lungene fungerer godt for å holde exhalations ensartet. C) Breath grensesnittapparatet er nært knyttet til B ved at pust konsistens er en viktig faktor i å sammenligne forsøkspersoner. Pusten sampler interface tillater brukeren å vise ulike pusten parametre i sanntid. D) Amoniakkanalysator kan manifestere seg med ulike teknologier. Quartz forbedret fotoakustisk spektroskopi har mange iboende fordeler som antas å være ideell for pust analyse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Viktige begrensninger i dagens metode må anerkjennes. Mens sampler er relativt billig og portabel, ammoniakk-skjerm, som for tiden er konfigurert, er ingen av delene. Som et resultat, fag trenger å komme til vår dedikerte pust forskning plass, som vi ikke kan enkelt flytte vårt utstyr til klinikken. Denne faktoren, sammen med kravet om at faget pust puster en eneste lang pust, påvirker hvilke fag kan studeres (dvs. syke pasienter med levercirrhose, en viktig målgruppe i befolkningen, er ofte praksistisk ekskludert). Videre, fordi vi har kun en skjerm, er vi begrenset i antall emner som kan være realistisk studert i en gitt protokoll. I sin tur påvirker denne prøven størrelse og makt.

Som nevnt ovenfor, ble samlingen av nitrogenoksid standardisert av felles innsats av American Thoracic Society og European Respiratory Society. Det er i dag ingen tilsvarende avtale for pust ammoniakk, men flere grupper gjør kritiske bidrag til fremme av pusten ammoniakk måling. Som litteraturen på sporing pusten metabolitt måling generelt og ammoniakk spesielt fortsetter å utvikle seg ¹⁵ vil det sikkert være mange endringer og forbedringer som kommer. Skjermer som er mindre, mer portable, og rimeligere er avgjørende for vellykkede multisenter kliniske studier.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rice Ammonia Monitor System	N/A	N/A	Not available for commercial purchase
Loccioni Breath Sampler	Loccioni Humancare	N/A	Single breath version
Disposable Mouth Piece	WestPrime Healthcare	G011-200	Manufacturer is AlcoQuant
Laptop	Lenovo	N/A	Old model no longer sold by manufacturer
Acid Rinse	N/A	N/A	Household acidic drink (coffee, soft drink, citrus juices, etc)
Base Rinse	N/A	N/A	Water mixed with a nonexact amount of sodium bicarbonate (Arm & Hammer Baking Soda)
Neutral Rinse	N/A	N/A	Water